骨关节炎滑膜成纤维细胞内含NOD样受体家族Pyrin域蛋白3启动子的组蛋白修饰

doi:10.12307/2022.596

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (15): 2387-2393.doi: 10.12307/2022.596

• 骨科植入物相关基础实验 Basic experiments of orthopedic implant • 上一篇下一篇

骨关节炎滑膜成纤维细胞内含NOD样受体家族Pyrin域蛋白3启动子的组蛋白修饰

王健，顾三军，刘宇，赵凯，李海峰

苏州大学附属无锡九院/无锡市第九人民医院/无锡市骨科医院关节外科，江苏省无锡市 214000

收稿日期:2021-06-02 修回日期:2021-06-04 接受日期:2021-07-24 出版日期:2022-05-28 发布日期:2022-01-06
通讯作者: 李海峰，副主任医师，苏州大学附属无锡九院/无锡市第九人民医院/无锡市骨科医院关节外科，江苏省无锡市 214000
作者简介:王健，男，1986年生，黑龙江省双鸭山市人，汉族，2016年哈尔滨医科大学毕业，硕士，目前主要从事骨关节炎相关研究。
基金资助:
无锡市科技局项目(N20202041)，项目负责人：刘宇

Levels of histone modification in promoter of NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3 in synovial fibroblasts of osteoarthritis

Wang Jian, Gu Sanjun, Liu Yu, Zhao Kai, Li Haifeng

Department of Joint Surgery, Wuxi Ninth Hospital Affiliated to Soochow University/Wuxi Ninth People’s Hospital/Wuxi Orthopedic Hospital, Wuxi 214000, Jiangsu Province, China

Received:2021-06-02 Revised:2021-06-04 Accepted:2021-07-24 Online:2022-05-28 Published:2022-01-06
Contact: Li Haifeng, Associate chief physician, Department of Joint Surgery, Wuxi Ninth Hospital Affiliated to Soochow University/Wuxi Ninth People’s Hospital/Wuxi Orthopedic Hospital, Wuxi 214000, Jiangsu Province, China
About author:Wang Jian, Master, Department of Joint Surgery, Wuxi Ninth Hospital Affiliated to Soochow University/Wuxi Ninth People’s Hospital/Wuxi Orthopedic Hospital, Wuxi 214000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Project of Wuxi Municipal Science and Technology Department, No. N20202041 (to LY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
含NOD样受体家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)：是炎症小体的关键成员之一，可招募Caspase招募域适配器和半胱天冬氨酸蛋白酶1蛋白，增加炎症因子的释放。
组蛋白修饰：组蛋白在不同的反式作用因子调控下发生在不同氨基酸残基的磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等修饰，可以调控染色质的松散程度，调控基因转录表达。

背景：1，25(OH)2D3缺乏会加剧骨关节炎。前期研究显示，1，25(OH)2D3调控关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡，但是其对滑膜成纤维细胞中炎症小体信号通路的调控作用尚不明确。
目的：明确含NOD样受体家族Pyrin域蛋白3(pyrin domain containing protein 3，NLRP3)通路分子在滑膜成纤维细胞中的表达水平，探讨1，25(OH)2D3调控NLRP3信号通路的作用及具体机制。
方法：通过对临床收集的关节炎和非关节炎患者滑膜组织进行原代细胞培养，检测NLRP3、Caspase招募域和半胱天冬氨酸蛋白酶1等分子的蛋白及mRNA表达水平，体外1，25(OH)2D3刺激原代细胞24 h后，检测上述指标的蛋白表达水平，并通过染色质免疫共沉淀技术检测NLRP3启动子区域的H3K4me3、H2AK119Ub、H3K27me3等组蛋白修饰水平。利用小干扰技术敲低细胞内维生素D受体的表达水平，体外1，25(OH)2D3刺激原代细胞24 h后，检测NLRP3、半胱天冬氨酸蛋白酶招募域和半胱天冬氨酸蛋白酶1等分子的蛋白表达水平。
结果与结论：①NLRP3信号通路相关分子(NLRP3、半胱天冬氨酸蛋白酶招募域和半胱天冬氨酸蛋白酶1)在关节炎滑膜细胞中过表达，NLRP3在骨关节炎患者滑膜成纤维细胞内转录水平明显较健康人组增高，差异有显著性意义(P < 0.05)；②与对照组相比，体外1，25(OH)2D3可以明显抑制关节炎患者滑膜细胞中NLRP3转录表达及NLRP3信号通路活化，差异有显著性意义(P < 0.05)；③敲低维生素D受体可减弱1，25(OH)2D3对NLRP3转录的抑制作用，并减弱其抑制NLRP3信号通路活化的作用，提示1，25(OH)2D3对NLRP3的作用主要依赖于维生素D受体；④1，25(OH)2D3抑制NLRP3转录表达主要是通过提高NLRP3启动子区域H3K27me3和H2AK119Ub水平，抑制H3K4me3水平。
缩略语：含NOD样受体家族Pyrin域蛋白3：pyrin domain containing protein 3，NLRP3；半胱天冬氨酸蛋白酶1：cysteine aspartic acid specific protease 1，Caspase-1；NOD样受体：nucleotide oligomerization domain-like receptor，NLR

https://orcid.org/0000-0003-1193-3386 (王健)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 骨关节炎, 滑膜成纤维细胞, 炎症, 1, 25(OH)2D3, NLRP3, 维生素D受体, 组蛋白修饰

