次氯酸对骨科内固定物表面细菌生物膜的清除作用

doi:10.12307/2022.592

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (15): 2367-2371.doi: 10.12307/2022.592

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次氯酸对骨科内固定物表面细菌生物膜的清除作用

梁金正1，邵欣欣2，杜少华1，戴双武1

1南方医科大学第三附属医院骨科医学中心骨肿瘤科，广东省广州市 510630；2中山大学附属第一医院麻醉科，广东省广州市 510080

收稿日期:2021-08-25 修回日期:2021-10-12 接受日期:2021-11-15 出版日期:2022-05-28 发布日期:2022-01-06
通讯作者: 戴双武，在读博士，主治医师，南方医科大学第三附属医院骨科医学中心骨肿瘤科，广东省广州市 510630
作者简介:梁金正，男，1994年生，广东省云浮市人，汉族，骨科住培医师，主要从事骨感染等方面研究。
基金资助:
广东省科技计划项目(2020A1414050028)，项目负责人：戴双武

Scavenging effect of hypochlorous acid on bacterial biofilm on the surface of orthopedic internal fixation devices

Liang Jinzheng1, Shao Xinxin2, Du Shaohua1, Dai Shuangwu1

1Department of Musculoskeletal Oncology, Center for Orthopedic Surgery, the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China; 2Department of Anesthesiology, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Received:2021-08-25 Revised:2021-10-12 Accepted:2021-11-15 Online:2022-05-28 Published:2022-01-06
Contact: Dai Shuangwu, MD candidate, Attending physician, Department of Musculoskeletal Oncology, Center for Orthopedic Surgery, the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
About author:Liang Jinzheng, Resident of the Center for Orthopedic Surgery, the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Project of Guangdong Province, No. 2020A1414050028 (to DSW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
次氯酸：化学式HClO，是氯气溶解于水时形成的一种一价氯的含氧弱酸。在工业上，次氯酸作为家用漂白剂和清洁剂中的活性成分而广为人知。在生物学系统中，次氯酸可被视为白细胞例如中性粒细胞和单核细胞产生的毒性最强、丰度最高的氧化剂。
细菌生物膜：也称为生物被膜，是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体，存在各种主要的生物大分子如蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质。细菌生物膜多细胞结构的形成是一个动态过程，包括细菌起始黏附、细菌生物膜发展和成熟扩散等阶段。细菌生物膜对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强。

背景：骨科内固定物感染中形成的细菌生物膜是临床非常棘手的问题。次氯酸作为一种高效消毒剂，可引起细菌生物膜破坏，可能对骨科内固定物感染治疗有帮助。
目的：研究次氯酸溶液体外浸泡不同时间及灌注对骨科内固定物表面细菌生物膜的清除作用。
方法：将金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在骨科钢板内固定物上定植3 d后形成细菌生物膜，扫描电镜下确认细菌生物膜已形成。采用次氯酸溶液分别浸泡已形成两种细菌生物膜的内固定物0，5，10，20 min及20 min+灌注6 L次氯酸和生理盐水的混合溶液(每3 L生理盐水加入120 mL次氯酸)，扫描电镜下观察细菌生物膜形态，评估次氯酸溶液对内固定物细菌生物膜的清除效果。
结果与结论：①铜绿假单胞菌：扫描电镜下可见，未经次氯酸溶液浸泡的内固定物上的细菌生物膜斑块面积大且较厚，菌落密集集中；经过次氯酸浸泡5，10，20 min后，细菌生物膜斑块面积逐渐减小并变薄，次氯酸溶液浸泡20 min+灌注6 L次氯酸和生理盐水的混合溶液可清除细菌生物膜；②金黄色葡萄球菌：扫描电镜下的表现与铜绿假单胞菌生物膜一致；③结果表明：延长浸泡时间或联合灌注可增强次氯酸对内固定物细菌生物膜的清除作用；次氯酸溶液浸泡足够时长可降解破坏内固定物上定植的细菌生物膜，清除菌落，从而达到消毒目的。

https://orcid.org/0000-0001-6824-5950 (梁金正)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 次氯酸, 细菌生物膜, 骨科手术, 骨科内固定物, 感染, 消毒剂

