糖尿病患者脂肪间充质干细胞生物学特性及促进创面愈合的效果

doi:10.12307/2022.398

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (25): 3956-3960.doi: 10.12307/2022.398

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糖尿病患者脂肪间充质干细胞生物学特性及促进创面愈合的效果

徐曼曼1，纪哲1，欧令东1，李昂1，沈才齐2，金培生2

1徐州医科大学研究生学院，江苏省徐州市 221004；2徐州医科大学附属医院整形外科，江苏省徐州市 221002

收稿日期:2021-03-16 接受日期:2021-04-24 出版日期:2022-09-08 发布日期:2022-01-25
通讯作者: 金培生，博士，主任医师，徐州医科大学附属医院整形外科，江苏省徐州市 221002
作者简介:徐曼曼，女，1992年生，河南省商丘市人，汉族，2021年徐州医科大学毕业，硕士，医师，主要从事脂肪干细胞的基础研究及临床应用研究。
基金资助:
江苏省自然科学基金面上项目(BK20201155)，项目参与人：金培生；江苏省普通高校研究生科研创新计划(KYCX20-2456)，项目负责人：纪哲

Biological characteristics of adipose-derived mesenchymal stem cells in diabetic patients and their effect on promoting wound healing

Xu Manman1, Ji Zhe1, Ou Lingdong1, Li Ang1, Shen Caiqi2, Jin Peisheng2

1Graduate School, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; 2Department of Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China

Received:2021-03-16 Accepted:2021-04-24 Online:2022-09-08 Published:2022-01-25
Contact: Jin Peisheng, MD, Chief physician, Department of Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
About author:Xu Manman, Master, Physician, Graduate School, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China
Supported by:
the General Program of Natural Science Foundation of Jiangsu, No. BK20201155 (to JPS); General University Graduate Research and Innovation Program of Jiangsu Province, No. KYCX20-2456 (to JZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脂肪间充质干细胞：2001年，Zuk等在脂肪组织中分离出一种具有多向分化潜能的干细胞，是非造血干细胞的成体干细胞，具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)或非间充质系列细胞分化的潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能，被应用于增殖、分化、移植和修复等研究。
糖尿病难愈性创面：长期高糖环境致使糖尿病患者创面难愈合或延迟愈合，虽然难愈性慢性创面不会立即威胁生命，但因长达数月甚至数年、数十年的经久不愈，严重影响患者原发病康复和生活质量，一旦感染扩散，可导致脓毒症等并发症，危及患者生命。

背景：针对糖尿病患者脂肪间充质干细胞活性不足的机制进行干预，是有效促进糖尿病创面愈合的重要前提。
目的：观察糖尿病患者来源脂肪间充质干细胞的生物学特性及促进糖尿病创面愈合的效果。
方法：选用相同年龄、性别的正常人与糖尿病患者腹部脂肪获取脂肪间充质干细胞，采用流式细胞术、细胞划痕实验分析两组细胞凋亡、迁移情况，ELISA检测两组细胞培养上清中肝细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子水平。制备糖尿病裸鼠创面模型，以皮内注射的方式将不同来源脂肪间充质干细胞混悬液移植到糖尿病裸鼠创面皮肤边缘，移植后0，12，24 h通过LB983活体成像系统检测细胞存活情况，移植后7，14 d观察裸鼠背部愈合情况。
结果与结论：①与正常组比较，糖尿病组细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，24 h迁移距离显著减小(P < 0.05)；肝细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子分泌水平显著降低(P < 0.05)；②移植后24 h观察到糖尿病来源脂肪间充质干细胞注射组活细胞数量较正常来源脂肪间充质干细胞注射组显著减少(P < 0.05)，14 d后正常来源脂肪间充质干细胞注射组裸鼠背部皮肤愈合情况优于糖尿病来源脂肪间充质干细胞注射组；③结果表明，糖尿病患者来源脂肪间充质干细胞的生物学活性下降，促进创面愈合效果较差。

https://orcid.org/0000-0002-2239-0156 (金培生)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪间充质干细胞, 2型糖尿病, 凋亡, 迁移, 创面, 愈合