Abstract: BACKGROUND: 1,25(OH)2D3 deficiency can exacerbate osteoarthritis. Previous studies have shown that 1,25(OH)2D3 regulates the proliferation and apoptosis of synovial fibroblasts in arthritis, but has unclear effect on the regulation of inflammasome pathway in synovial fibroblasts.
OBJECTIVE: To determine the expression level of NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3 (NLRP3) inflammasome pathway in osteoarthritic synovial fibroblasts and to explore the effect of 1,25(OH)2D3 on regulating NLRP3 inflammasome pathway and its specific mechanism.
METHODS: Synovial tissue samples from patients with or without osteoarthritis were clinical collected for primary cell culture. Protein and mRNA expression levels of NLRP3, caspase recruitment domain and Caspase-1 in primary synovial fibroblasts were detected. Additionally, primary synovial fibroblasts were stimulated by 1,25(OH)2D3 in vitro for 24 hours. The protein expression of NLRP3, caspase recruitment domain and Caspase-1 was then detected. The levels of H3K4me3, H2AK119Ub, and H3K27me3 in the promoter region of NLRP3 were detected by chromatin immunoprecipitation technique. Small interfering RNA technique was applied to knock down the expression level of vitamin D receptor in synovial fibroblasts, and the primary cells were stimulated by 1,25(OH)2D3 in vitro for 24 hours. Subsequently, the protein expression of NLRP3, caspase recruitment domain, and Caspase-1 was detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with non-osteoarthritis patients, NLRP3 inflammasome pathway associated proteins (NLRP3, caspase recruitment domain, and Caspase-1) were overexpressed in synovial fibroblasts of osteoarthritis patients, and the transcription level of NLRP3 in osteoarthritis patients was significantly higher than that in non-osteoarthritis patients (P < 0.01). Compared with non-osteoarthritis patients, 1,25(OH)2D3 significantly inhibited the transcription level of NLRP3 and activation of NLRP3 inflammasome pathway in synovial fibroblasts of osteoarthritis patients in vitro (P < 0.05). Knockdown of vitamin D receptor could attenuate the inhibitory effect of 1,25(OH)2D3 on NLRP3 transcription and abate its inhibitory effect on the activation of NLRP3 inflammasome pathway. These findings suggest that 1,25(OH)2D3 exerts an inhibitory effect on NLRP3 transcriptional expression mainly by upregulating the levels of H3K27me3 and H2AK119Ub and inhibiting the level of H3K4me3 in NLRP3 promoter region.

Key words: osteoarthritis, synovial fibroblast, inflammation, 1,25(OH)2D3, NLRP3, vitamin D receptor, histone modification

中图分类号:

王健, 顾三军, 刘宇, 赵凯, 李海峰. 骨关节炎滑膜成纤维细胞内含NOD样受体家族Pyrin域蛋白3启动子的组蛋白修饰[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(15): 2387-2393.

Wang Jian, Gu Sanjun, Liu Yu, Zhao Kai, Li Haifeng. Levels of histone modification in promoter of NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3 in synovial fibroblasts of osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(15): 2387-2393.

图/表（结果） 4

2.1 骨关节炎患者滑膜细胞NLRP3通路过度激活为了明确骨关节炎患者滑膜细胞中NLRP3通路相关分子的表达水平，通过对临床手术获得的骨关节炎患者滑膜组织及非骨关节炎患者滑膜组织进行原代细胞培养，提取滑膜成纤维细胞样细胞中蛋白及RNA，通过免疫印迹及荧光定量PCR实验检测NLRP3、Caspase招募域和Casepase-1表达水平。结果发现，与非骨关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞相比，骨关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3、Caspase招募域、Caspase-1蛋白表达水平均显著增高(n=3，P < 0.001)，见图1A-D。为进一步验证，通过实时荧光定量PCR实验检测NLRP3表达水平，发现骨关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3转录水平较非骨关节炎患者增高(0.03±0.02 vs. 0.21±0.03，n=4，P < 0.01)，见图1E。结果提示，骨关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞中存在NLRP3过度激活。

2.2 1，25(OH)2D3处理可以抑制骨关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3信号通路研究显示，1，25(OH)2D3缺乏是导致骨关节炎的重要危险因素，有研究显示1，25(OH)2D3可以抑制类风湿性关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3信号通路活化[23]，但是1，25(OH)2D3是否可以抑制骨关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3的表达水平尚不明确。为了探索1，25(OH)2D3在其中的作用，通过原代培养获得骨关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞，并使用终浓度为10-7 mol/L的1，25(OH)2D3刺激滑膜成纤维细胞样细胞，24 h后提取蛋白及RNA检测NLRP3相关通路分子的改变。结果显示，与对照组相比，1，25(OH)2D3处理可以抑制滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3、Caspase招募域及Caspase-1的蛋白表达水平(n=3，P < 0.05)，见图2A-D；同时1，25(OH)2D3可明显抑制NLRP3分子的转录表达(0.03±0.01 vs. 0.18±0.04，n=3，P < 0.01)，见图2E。