Abstract: BACKGROUND: Biofilm formation during the infection of orthopedic fixation devices is a very difficult clinical problem. Hypochlorous acid, as a highly effective disinfectant, can destroy the bacterial biofilm, which may be helpful for treating infection of orthopedic fixation devices.
OBJECTIVE: To study the scavenging effect of hypochlorous acid on bacterial biofilm on the surface of orthopedic fixation devices after soaking and perfusion for different time in vitro.
METHODS: Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were colonized on orthopedic steel fixation devices for 3 days, and then the bacterial biofilm formed, which was confirmed by scanning electron microscope. Orthopedic fixation devices with two kinds of bacterial biofilms were soaked in hypochlorous acid for 0, 5, 10, and 20 minutes, or perfused with 6 L of a mixed solution of hypochlorous acid and saline (every 3 L of saline with addition of 120 mL of hypochlorous acid) for 20 minutes. The morphology of bacterial biofilms was observed under scanning electron microscope, and the scavenging effect on the bacterial biofilm on the surface of orthopedic internal fixation devices was then evaluated.
RESULTS AND CONCLUSION: Pseudomonas aeruginosa: Under the scanning electron microscope, the bacterial biofilm plaques on the surface of the internal fixation device that was not soaked in hypochlorous acid solution were large and thick, and the colonies were densely concentrated. After 5, 10, and 20 minutes soaking in hypochlorous acid, the bacterial biofilm plaque area was gradually decreased and became thinner. Perfusion with 6 L of a mixture of hypochlorous acid and saline for 20 minutes could remove the bacterial biofilm. Staphylococcus aureus: The performance under the scanning electron microscope was consistent with the biofilm of Pseudomonas aeruginosa. To conclude, prolonging the soaking time or a mixed perfusion can enhance the scavenging effect of hypochlorous acid on the bacterial biofilm on the surface of internal fixation devices. By soaking in hypochlorous acid for a sufficient time, the bacterial biofilm colonized on the surface of orthopedic internal fixation devices can be degraded and destroyed, thus achieving the purpose of disinfection.

Key words: hypochlorous acid, bacterial biofilm, orthopedic surgery, orthopedic internal fixation device, infection, disinfectant

中图分类号:

梁金正, 邵欣欣, 杜少华, 戴双武. 次氯酸对骨科内固定物表面细菌生物膜的清除作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(15): 2367-2371.

Liang Jinzheng, Shao Xinxin, Du Shaohua, Dai Shuangwu. Scavenging effect of hypochlorous acid on bacterial biofilm on the surface of orthopedic internal fixation devices[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(15): 2367-2371.

图/表（结果） 3

2.1 次氯酸溶液对铜绿假单胞菌生物膜的清除效果见图1。

扫描电镜下可见，未经次氯酸溶液浸泡的内固定物的细菌生物膜斑块虽然在低倍数下膜数量不多，但在高倍数放大后观察到面积大且厚度较厚，菌落密集集中；经过次氯酸浸泡5 min后，细菌生物膜斑面积较小，集中度高，整体厚度变薄，斑块边缘锐化，呈现中间厚边缘薄；浸泡10 min后，大体可见斑块很少，在高倍数下观察到细菌生物膜斑块呈现圆形规则状态，且斑块之间间隔较大；浸泡20 min后，在高倍数下观察到细菌生物膜斑块已经不能呈现规则形状，只能观察到少量菌落；浸泡20 min+灌注6 L次氯酸和生理盐水的混合溶液后，在高倍数下观察找不到菌落，在打磨划痕空隙间可以观察到少量细菌残留。
2.2 次氯酸溶液对金黄色葡萄球菌生物膜的清除效果见图2。