Abstract: BACKGROUND: Effective intervention for the mechanism of insufficient cell activity of adipose-derived mesenchymal stem cells in diabetic patients is an important prerequisite for effectively promoting the healing of diabetic wounds.
OBJECTIVE: To observe the biological characteristics of adipose-derived mesenchymal stem cells from diabetic patients and the effect of promoting wound healing.
METHODS: Adipose-derived mesenchymal stem cells were obtained from the abdominal fat of normal people and diabetic patients of the same age and sex. Flow cytometry and cell scratch experiment were used to analyze the apoptosis and migration of the two groups of cells. The levels of hepatocyte growth factor, basic fibroblast growth factor, and vascular endothelial growth factor were detected by ELISA in the two groups. A diabetic nude mouse wound model was prepared; adipose-derived mesenchymal stem cell suspensions from different sources were intradermally injected into the edge of the diabetic nude mouse wound. Cell survival was detected with the LB983 in vivo imaging system at 0, 12, and 24 hours after transplantation. The back healing of nude mice was observed at 7 and 14 days after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the normal group, the cell apoptosis rate in the diabetes group was significantly increased (P < 0.05); the migration distance at 24 hours was significantly reduced (P < 0.05); the secretion levels of cytokines hepatocyte growth factor, fibroblast growth factor β, and vascular endothelial growth factor were significantly reduced (P < 0.05). (2) At 24 hours after cell transplantation, the number of living cells in the diabetic group was significantly reduced compared with the normal group (P < 0.05). After 14 days, the back skin healing of the nude mice in the normal group was better than that in the diabetic group. (3) The results showed that the biological activity of adipose-derived mesenchymal stem cells from diabetic patients decreased, and the effect of promoting wound healing was poor.

Key words: stem cells, adipose-derived mesenchymal stem cells, type 2 diabetes, apoptosis, migration, wound surface, healing

中图分类号:

徐曼曼, 纪哲, 欧令东, 李昂, 沈才齐, 金培生. 糖尿病患者脂肪间充质干细胞生物学特性及促进创面愈合的效果[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3956-3960.

Xu Manman, Ji Zhe, Ou Lingdong, Li Ang, Shen Caiqi, Jin Peisheng. Biological characteristics of adipose-derived mesenchymal stem cells in diabetic patients and their effect on promoting wound healing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(25): 3956-3960.

图/表（结果） 8

2.1 脂肪间充质干细胞的形态学、诱导分化和表面标记鉴定结果将原代脂肪间充质干细胞种植于培养皿中，生长融合至80%传代，传代后细胞形态均匀一致，呈长梭形；糖尿病组细胞生长较正常组明显减慢，两组细胞形态未见明显差异。第3代生长良好的脂肪间充质干细胞分别进行成脂诱导和成骨诱导，成脂诱导2周后进行油红O染色，显微镜下观察到细胞内存在大小不一的红色脂滴，成骨诱导3周后进行茜素红S染色，显微镜下观察可见明显的红色钙结节沉积，见图1。

流式细胞仪检测第3代脂肪间充质干细胞的6种不同细胞表面标记物：CD90(99.7%)、CD105(98.3%)、CD44(93.7%)呈阳性，CD31(0.66%)、CD106(0.51%)、CD34(0.14%)呈阴性，符合脂肪间充质干细胞免疫表型的特征，见图2。

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡情况对不同来源的脂肪间充质干细胞用含晚期糖基化终末产物的DMEM完全培养基培养24 h后，流式细胞术检测细胞凋亡情况，见图3。正常组细胞凋亡率为(9.67±1.58)%，糖尿病组细胞凋亡率为(26.85±2.37)%，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 细胞划痕实验结果培养24 h后正常组脂肪间充质干细胞的迁移距离明显高于糖尿病组(P < 0.05)，见图4。

2.4 肝细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子水平 ELISA检测两组细胞上清液中碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子和肝细胞生长因子水平，结果显示：糖尿病组的细胞分泌功能明显低于正常组(P < 0.05)，见图5。