2.3 1，25(OH)2D3抑制滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3信号通路依赖于维生素D受体分子 1，25(OH)2D3调控下游靶点主要是通过与维生素D受体结合后发挥转录调控作用[24]。为了进一步探索1，25(OH)2D3调控NLRP3通路是否依赖于维生素D受体，通过使用小干扰RNA敲低滑膜成纤维细胞样细胞中维生素D受体的水平。通过免疫印迹检测NLRP3、Caspase招募域及Caspase-1的表达水平，结果发现，敲低滑膜成纤维细胞样细胞内维生素D受体的表达后，1，25(OH)2D3处理无法抑制滑膜成纤维细胞样细胞内NLRP3、Caspase招募域及Caspase-1分子的蛋白表达水平，这提示1，25(OH)2D3抑制滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3信号通路依赖于维生素D受体分子。为了进一步明确1，25(OH)2D3抑制NLRP3转录表达是否依赖于维生素D受体，通过实时荧光定量PCR实验发现，转染敲低维生素D受体之后，可以减少滑膜成纤维细胞样细胞内维生素D受体的表达水平，但是1，25(OH)2D3处理对滑膜成纤维细胞样细胞的维生素D受体表达似乎没有明显影响。
与1，25(OH)2D3组相比，维生素D受体敲低后1，25(OH)2D3抑制骨关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3表达作用明显减弱(n=3，P < 0.001)；与对照组相比，维生素D受体敲低后，1，25(OH)2D3的抑制作用两者之间差异无显著性意义(n=3，P=0.1478)，提示1，25(OH)2D3的抑制作用可能主要依赖于维生素D受体。同时，检测Caspase招募域分子，发现维生素D受体敲除也可以减弱1，25(OH)2D3的抑制作用(n=3，P < 0.001)；检测Caspase-1分子也获得了同样的结论(n=3，P < 0.01)；与对照组相比，1，25(OH)2D3抑制Caspase-1的作用，两者之间差异无显著性意义(n=3，P=0.0887)。见图3A-E。
通过实时荧光定量PCR实验结果发现，与si-NC组相比，敲低维生素D受体表达后1，25(OH)2D3抑制滑膜成纤维细胞样细胞NLRP3转录表达的作用减弱(n=3，P < 0.001)，且与对照组之间无明显差异(n=3，P=0.2587)，见图3F。综合上述结果，可以初步明确1，25(OH)2D3主要通过与维生素D受体结合后抑制NLRP3转录表达及下游信号通路的活化。

2.4 1，25(OH)2D3抑制滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3启动子激活性组蛋白修饰，促进抑制性组蛋白修饰研究显示1，25(OH)2D3可影响影响下游靶基因的组蛋白修饰参与转录调控[25]，为了进一步明确1，25(OH)2D3抑制NLRP3转录表达是否依赖于这一过程。对上述滑膜成纤维细胞样细胞刺激后，通过染色质免疫共沉淀检测NLRP3启动子区域的组蛋白H3K27三甲基化(H3K27me3)、H2AK119单泛素化(H2AK119Ub)及H3K4三甲基化(H3K4me3)。结果发现，1，25(OH)2D3刺激可以抑制NLRP3启动子区域H3K4me3的表达水平(n=3，P < 0.01)，见图4A，H3K4me3修饰可以使染色质松散，激活转录表达。同时发现1，25(OH)2D3刺激可提高NLRP3启动子区域H3K27me3和H2AK119Ub的表达水平(n=3，P < 0.05，P < 0.001)，见图4B，C，H2K37me3及H2AK119Ub修饰可以压缩染色质，抑制转录。上述结果提示1，25(OH)2D3抑制NLRP3转录可能是由于其抑制了NLRP3启动子区域激活性组蛋白修饰水平，并提高了抑制性组蛋白修饰的水平。