扫描电镜下可见，未经次氯酸溶液浸泡的内固定物的细菌生物膜斑块在低倍数下可观察到，形成了很多细菌生物膜斑块，放大后观察到面积大且厚度较厚，菌落密集且集中；经过次氯酸溶液浸泡5 min后，可明显观察到细菌生物膜斑块减少，放大后细菌生物膜整体厚度变薄，斑块边缘锐化，呈现中间厚边缘薄；浸泡10 min后，在高倍数下观察到细菌生物膜斑块已经不能呈现规则形状，只能观察到少量菌落形成的斑块；浸泡20 min后；在高倍数下观察到细菌生物膜斑块已经不能呈现规则形状，只能观察到少量菌落；浸泡20 min+灌注6 L次氯酸和生理盐水的混合溶液后，在高倍数下观察到少量细菌且分散度高，不足以形成斑块。
2.3 经过次氯酸溶液浸泡后细菌生物膜分级根据上述观察结果可以得知，在5-20 min范围内，随着次氯酸溶液浸泡时间的延长，细菌生物膜斑块面积逐渐减小，且细菌生物膜斑块逐渐成圆形规则状态，中间厚边缘薄，再到不能呈现规则形状的菌落且分散度高。两种细菌生物膜经次氯酸溶液浸泡后的结果基本保持一致，见表2。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细菌微生物实验。
1.2 时间及地点实验于2021年5-6月在西安国联质量检测技术股份有限公司完成。

1.3 材料 ①金黄色葡萄球菌(购自ATCC，Catalog Number:0485)、铜绿假单胞菌细菌菌液(购自ATCC，Catalog Number:15442)；②骨科内固定物：钛合金材料，金属直型接骨板-小型有限接触板SSQ03，5孔购大博医疗科技股份有限公司，见表1；③次氯酸溶液：由广州泰道安医疗科技有限公司提供，商品名“赛乐洁®皮肤黏膜消毒剂”，含有效氯(100±10) mg/L，均在有效期内；④扫描电镜：捷克 TESCAN，型号VEGAIIXMU。

1.4 实验方法
金黄色葡萄球菌：共5块骨科内固定物(1 cm×1 cm)，分别命名为A1、B1、C1、D1、E1。A1浸泡金黄色葡萄球菌菌液，不浸泡次氯酸溶液；B1、C1、D1、E1均浸泡金黄色葡萄球菌菌液，定植72 h生成细菌生物膜后浸泡次氯酸溶液，B1浸泡5 min、C1浸泡10 min、D1浸泡20 min、E1浸泡20 min后灌注6 L次氯酸溶液和无菌生理盐水的混合溶液(每3 L生理盐水加入120 mL次氯酸溶液)。浸泡后用无菌生理盐水冲洗3次，2.5%戊二醛磷酸盐(pH=7.2)缓冲液固定2 h，然后经体积分数30%，50%，70%，80%，85%，90%，93%，95%，100%一系列梯度乙醇脱水，表面喷金后扫描电镜下观察细菌生物膜形态。
铜绿假单胞菌：共5块骨科内固定物(1 cm×1 cm)，分别命名为A2、B2、C2、D2、E2。A2浸泡铜绿假单胞菌菌液，不浸泡次氯酸溶液；B2、C2、D2、E2均浸泡铜绿假单胞菌菌液，定植72 h生成细菌生物膜后浸泡次氯酸溶液，B2浸泡5 min、C2浸泡10 min、D2浸泡20 min、E2浸泡20 min后灌注6 L次氯酸溶液和无菌生理盐水的混合溶液(每3 L生理盐水加入120 mL次氯酸溶液)。浸泡后用无菌生理盐水冲洗3次，2.5%戊二醛磷酸盐(pH=7.2)缓冲液固定2 h，然后经经体积分数30%，50%，70%，80%，85%，90%，93%，95%，100%一系列梯度乙醇脱水，表面喷金后扫描电镜下观察细菌生物膜形态。
1.5 主要观察指标扫描电镜下观察各组细菌生物膜斑块密集程度、面积大小及厚度，并分别定义为Ⅰ-Ⅵ级。Ⅰ级，斑块密集，面积大，厚度较大；Ⅱ级，斑块密集，面积大，厚度薄；Ⅲ级，斑块不密集，面积小，厚度较大；Ⅳ级，斑块密集，面积小，厚度薄；Ⅴ级，斑块不密集，面积小，厚度薄；Ⅵ级，菌落体积小，不足以形成斑块。