2.5 活体成像仪检测移植后细胞存活情况将两种脂肪间充质干细胞用CM-Dil标记，阳性标记率98%，移植于糖尿病小鼠创面，0，12，24 h观察结果显示：糖尿病来源脂肪间充质干细胞注射组存活细胞逐渐减少，局部仅存有极少量的活性细胞，细胞数量低于正常来源脂肪间充质干细胞注射组(P < 0.05)，见图6。

2.6 裸鼠背部创面愈合情况正常来源脂肪间充质干细胞注射组7，14 d裸鼠背部创面愈合情况优于糖尿病来源脂肪间充质干细胞注射组，见图7。

2.7 生物相容性实验采用无毛裸鼠，因其先天性胸腺缺陷，无免疫排斥反应，无毛便于观察，适应于后期脂肪间充质干细胞移植，将人体脂肪间充质干细胞植入裸鼠背部并无免疫排斥反应，对裸鼠无毒害作用。

参考文献

[1] AHMED AS, ANTONSEN EL. Immune and vascular dysfunction in diabetic wound healing. J Wound Care. 2016;25(Sup7):S35-S46.
[2] HINTZE G. Diabetes complications. Dtsch Med Wochenschr. 2020;145(22):1585.
[3] JIANG Y, HUANG S, FU X, et al. Epidemiology of chronic cutaneous wounds in China. Wound Repair Regen. 2011;19(2):181-188.
[4] OKONKWO UA, DIPIETRO LA. Diabetes and Wound Angiogenesis. Int J Mol Sci. 2017;18(7):1419.
[5] BREM H, TOMIC-CANIC M. Cellular and molecular basis of wound healing in diabetes. J Clin Invest. 2007;117(5):1219-1222.
[6] ZUK PA, ZHU M, MIZUNO H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001;7(2):211-228.
[7] ZOGRAFOU A, PAPADOPOULOS O, TSIGRIS C, et al. Autologous transplantation of adipose-derived stem cells enhances skin graft survival and wound healing in diabetic rats. Ann Plast Surg. 2013;71(2):225-232.
[8] YU S, CHENG Y, ZHANG L, et al. Treatment with adipose tissue-derived mesenchymal stem cells exerts anti-diabetic effects, improves long-term complications, and attenuates inflammation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):333-342.
[9] BUCHADE S, DESAI S, BHONDE R, et al. Stem Cells: A Golden Therapy for Diabetic Wounds. Curr Diabetes Rev. 2021;17(2):156-160.
[10] GORECKA J, GAO X, FEREYDOONI A, et al. Induced pluripotent stem cell-derived smooth muscle cells increase angiogenesis and accelerate diabetic wound healing. Regen Med. 2020;15(2):1277-1293.
[11] SUN TJ, TAO R, HAN YQ, et al. Therapeutic potential of umbilical cord mesenchymal stem cells with Wnt/β-catenin signaling pathway pre-activated for the treatment of diabetic wounds. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2014;18(17):2460-2464.
[12] VEMURI MC, CHASE LG, RAO MS. Mesenchymal stem cell assays and applications. Methods Mol Biol. 2011;698:3-8.
[13] LI Y, WANG L, ZHANG M, et al. Advanced glycation end products inhibit the osteogenic differentiation potential of adipose-derived stem cells by modulating Wnt/β-catenin signalling pathway via DNA methylation. Cell Prolif. 2020;53(6): e12834.
[14] YIN Y, CHEN F, LI J, et al. AURKA Enhances Autophagy of Adipose Derived Stem Cells to Promote Diabetic Wound Repair via Targeting FOXO3a. J Invest Dermatol. 2020;140(8):1639-1649.e4.
[15] STAFEEV I, PODKUYCHENKO N, MICHURINA S, et al. Low proliferative potential of adipose-derived stromal cells associates with hypertrophy and inflammation in subcutaneous and omental adipose tissue of patients with type 2 diabetes mellitus. J Diabetes Complications. 2019;33(2):148-159.