参考文献

[1] CORYELL PR, DIEKMAN BO, LOESER RF. Mechanisms and therapeutic implications of cellular senescence in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2021;17(1):47-57.
[2] CHEN L, ZHENG JJY, LI G, et al. Pathogenesis and clinical management of obesity-related knee osteoarthritis: Impact of mechanical loading. J Orthop Translat. 2020;24:66-75.
[3] MASON D, ENGLUND M, WATT FE. Prevention of posttraumatic osteoarthritis at the time of injury: Where are we now, and where are we going? J Orthop Res. 2021;39(6):1152-1163.
[4] RAMASAMY B, MAGNE F, TRIPATHY SK, et al. Association of Gut Microbiome and Vitamin D Deficiency in Knee Osteoarthritis Patients: A Pilot Study. Nutrients. 2021;13(4):1272.
[5] KULKARNI P, MARTSON A, VIDYA R, et al. Pathophysiological landscape of osteoarthritis. Adv Clin Chem. 2021;100:37-90.
[6] WANG R, XU B. TGF-beta1-modified MSC-derived exosomal miR-135b attenuates cartilage injury via promoting M2 synovial macrophage polarization by targeting MAPK6. Cell Tissue Res. 2021;384(1):113-127.
[7] CHU L, LIU X, HE Z, et al. Articular Cartilage Degradation and Aberrant Subchondral Bone Remodeling in Patients with Osteoarthritis and Osteoporosis. J Bone Miner Res. 2020; 35(3):505-515.
[8] HAN D, FANG Y, TAN X, et al. The emerging role of fibroblast-like synoviocytes-mediated synovitis in osteoarthritis: An update. J Cell Mol Med. 2020;24(17): 9518-9532.
[9] ZHANG H, CAI D, BAI X. Macrophages regulate the progression of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2020; 28(5):555-561.
[10] HU W, CHEN Y, DOU C, et al. Microenvironment in subchondral bone: predominant regulator for the treatment of osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2020;80(4):413-422.
[11] QIAO L, LI Y, SUN S. Insulin Exacerbates Inflammation in Fibroblast-Like Synoviocytes. Inflammation. 2020;43(3):916-936.
[12] YOSHITOMI H. Regulation of Immune Responses and Chronic Inflammation by Fibroblast-Like Synoviocytes. Front Immunol. 2019;10:1395.
[13] ZHANG G, GU M, XU Y, et al. A comprehensive analysis on the effects of 1,25(OH)2D3 on primary chondrocytes cultured from patients with osteoarthritis. Gene. 2020;730:144322.
[14] AMINI KADIJANI A, BAGHERIFARD A, MOHAMMADI F, et al. Association of Serum Vitamin D with Serum Cytokine Profile in Patients with Knee Osteoarthritis. Cartilage. 2021:19476035211010309.
[15] SUN HQ, YAN D, WANG QN, et al. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 attenuates disease severity and induces synoviocyte apoptosis in a concentration-dependent manner in rats with adjuvant-induced arthritis by inactivating the NF-kappaB signaling pathway. J Bone Miner Metabol. 2019;37(3):430-440.
[16] GU X, GU B, LV X, et al. 1, 25-dihydroxy-vitamin D3 with tumor necrosis factor-alpha protects against rheumatoid arthritis by promoting p53 acetylation-mediated apoptosis via Sirt1 in synoviocytes. Cell Death Dis. 2016;7(10):e2423.
[17] FENG X, LV C, WANG F, et al. Modulatory effect of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on IL1 beta -induced RANKL, OPG, TNF alpha , and IL-6 expression in human rheumatoid synoviocyte MH7A. Clin Dev Immunol. 2013;2013:160123.
[18] DANKERS W, GONZALEZ-LEAL C, DAVELAAR N, et al. 1,25(OH)2D3 and dexamethasone additively suppress synovial fibroblast activation by CCR6(+) T helper memory cells and enhance the effect of tumor necrosis factor alpha blockade. Arthrit Res Ther. 2018;20(1):212.
[19] QIN Q, LIU H, SHOU J, et al. The inhibitor effect of RKIP on inflammasome activation and inflammasome-dependent diseases. Cell Mol Immunol. 2021; 18(4):992-1004.
[20] AN S, HU H, LI Y, et al. Pyroptosis Plays a Role in Osteoarthritis. Aging Dis. 2020; 11(5):1146-1157.
[21] ZHAO LR, XING RL, WANG PM, et al. NLRP1 and NLRP3 inflammasomes mediate LPS/ATPinduced pyroptosis in knee osteoarthritis. Mol Me Rep. 2018;17(4):5463-5469.
[22] ZU Y, MU Y, LI Q, et al. Icariin alleviates osteoarthritis by inhibiting NLRP3-mediated pyroptosis. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):307.
[23] XIN L, CHE B, ZHAI B, et al. 1,25-Dihydroxy Vitamin D3 Attenuates the Oxidative Stress-Mediated Inflammation Induced by PM2.5via the p38/NF-kappaB/NLRP3 Pathway. Inflammation. 2019;42(2):702-713.
[24] CARLBERG C. Vitamin D Signaling in the Context of Innate Immunity: Focus on Human Monocytes. Front Immunol. 2019;10:2211.
[25] ZHANG H, KHOA LTP, MAO F, et al. MLL1 Inhibition and Vitamin D Signaling Cooperate to Facilitate the Expanded Pluripotency State. Cell Rep. 2019;29(9): 2659-2671.e2656.
[26] ZHANG Z, HUANG C, JIANG Q, et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of osteoarthritis in China (2019 edition). Ann Trans Med. 2020;8(19):1213.
[27] DE LANGE-BROKAAR BJ, IOAN-FACSINAY A, VAN OSCH GJ, et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(12):1484-1499.
[28] LIU S, CAO C, ZHANG Y, et al. PI3K/Akt inhibitor partly decreases TNF-alpha-induced activation of fibroblast-like synoviocytes in osteoarthritis. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):425.
[29] ROEMER FW, GUERMAZI A, HUNTER DJ, et al. The association of meniscal damage with joint effusion in persons without radiographic osteoarthritis: the Framingham and MOST osteoarthritis studies. Osteoarthritis Cartilage. 2009; 17(6):748-753.
[30] BENITO MJ, VEALE DJ, FITZGERALD O, et al. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2005;64(9):1263-1267.
[31] YANG CR, SHIH KS, LIOU JP, et al. Denbinobin upregulates miR-146a expression and attenuates IL-1beta-induced upregulation of ICAM-1 and VCAM-1 expressions in osteoarthritis fibroblast-like synoviocytes. J Mol Med. 2014;92(11):1147-1158.
[32] CARLBERG C, MUNOZ A. An update on vitamin D signaling and cancer. Semin Cancer Biol. 2020.S1044-579X(20)30114-0.
[33] MALLUCHE HH, HENRY H, MEYER-SABELLAK W, et al. Effects and interactions of 24R,25(OH)2D3 and 1,25(OH)2D3 on bone. Am J Physiol. 1980;238(5):E494-498.
[34] KELLEY N, JELTEMA D, DUAN Y, et al. The NLRP3 Inflammasome: An Overview of Mechanisms of Activation and Regulation. Int J Mol Sci. 2019;20(13):3328.
[35] RATHINAM VA, FITZGERALD KA. Inflammasome Complexes: Emerging Mechanisms and Effector Functions. Cell. 2016;165(4):792-800.
[36] SUTTERWALA FS, HAASKEN S, CASSEL SL. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 2014;1319(1):82-95.
[37] CAO R, MA Y, LI S, et al. 1,25(OH)2 D3 alleviates DSS-induced ulcerative colitis via inhibiting NLRP3 inflammasome activation. J Leukoc Biol. 2020;108(1):283-295.
[38] TULK SE, LIAO KC, MURUVE DA, et al. Vitamin D(3) metabolites enhance the NLRP3-dependent secretion of IL-1beta from human THP-1 monocytic cells. J Cell Biochem. 2015;116(5):711-720.
[39] POLI G, FABI C, BELLET MM, et al. Epigenetic Mechanisms of Inflammasome Regulation. Int J Mol Sci. 2020;21(16):5758.
[40] LECOEUR H, PRINA E, ROSAZZA T, et al. Targeting Macrophage Histone H3 Modification as a Leishmania Strategy to Dampen the NF-kappaB/NLRP3-Mediated Inflammatory Response. Cell Rep. 2020;30(6):1870-1882.e1874.
[41] LECOEUR H, ROSAZZA T, KOKOU K, et al. Leishmania amazonensis Subverts the Transcription Factor Landscape in Dendritic Cells to Avoid Inflammasome Activation and Stall Maturation. Front Immunol. 2020;11:1098.
[42] UCKELMANN M, SIXMA TK. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Rep. 2017;56:92-101.
[43] CHAN HL, MOREY L. Emerging Roles for Polycomb-Group Proteins in Stem Cells and Cancer. Trends Biochem Sci. 2019;44(8):688-700.
[44] BARBOUR H, DAOU S, HENDZEL M, et al. Polycomb group-mediated histone H2A monoubiquitination in epigenome regulation and nuclear processes. Nat Commun. 2020;11(1):5947.
[45] FU B, WANG H, WANG J, et al. Epigenetic regulation of BMP2 by 1,25-dihydroxyvitamin D3 through DNA methylation and histone modification. PloS One. 2013;8(4):e61423.