讨论

近年来随着医学的进步和社会经济的发展，骨科内固定物植入手术应用越来越多，而临床上内固定术后感染也有增多[2]。一般来说，术后伤口是否发生感染主要取决于伤口的性质、细菌的数量与毒力和宿主抵抗能力，以及伤口内异物的存留[4]。BOSCH-NICOLAU等[5]的研究表明，根据手术的复杂性和个人危险因素，脊柱内固定术后感染的发生率为0.7%-12%。另外，MACIEJCZAK等[6]的研究发现脊柱内固定术后感染发生率在2%-5%之间。而一般四肢骨折内固定术后感染发生率为0.4%-16.1%不等，平均约5%[7]，其中闭合性骨折内固定术后感染发生率为1%，而开放性骨折则超过15%[8]。对关节置换术后患者，全髋关节置换术后、全膝关节置换术后和踝关节置换术后患者的假体周围感染发生率分别为0.3%-1.7%、0.5%-2%和2%-9%[7]。多种因素可能会导致内固定术后感染，比如接受内固定植入物的患者伤情复杂、开放性骨折、内固定物植入术中对骨膜等软组织剥离过多或者骨缺损、部分临床医师对围术期感染预防和治疗的认识不足、耐药菌的增多和低毒力感染的增多等[9]。内固定术后感染诊断困难，治疗也比较棘手，如果不能及时有效控制感染，很容易发展成为慢性骨髓炎甚至截肢等[10]。
目前为了预防内固定术后感染的发生，临床上通常会在围术期积极行抗感染治疗，术前排除全身其他系统感染，对有糖尿病、自身免疫病或长期使用糖皮质激素者积极控制病情；术前、术中和术后预防性使用抗生素；术后改善患者一般情况，提高患者自身免疫力；术后更换切口敷料时严格遵循无菌操作原则，减少感染的发生等[11-12]。对发生内固定术后感染的患者，一般的治疗方法包括全身或局部使用敏感抗生素、彻底清创、视情况处理内固定物、修复骨与软组织缺损等，并提倡多学科协作以提高诊疗效果[13-14]。如感染控制效果不佳，则需要行多次清创手术，必要时需要将内固定物取出甚至截肢等[15]。长期使用抗生素会导致耐药菌的增加，并且感染作为一种消耗性疾病常会导致患者一般情况变差，很多患者难以耐受多次清创手术治疗，临床上这类患者经常会出现消瘦、血红蛋白及血清白蛋白下降等不良情况。
国内有相关研究资料计显示，在四肢骨折内固定术后感染中，革兰阴性杆菌感染率为58.4%，大肠埃希菌占最多，铜绿假单胞菌次之；革兰阳性球菌感染率为41.6%，金黄色葡萄球菌占最多，表皮葡萄球菌次之[16]。王宇强等[17]的研究表明，脊柱手术后感染的病原菌以大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌为主。而国外资料统计表明，美国最常见的感染菌是耐甲氧西林和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌，以及耐甲氧西林和甲氧西林敏感的表皮葡萄球菌；在欧洲，凝固酶阴性葡萄球菌的感染率最高，其次是金黄色葡萄球菌、链球菌和肠球菌[18-19]。有相关研究显示，铜绿假单胞菌、大肠埃希菌对头孢菌素等常见抗菌药物耐药率均较高，且存在相当严重的多药耐药现象；金黄色葡萄球菌对头孢曲松完全耐药[20]。因此，对包括金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染在内的内固定术后感染，使用抗生素治疗的效果可能不尽人意。