[16] TRINH NT, YAMASHITA T, OHNEDA K, et al. Increased Expression of EGR-1 in Diabetic Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Reduces Their Wound Healing Capacity. Stem Cells Dev. 2016;25(10):760-773.
[17] 董叫云,弓家弘,嵇晓芸,等.异体糖尿病大鼠来源脂肪干细胞移植治疗糖尿病大鼠创面的初步评价及其机制探讨[J].中华烧伤杂志,2019,35(9):645-654.
[18] SUN S, WANG C, RAN X. Research progress on role of microRNA in healing of diabetic wound. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2014;28(11):1431-1434.
[19] AN Y, LIN S, TAN X, et al. Exosomes from adipose‐derived stem cells and application to skin wound healing. Cell Proliferation. 2021;54(3):303-308.
[20] MOHANTY C, PRADHAN J. A human epidermal growth factor-curcumin bandage bioconjugate loaded with mesenchymal stem cell for in vivo diabetic wound healing. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;111:110751.
[21] BAI Q, HAN K, DONG K, et al. Potential Applications of Nanomaterials and Technology for Diabetic Wound Healing. Int J Nanomedicine. 2020;15:9717-9743.
[22] AKINGBOYE AA, GIDDINS S, GAMSTON P, et al. Application of autologous derived-platelet rich plasma gel in the treatment of chronic wound ulcer: diabetic foot ulcer. J Extra Corpor Technol. 2010;42(1):20-29.
[23] WU YY, JIAO YP, XIAO LL, et al. Experimental Study on Effects of Adipose-Derived Stem Cell-Seeded Silk Fibroin Chitosan Film on Wound Healing of a Diabetic Rat Model. Ann Plast Surg. 2018;80(5):572-580.
[24] YAO YZ, DENG CL, WANG B. Advances in the research of influence of diabetes in biological function of adipose-derived stem cells. Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2018;34(9):653-656.
[25] 王哲,张殿宝,刘晓玉,等.正常与糖尿病小鼠脂肪间充质干细胞移植促进皮肤创伤愈合的比较[J].解剖科学进展,2014,20(5):420-424.
[26] CHO H, BLATCHLEY MR, DUH EJ, et al. Acellular and cellular approaches to improve diabetic wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 2019;146:267-288.
[27] LAMERS ML, ALMEIDA ME, VICENTE-MANZANARES M, et al. High glucose-mediated oxidative stress impairs cell migration. PLoS One. 2011;6(8):e22865.
[28] GADELKARIM M, ABUSHOUK AI, GHANEM E, et al. Adipose-derived stem cells: Effectiveness and advances in delivery in diabetic wound healing. Biomed Pharmacother. 2018;107:625-633.
[29] CAO Y, GANG X, SUN C, et al. Mesenchymal Stem Cells Improve Healing of Diabetic Foot Ulcer. J Diabetes Res. 2017; 17(9):328-347.
[30] JIN J, SHI Y, GONG J, et al. Exosome secreted from adipose-derived stem cells attenuates diabetic nephropathy by promoting autophagy flux and inhibiting apoptosis in podocyte. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):95-101.