引言

骨关节炎是一种常见的老年退行性关节疾病，可导致患者残疾，关节炎可由多种内源性或外源性因素(如衰老、肥胖、劳损、维生素D缺乏等)诱发[1-4]，这些损伤因素可导致关节损伤修复失败，最终引起关节组织功能障碍。近来研究表明骨关节炎表现为关节各结构的各种病理改变，其中包括滑膜炎症、关节软骨损伤、骨重塑等[5-7]。滑膜炎症被认为加剧病理性骨关节炎的进展关键病理改变[8]，研究表明50%的关节炎患者出现滑膜炎，但是滑膜炎促进病理性关节炎发生发展的机制尚不清楚。滑膜组织是由多种细胞组成的复杂组织，如滑膜成纤维细胞、免疫细胞、血管内皮细胞等[9-10]。滑膜成纤维细胞样细胞可能是促进滑膜炎发展的关键细胞群，研究显示滑膜成纤维细胞样细胞可分泌许多促炎因子，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6，加剧骨关节炎滑膜炎症[11-12]。然而，滑膜成纤维细胞样细胞促进滑膜炎的机制目前尚不清楚。
许多研究表明，维生素D缺乏特别是活性维生素D3[1，25(OH)2D3]缺乏，可加剧骨关节炎和滑膜炎症的进展[13-14]。SUN等[15]的研究表明，1，25(OH)2D3可诱导大鼠佐剂性关节炎滑膜细胞凋亡。此外，研究发现1，25(OH)2D3通过调节Sirt1-p53轴加速人类风湿性关节炎滑膜细胞的凋亡[16]，并抑制类风湿性关节炎中巨噬细胞促炎细胞因子的产生。多项研究表明，1，25(OH)2D3可通过经典核因子κB通路调节MH7A促炎效应[17]。DANKERS等[18]发现1，25(OH)2D3联合地塞米松可抑制滑膜成纤维细胞的活化。但1，25(OH)2D3是否能影响骨关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的促炎效应及其具体机制仍需进一步研究。
炎症小体是一种细胞内的多蛋白复合物，在多种外源性和内源性因素(如脂多糖、氧化应激等)刺激下被激活[19]。炎症小体激活促进促炎细胞因子白细胞介素1β和白细胞介素18的成熟和表达，进而启动先天免疫反应，诱导多器官炎症反应。炎症小体介导的焦亡已被证明参与膝关节骨关节炎的病理过程[20-21]，含NOD样受体家族Pyrin域蛋白3(pyrin domain containing protein 3，NLRP3)的炎症小体是炎症小体的关键成员之一，研究显示，NLRP3抑制剂可缓解类风湿性关节炎的进程[22]。NLRP3可招募半胱天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，Caspase)招募域和Caspase-1蛋白，增加炎症因子的释放。但是目前NLRP3通路在骨关节炎滑膜细胞促炎反应中的作用知之甚少，且对1，25(OH)2D3在骨关节炎滑膜细胞NLRP3通路中的作用及调控机制也尚不明确，亟需深入研究。
此次研究的目的是明确1，25(OH)2D3是否抑制骨关节炎滑膜细胞NLRP3通路活化，以及其调控的潜在机制。作者通过使用1，25(OH)2D3和人维生素D受体小干扰RNA处理人类骨关节炎-滑膜成纤维细胞样细胞，并进一步检测NLRP3信号通路相关蛋白表达和NLRP3启动子的组蛋白修饰水平。此次研究将为临床防治骨关节炎患者滑膜炎寻找新的治疗靶点和方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学及分子生物学实验，计量资料描述为x±s，采用标准t检验和单因素方差分析比较组间差异；定性数据用百分比描述，并使用卡方检验进行分析。
1.2 时间及地点实验于2020年7月至2021年2月在无锡市第九人民医院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 滑膜组织收集10例原发性骨性关节炎行全膝关节置换患者的滑膜组织，均为男性，年龄60-70岁，这些患者均来自于无锡市第九人民医院。骨性关节炎的诊断符合1985年美国风湿病学院的标准。
以半月板损伤在无锡市第九人民医院进行手术患者的废弃滑膜组织作为健康对照，患者年龄25-35岁。实验方案均获得患者知情同意，并签署知情同意书。
1.3.2 实验试剂与仪器 DMEM培养基、澳洲胎牛血清、双抗、0.25%胰蛋白酶、PBS均购自美国 Gibco公司；胶原酶D购买自Roche；70 μm细胞滤器购买自Millipore公司；1，25(OH)2D3购自Sigma-Adrich公司；TRIzol、Lipofectamine 3000、RIPA购自Thermo公司；HiScript Ⅲ第一链cDNA合成试剂盒、ChamQ SYBR qPCR Master Mix购自Vazyme公司；SimpleChIP®Plus Sonication Chromatin IP Kit购自Cell Signaling Technology公司；兔单克隆抗NLRP3抗体、抗Caspase招募域抗体、抗Caspase-1抗体均购自Cell Signaling Technology；抗维生素D受体抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；免疫印迹实验制胶相关试剂及相关设备均购自Bio-Rad公司；荧光定量PCR仪器购自ABI公司。
1.4 方法
1.4.1 滑膜成纤维细胞样细胞的分离与培养首先将滑膜组织细切成小块，加入1 g/L胶原酶D(Roche)在高糖DMEM培养基(Gibco，Carlsbad，CA，USA)中孵育两三小时，在37 ℃下制备成滑膜单细胞悬液。用70 μm细胞滤器过滤细胞悬液，放入含体积分数10%胎牛血清(Invitrogen，Australia)、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM组织培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中。24 h后，移除非贴壁细胞，通过胰蛋白酶(Gibco，Carlsbad，CA，USA)将贴壁细胞培养到亚融合(80%)和分裂(1∶3)。
1.4.2 1，25(OH)2D3体外刺激使用含10-7 mol/L 1，25(OH)2D3 (Sigma-Adrich)的DMEM处理滑膜成纤维细胞样细胞24 h，24 h后收集滑膜细胞进一步实验。对照组(Control组)使用PBS处理。将2×105个细胞接种于6孔板小孔中，待细胞生长至80%-90%时使用1，25(OH)2D3刺激并进行后续实验。
1.4.3 小干扰RNA敲低维生素D受体参考先前的报道，设计并合成了与人类维生素D受体互补的RNA引物(Invitrogen， Carlsbad，CA，USA)。参考说明书操作，使用Lipofectamine 3000试剂(Thermo，Carlsbad，CA，USA)将维生素D受体-小干扰RNA转染到滑膜成纤维细胞样细胞中。小干扰RNA敲低后细胞分为3组，具体包括转染NC-小干扰RNA并使用1，25(OH)2D3刺激组[1，25(OH)2D3+si-NC]、转染NC-小干扰RNA并用PBS处理组(Control+si-NC)、转染维生素D受体-小干扰RNA并使用1，25(OH)2D3刺激组[1，25(OH)2D3+ si-VDR]。收集滑膜成纤维细胞样细胞，孵育72 h后用实时荧光定量PCR检测mRNA。此次实验使用的维生素D受体-小干扰RNA序列和对照(si-NC)，见表1。