引言

有关糖尿病患者伤口愈合慢、创面迁延不愈等问题是临床研究的热点与难点。糖尿病患者因长期代谢紊乱造成机体免疫失调、炎细胞趋化反应降低、细胞功能不全和活性下降，是造成创面延迟愈合或不愈合的主要原因[1-5]。2001年，ZUK等[6]在脂肪组织中分离出一种具有多向分化潜能的干细胞，称为脂肪来源干细胞，因其来源丰富、获取容易、可体外扩增、无自体免疫排斥反应、较少涉及伦理等优点成为目前最具有研究前景的干细胞。对慢性糖尿病患者的治疗研究中，将混合了脂肪间充质干细胞的皮肤组织移植于糖尿病溃疡表面，观察2周后创面有新生血管成分及皮肤组织生成[7-8]。目前，间充质干细胞逐渐成为组织再生和损伤修复的治疗选择[9-12]。
糖尿病患者体内组织和细胞长期处于高糖环境，局部代谢有害产物堆积，造成内皮细胞的代谢和功能异常，引起细胞损伤和凋亡，使局部微循环功能受损，最终创面延迟愈合或不愈合[13]。研究发现，糖尿病小鼠脂肪间充质干细胞的增殖、分化、迁移及分泌能力均低于正常小鼠脂肪间充质干细胞[14-16]。该实验观察比较正常人来源与糖尿病患者来源脂肪间充质干细胞在凋亡、迁移能力等方面的差异，检测不同来源脂肪间充质干细胞分泌碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子和肝细胞生长因子的能力，探讨不同来源脂肪间充质干细胞对于糖尿病小鼠创面愈合的影响，为临床脂肪间充质干细胞移植提供新的理论依据和基础研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验，两独立样本比较采用t检验，重复测量资料组间比较采用重复测量方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年9月至2020年9月在徐州医科大学附属医院整形美容中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选用SPF级健康雄性4周龄BALB/c裸鼠12只，体质量(20±2) g，购于江苏集萃药康生物科技有限公司，动物合格证编号：202004327。适应性饲养1周，给予饲料及灭菌水自由喂养。
1.3.2 脂肪标本选取相同年龄、性别的正常人及糖尿病患者腹部脂肪，标本来源于徐州医科大学附属医院，收集脂肪及制备脂肪间充质干细胞的过程均向患者说明，征得患者知情同意并签署知情同意书，经徐州医科大学附属医院伦理委员会批准。正常人入组标准：全身一般情况良好，无系统性疾病，无传染性疾病史，无吸烟、嗜酒史。糖尿病患者入组标准：已确诊2型糖尿病5年及以上，空腹血糖> 6.1 mmol/L，长期服用降糖药物，无其他系统疾病史，无吸烟、嗜酒史等。
1.3.3 实验试剂 DMEM高糖培养基(美国Invitrogen公司)；胎牛血清(澳洲Gibco公司)；Ⅰ型胶原酶(美国Sigma-Aldrich公司)；青霉素-链霉素(上海碧云天生物技术有限公司)；磷酸盐缓冲液(南京凯基生物科技公司)；0.25%胰酶-EDTA消化液(上海碧云天生物技术有限公司)；晚期糖基化终末产物(美国BioVision公司)；油红O染色液(北京索莱宝科技有限公司)；钙盐染色液(北京索莱宝科技有限公司)；CD90-FITC抗体、CD31-FITC抗体、CD34-PE抗体、CD105-APC抗体、CD44-PE抗体、CD106-APC抗体(美国BD公司)；ANNEXIN V-APC/PI细胞凋亡试剂盒(南京建成生物工程研究所)；ELISA试剂盒(美国Abcam公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 脂肪间充质干细胞的获取、分离、培养、鉴定获取正常人及糖尿病患者腹部脂肪各20 mL，在无菌操作原则下放入50 mL离心管内，加入0.1%Ⅰ型胶原酶混合液20 mL，置于37 ℃水平摇床中，每10 min摇匀1次，消化30 min，然后1 200×g/min离心5 min，取下层沉淀，加入5 mL DMEM 完全培养基重悬，用100 μm细胞筛过滤，滤液以1 200×g离心5 min，加入2 mL完全培养基重悬，吹打均匀，移入6 cm细胞培养皿，标记为正常组和糖尿病组，置于37 ℃、体积分数为5%CO2孵育箱中培养36-48 h，弃培养基，PBS冲洗，换培养液，此后每两三天更换1次培养基，待细胞长至接近80%融合状态时，用0.25%胰酶按1∶3比例消化、传代。
将第3代脂肪间充质干细胞按照2×105/孔接种于6孔板，胰酶消化细胞后离心，转移至1.5 mL EP管，分别加入CD31-FITC抗体5 μL，CD34-PE抗体5 μL，CD90-FITC抗体20 μL，CD105-APC抗体5 μL，CD44-PE抗体20 μL，CD106-APC抗体5 μL，避光孵育45 min，1 200×g离心5 min，弃上清，加入400 μL PBS重悬，转移至流式管，流式细胞仪检测分析。
将第3代脂肪间充质干细胞按照1×104/孔接种于6孔板，细胞达到60%融合时，更换为成脂诱导培养基(200 μmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+10 mg/L胰岛素+1 μmol/L地塞米松)2 mL，每两三天换液1次，诱导2周后弃去培养基，PBS洗涤，加入40 g/L多聚甲醛室温固定1 h，使用0.5%油红O室温下染色1 h，加入体积分数为70%乙醇分化，倒置相差显微镜拍照分析。