1.4.4 实时荧光定量PCR 收集滑膜成纤维细胞样细胞提取总RNA。使用TRIzol (IInvitrogen，Carlsbad，CA，USA)法提取RNA，按照说明书进行操作。使用HiScript Ⅲ第一链cDNA合成试剂盒(Vazyme，NanJing，China)将0.1 μg RNA反转录成互补DNA(cDNA)。实时荧光定量PCR实验使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Vazyme，Nanjing，China)试剂，根据制造商的说明书进行操作，并与GAPDH的mRNA水平进行比值计算。此次实验中使用的实时荧光定量PCR引物序列，见表2。

1.4.5 蛋白提取和免疫印迹将获得的滑膜成纤维细胞样细胞与RIPA裂解缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)孵育获得总细胞裂解液。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并转移至PCDF膜上。使用5%牛奶(Bio-Rad，Hercules，CA)中封闭1 h后，加入兔单克隆抗NLRP3(1∶1 000，Cell Signaling Technology)抗体、抗Caspase招募域(1∶1 000，Cell Signaling Technology)抗体、抗Caspase-1(1∶1 000，Cell Signaling Technology)抗体、抗维生素D受体抗体(1∶500，Santa Cruz Biotechnology)，在4 ℃下孵育过夜，GAPDH作为细胞总蛋白的装载对照。
1.4.6 染色质免疫共沉淀实验此次实验中染色质免疫沉淀使用SimpleChIP®Plus Sonication Chromatin IP Kit(Cell Signaling Technology)进行实验，根据制造商的说明进行。染色质样品与抗H3K4me3(1∶50，Cell Signaling Technology)、H3K27me3(1∶50，Cell Signaling Technology)、H2A-K119Ub(1∶50，Cell Signaling Technology)或IgG(2 μL，Cell Signaling Technology)的抗体孵育。沉淀后获得的DNA进行实时荧光定量PCR分析。实时荧光定量PCR采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Yeasen，China)和StepOnePlus Real-Time PCR系统(Applied Biosystems，USA)进行。相对基因表达用2-ΔΔCt法进行处理，归一化后输入内源对照进行检测计算。实时荧光定量PCR引物，见表3。

1.5 主要观察指标 ①NLRP3通路相关分子(NLRP3、Caspase招募域、Caspase-1)在健康人和骨关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞中的表达水平；②1，25(OH)2D3处理对骨关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3、Caspase招募域、Caspase-1蛋白表达的影响及NLRP3转录水平的影响；③维生素D受体敲低后对1，25(OH)2D3处理骨关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3、Caspase招募域、Caspase-1蛋白表达的影响及NLRP3转录水平的影响；④1，25(OH)2D3处理后对骨关节炎患者滑膜成纤维细胞样细胞NLRP3启动子区域(H3K27me3)、H2AK119单泛素化(H2AK119Ub)及H3K4三甲基化(H3K4me3)的影响。
1.6 统计学分析参考先前的研究，所有分析均使用SPSS软件(Version 16.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)进行。计量资料描述为x±s，采用标准t检验和单因素方差分析比较组间差异。定性数据用百分比描述，并使用卡方检验进行分析。P值为双侧，此次实验中认为P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎是一种慢性炎症性疾病，其主要病理特点是关节炎症和关节破坏。中国60岁以上人群中有15.5%的人患有骨关节炎，到2030年将有约4亿人群患该病[26]。然而，目前临床缺乏治疗骨关节炎的特效药物，仅能缓解患者的症状。因此，寻找治疗关节炎的新靶点和药物将为临床治愈关节炎带来希望。
此文为了深入探索1，25(OH)2D3在滑膜成纤维细胞促炎反应中的作用机制，首先检测体外培养的骨关节炎患者滑膜成纤维细胞中NLRP3、Caspase招募域和Caspase-1的表达水平并发现，骨关节炎患者显著高于非骨关节炎供者，这提示骨关节炎患者滑膜细胞中存在NLRP3信号通路的过度活化。通过使用外源性1，25(OH)2D3处理滑膜细胞进行体外实验，发现NLRP3、Caspase招募域和Caspase-1的表达水平被1，25(OH)2D3抑制了，这提示1，25(OH)2D3可以抑制骨关节炎患者滑膜成纤维细胞中NLRP3信号通路的激活。鉴于1，25(OH)2D3对于下游靶基因的调控主要作用于转录层面，作者检测了NLRP3的转录水平，发现1，25(OH)2D3明显抑制了NLRP3的转录表达，这提示1，25(OH)2D3通过经典的转录调控来抑制NLRP3信号通路活化。1，25(OH)2D3经典的转录调控主要依赖于其与维生素D受体的结合，1，25(OH)2D3通过与细胞核上的维生素D受体结合后，可以促进维生素D受体入核，维生素D受体通过与下游靶基因启动子的顺式作用原件结合调控转录。为了进一步明确1，25(OH)2D3调控NLRP3转录是否依赖于维生素D受体，通过敲低滑膜成纤维细胞维生素D受体水平后使用1，25(OH)2D3处理，发现敲低维生素D受体后1，25(OH)2D3对于NLRP3转录抑制的能力明显减弱，这提示1，25(OH)2D3可以与核维生素D受体结合，抑制滑膜成纤维细胞NLRP3蛋白的表达。进一步对NLRP3启动子区域的组蛋白修饰进行分析发现，1，25(OH)2D3可抑制NLRP3启动子区组蛋白H3K4me3水平，增加H2AK119Ub和H3K27me3表达水平，这些抑制性的组蛋白修饰水平增高可以使得染色质变得更为紧密，NLRP3的转录开放性明显下降，最终抑制NLRP3转录表达。上述结果基本初步明确了1，25(OH)2D3主要通过与滑膜成纤维细胞核维生素D受体结合，维生素D受体入核后抑制NLRP3启动子区组蛋白H3K4me3水平，增加H2AK119Ub和H3K27me3表达水平，使NLRP3转录区域的染色质压缩紧密，抑制NLRP3转录因子和转录复合物的结合，抑制NLRP3的转录表达，发挥1，25(OH)2D3在关节炎滑膜成纤维细胞中的抗炎效应。
先前研究表明，滑膜炎在关节炎的进展中起着重要的作用。滑膜炎参与了骨关节炎的多期进展，特别是早期[27-28]。此外，滑膜成纤维细胞可通过分泌大量的炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等促进炎症微环境的形成，促进血管生成。同时产生基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶3，促进软骨细胞凋亡，加重骨破坏[28-29]。既往研究报道滑膜成纤维细胞通过表达黏附分子，如细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1等将单核细胞和淋巴细胞招募到滑膜，进一步加剧炎症微环境的形成[30-31]。针对滑膜成纤维细胞进行治疗将是未来关节炎治疗的新靶点和新方向。
1，25(OH)2D3是维生素D3的一种代谢衍生物，是一种类固醇激素，其主要由二羟维生素D3运送至肾脏后，在CYP27B1酶的催化下产生[32]。1，25(OH)2D3在调节钙稳态、骨代谢和免疫系统中发挥重要作用[33]。传统研究表明CYP27B1主要在肾脏中表达，但越来越多的研究表明CYP27B1在多组织器官和多种细胞类型中广泛表达，说明1，25(OH)2D3作用靶点广泛且复杂。目前认为，1，25(OH)2D3主要通过与核受体-维生素D受体结合，活化的维生素D受体可以入核与下游靶基因启动子的结合原件结合后调控下游靶基因转录表达。有研究显示，1，25(OH)2D3也具有非依赖维生素D受体的调节作用，但这些作用尚未完全阐明。SUN等[15]提示，1，25(OH)2D3联合肿瘤坏死因子阻断可降低炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8的表达水平，抑制类风湿关节炎动物模型的炎症反应，这个结论与作者的发现是一致的。此外，此次研究显示，1，25(OH)2D3主要通过抑制NLRP3转录表达来抑制炎性小体通路活化。
炎症小体最初被认为是外源性微生物感染后触发宿主防御免疫反应的重要受体[34]。炎症小体是识别损伤相关分子模式或病原相关分子模式所必需的，主要由NOD样受体激活[34-35]。NLRP3炎症小体是炎症小体家族的重要组成部分之一，在多种外源性和内源性因子刺激后的炎症反应中发挥重要作用。NLRP3炎性小体蛋白复合物是由NLRP3蛋白、包含Caspase招募域的衔接凋亡相关斑点样蛋白和效应蛋白Caspase-1组成。NLRP3通过其N端Pyrin结构域与Caspase招募域相互作用，然后NLRP3-Caspase招募域复合物招募Caspase-1。Caspase-1激活后可将pro-白细胞介素1β或pro-白细胞介素18转化为成熟形态，最终引发炎症反应[36]。CAO等[37]发现1，25(OH)2D3可通过抑制NLRP3通路缓解葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠模型的疾病进展，这一发现与作者的研究结果一致。此次研究揭示了1，25(OH)2D3对骨关节炎-滑膜成纤维细胞样细胞中NLRP3通路的抑制作用。但TULK等[38]也发现佛波酯刺激后1，25(OH)2D3可通过激活NLRP3通路增强THP-1细胞白细胞介素1β的分泌。这些不同细胞中获得的矛盾结论意味着1，25(OH)2D3可能在不同的细胞类型或在不同的病理条件下发挥完全不同的作用，进一步提示了1，25(OH)2D3调控疾病的复杂性。
表观遗传修饰是调控基因转录的重要途径之一，表观遗传调控(包括CpG岛DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控)被认为是调控炎症小体转录的关键[39]。LECOEUR等[40-41]发现NLRP3启动子在感染条件下可表现出组蛋白H3K9/14的高去乙酰化和组蛋白H3K4的高去三甲基化状态。组蛋白泛素化修饰作为一种重要的组蛋白修饰，在转录调控中也起着重要作用，组蛋白泛素化修饰被认为在DNA损伤修复、干细胞调控、DNA复制等方面发挥着重要作用[42-44]。既往研究表明，1，25(OH)2D3可通过与维生素D受体结合，提高BMP2启动子区H3K9me2水平，调节骨形态发生蛋白2基因的转录表达[45]。然而，关于1，25(OH)2D3是否影响NLRP3启动子区组蛋白修饰研究较少。通过此次研究，发现1，25(OH)2D3可以抑制NLRP3启动子区H3K4me3水平，增加H2AK119Ub和H3K27me3水平，激活性组蛋白修饰水平降低和抑制性组蛋白修饰的增高导致NLRP3启动子区域的染色质压缩更为紧密，转录表达被抑制。
综上，此次研究阐明了1，25(OH)2D3在调控关节炎滑膜成纤维细胞炎症反应中的保护作用，为临床治疗关节炎寻找到了新的潜在治疗药物及靶点。同时，深入的分子生物学揭示了1，25(OH)2D3发挥保护作用的潜在分子机制，丰富了1，25(OH)2D3在调控关节炎疾病中的作用。此项目虽初步发现了1，25(OH)2D3在调控NLRP3启动子组蛋白修饰中的关键作用，但是对于1，25(OH)2D3是如何精准调控这一生物学过程以及该分子调控是否在关节区其他细胞中存在普遍性，需要进一步探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