将第3代脂肪间充质干细胞按照1×104/孔接种于6孔板，细胞达到60%融合时，更换为成骨分化诱导培养基(0.1 μmol/L地塞米松+10 mmol/L β-磷酸甘油+50 μmol/L抗坏血酸)2 mL，每三四天换液1次，诱导21 d后弃去培养基，PBS洗涤，加入40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，钙盐染色液室温染色2 h，倒置相差显微镜拍照分析。

1.4.2 细胞凋亡检测将收集的正常组和糖尿病组脂肪间充质干细胞以5×105/孔密度接种于6孔板，加入含100 mg/L晚期糖基化终末产物的DMEM完全培养基中培养24 h，收集各组细胞培养上清于流式管，2 000×g/min离心5 min，PBS洗涤沉淀，再次离心混匀，每管收集1×105个细胞，加入ANNEXIN V-APC/PI凋亡检测试剂盒中的binding buffer孵育5 min，再向管中加入2 μL ANNEXIN V-APC孵育5 min，再加入2 μL PI溶液孵育 5 min，最后每管加入PBS溶液至500 μL，流式细胞仪上机检测，细胞计数分析细胞凋亡率。
1.4.3 细胞划痕实验将收集的正常组和糖尿病组脂肪间充质干细胞以1×106/孔密度接种于6孔板，用含100 mg/L晚期糖基化终末产物的DMEM完全培养基培养24 h后换成无血清培养基饥饿2 h，用100 μL微量枪头垂直于6孔板底划痕，预热PBS洗细胞3次，去除划下细胞，加入含100 mg/L晚期糖基化终末产物的DMEM完全培养基，放入37 ℃、体积分数为5%CO2孵育箱培养，每孔随机选取3个不同区域，分别于0，24 h取样，倒置荧光显微镜下观察，找到标记处，保证在同一位置测量细胞间的距离，随机测量3次取平均值，迁移距离为两个时间点测量值的差值，细胞迁移距离越大，表示迁移能力越强。
1.4.4 ELISA检测碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子和肝细胞生长因子水平选取第3代正常组和糖尿病组脂肪间充质干细胞以(3-5)×105/孔密度接种于6孔板，用含100 mg/L晚期糖基化终末产物的DMEM完全培养基培养至细胞融合达80%，经胰酶消化收集上清，按照ELISA试剂盒说明书严格进行操作，酶标仪检测450 nm处的吸光度值，根据标准曲线分别计算样品碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子和肝细胞生长因子水平，重复测定3次，取平均值。
1.4.5 糖尿病动物模型制备 BALB/c裸鼠12只随机分为正常来源脂肪间充质干细胞注射组和糖尿病来源脂肪间充质干细胞注射组，每组6只，在动物房常规适应饲养1周，造模前禁食12 h，称质量，以150 mg/kg剂量腹腔注射2%链脲佐菌素，14 d后通过鼠尾静脉采血测血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L为造模成功。造模成功后，麻醉BALB/c裸鼠，背部皮肤消毒，制备全层皮肤1.0 cm×1.0 cm大小创面，将不同来源的脂肪间充质干细胞用CM-Dil标记处理，沿创面找6个点皮内注射方式打入两组小鼠创面皮肤(细胞浓度为1×1010 L-1，每点注射0.1-0.2 mL)，细胞注射后0，12，24 h通过LB983活体成像系统检测细胞存活情况，细胞注射后7，14 d观察裸鼠背部愈合情况。
1.5 主要观察指标 ①正常组和糖尿病组脂肪间充质干细胞凋亡率、迁移距离以及细胞因子分泌水平；②正常来源和糖尿病来源脂肪间充质干细胞注入糖尿病小鼠皮肤创面后的细胞存活率以及裸鼠背部愈合情况。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，计量资料若服从正态分布，则以x±s表示；两独立样本比较采用t检验，重复测量资料组间比较采用重复测量方差分析。检验水准α为0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