骨关节炎滑膜成纤维细胞内含NOD样受体家族Pyrin域蛋白3启动子的组蛋白修饰

Levels of histone modification in promoter of NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3 in synovial fibroblasts of osteoarthritis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张吉超, 董跃福, 牟志芳, 张震, 李冰言, 徐祥钧, 李佳意, 任梦, 董万鹏. 骨关节炎患者在不同步态角度下膝关节内部生物力学变化的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1357-1361.
[2]	张皓博, 赵宇楠, 杨学军. 细胞焦亡在椎间盘退变中的作用及治疗意义[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1445-1451.
[3]	金涛, 刘林, 朱晓燕, 史宇悰, 牛建雄, 张同同, 吴树金, 杨青山. 骨关节炎与线粒体异常[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1452-1458.
[4]	唐文静, 伍思源, 杨晨, 陶希. 炎症反应与卒中后抑郁[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1278-1285.
[5]	孔亚敏, 严隽陶, 马丙祥, 李华伟. 推拿振法干预坐骨神经损伤模型大鼠MyoD表达及肌卫星细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1160-1166.
[6]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[7]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[8]	王琴, 沈呈, 廖静, 杨烨. 达格列净干预改善糖尿病肾病模型大鼠的肾脏损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1216-1222.
[9]	项鑫健, 柳芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶越, 赵政男, 赵宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[10]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[11]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[12]	刘冬铖, 赵继军, 周子红, 吴沼锋, 俞颖豪, 陈宇浩, 冯德宏. 开放楔形胫骨高位截骨手术不同力线矫正参考方法的比较[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(6): 827-831.
[13]	刘伊依, 邱俊强, 衣龙燕, 周财亮. 接受抗阻训练中老年人白细胞介素6与C-反应蛋白变化的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 804-812.
[14]	殷婷婷, 杜大勇, 蒋知新, 柳杨, 刘奇林, 李运田. 粒细胞集落刺激因子改善急性心肌梗死模型大鼠的心肌纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 730-735.
[15]	范建超, 徐派的, 韩永丽, 文彩玉珠, 张红星, 潘小丽. 电针足三里对功能性消化不良模型大鼠内脏高敏感性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 663-668.