研究发现，脂肪间充质干细胞不仅可以体外诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、心肌细胞、角质形成细胞，还可促进多种细胞生长因子的分泌，包括血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子、血小板源性生长因子等[17-19]，在糖尿病大鼠创面愈合治疗中其分泌的生长因子可通过调节microRNA，影响蛋白质转录，调节炎症反应和抗氧化应激等，加速组织创面的愈合[20-22] ，但是脂肪间充质干细胞的活性也受年龄、炎症反应、高糖环境等因素的影响而导致其生物学特性改变。研究发现，糖尿病模型鼠的脂肪间充质干细胞增殖能力减弱，细胞的分泌能力也比正常小鼠来源脂肪间充质干细胞显著降低[23-25]。
实验选用相同年龄、性别的正常人与糖尿病患者腹部脂肪获取脂肪间充质干细胞，发现糖尿病组较正常组细胞凋亡增加，细胞迁移能力降低，细胞因子分泌水平显著下降，将不同来源脂肪间充质干细胞移植于糖尿病鼠创面，发现糖尿病来源脂肪间充质干细胞注射组荧光标记活细胞数量和创面愈合情况都较正常来源脂肪间充质干细胞注射组差。脂肪间充质干细胞通过自身增殖、分化、迁移和自分泌、旁分泌多种生长因子完成对组织损伤的修复[26]，但结合实验结果发现糖尿病来源脂肪间充质干细胞的治疗效果较差。因此，针对糖尿病患者脂肪间充质干细胞凋亡增加、细胞活性不足的机制进行针对性干预，是有效促进糖尿病创面愈合的重要前提。
脂肪来源干细胞作为糖尿病伤口愈合的辅助治疗，在临床中已研究多年，脂肪间充质干细胞通过调节炎症反应促进上皮血管形成和胶原排列，促进伤口愈合，为糖尿病难愈性创面提供一种可行的治疗方法[27-30]。糖尿病患者由于自体环境的改变，影响了自身脂肪间充质干细胞的生物活性及功能，导致创面愈合效果低于正常人，自体脂肪干细胞移植治疗或许不是最佳治疗方案，对于糖尿病患者创面愈合移植物来源以及移植量的选择成为下一步需要解决的问题，相信随着越来越多的研究，会找到一种更为有效的减少细胞凋亡和提高细胞存活率的方法，为今后的治疗方案提供更有效的途径。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

糖尿病患者脂肪间充质干细胞生物学特性及促进创面愈合的效果

Biological characteristics of adipose-derived mesenchymal stem cells in diabetic patients and their effect on promoting wound healing

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[1]	李睿, 史文, 杨士彩, 吕林蔚, 张春秋. 夹板外固定与散巴布剂对桡骨骨折模型兔骨愈合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1329-1333.
[2]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[3]	陈祥和, 刘波, 杨康, 陆鹏程, 余慧琳. 跑台运动改善自发性2型糖尿病模型小鼠心肌纤维化中的作用途径[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1210-1215.
[4]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[5]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[6]	吴冰霜, 汪志, 唐懿, 唐晓俞, 李棋. 前交叉韧带重建：从腱骨止点到腱骨愈合的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1293-1298.
[7]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[8]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[9]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[10]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[11]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[12]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[13]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[14]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.
[15]	熊挺淋, 应梦慧, 张丽莎, 张晓刚, 杨燕. 诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1063-1067.