此次实验选用了金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌这两种常见的引起骨科内固定术后感染的细菌。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染后容易形成细菌生物膜[21-22]，其形成主要分细菌表面附着、小集落形成、细菌生物膜成熟、分散分离这4个阶段[23]。这两种细菌感染后黏附于内固定物的表面，并可相互黏附形成多层状的形态以进入细菌静止或休眠期，从而抵抗临床抗生素治疗和免疫系统的吞噬细胞清除细菌[24-25]。细菌生物膜的形成是细菌发展为多重耐药菌的主要原因之一。金黄色葡萄球菌最显著的毒力机制之一是其形成表型改变的细菌细胞并具有嵌入细菌生物膜基质的能力。作为对环境压力的适应性反应，单细胞细菌通常形成细菌生物膜以在一个受保护的、对宿主免疫反应和抗生素治疗有抵抗力的多细胞群落中生存[22]，因此细菌生物膜的形成会严重影响抗生素发挥作用，造成治疗困难[26]。
次氯酸，化学式为HClO，是氯气溶解于水时形成的一种一价氯的含氧弱酸，作为消毒剂和清洁剂中的活性成分而广为人知，被广泛用于食品、医疗器械等的消毒，以及用于室内空气、二次供水设备设施表面、手、皮肤和黏膜的消毒[27]。在生物学系统中，次氯酸可被视为白细胞例如中性粒细胞和单核细胞产生的毒性最强、丰度最高的氧化剂。次氯酸是中性粒细胞来源的髓过氧化物酶与过氧化氢(H2O2)共同作用下氯离子发生氧化反应产生的，细胞利用O2并使用线粒体膜结合酶NADPH酶将其转换为过氧化氢(H2O2)；然后，髓过氧化物酶催化H2O2与Cl-之间的反应生成次氯酸[28]。次氯酸在人体可认为具有对抗入侵的病原体感染的作用，具有抗微生物活性，可引起细菌生物膜破坏，促进伤口修复及组织再生[29]。在有效的抗菌剂浓度范围内，次氯酸对哺乳动物细胞的细胞毒性比NaOCl和H2O2低，低浓度次氯酸无细胞毒性，无黏膜刺激性，这已在动物实验中被证实[30]。目前，国外已经有将次氯酸作为一种消毒剂应用于皮肤科、烧伤、外伤等伤口的经验[31-32]，中国也有关于次氯酸用于眼睛细菌性角膜溃疡的临床试验[33]，相关应用都展示了次氯酸作为一种消毒剂具有一定的有效性，而且对人体的安全性较高[34-35]，
但次氯酸由于其不稳定性在实际应用中有所受限[36]。目前，合适浓度的次氯酸溶液作为商品已经出现并作为消毒剂使用。
虽然从次氯酸的发现到临床应用已有约半个世纪的历史，但由于次氯酸的不稳定性，次氯酸在室温非密封等日常条件下很容易分解，目前尚未被临床广泛应用。如果次氯酸能稳定便利地储存、运输，或许能作为一种消毒剂在临床上广泛应用。目前随着包装技术的进步，储存时间较长、作用浓度稳定的次氯酸商品已经开始出现，为临床更为广泛的使用提供可能。
对怀疑有细菌生物膜形成的内固定术后感染可选择行彻底清创并联合应用敏感抗生素，但是目前临床上普遍采用的彻底清创并联合应用敏感抗生素的方法存在治疗费用高、住院时间长、患者承受更多痛苦、治疗效果不一定满意等缺点[37-38]。此次实验将次氯酸溶液在体外应用于内固定术后感染，通过长时间浸泡观察内固定物上定植的细菌生物膜变化情况，为临床上不取出内固定物，治愈内固定术后感染提供指导。实验在体外让金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在骨科内固定物上分别定植，形成细菌生物膜，探究经次氯酸溶液浸泡不同时间和灌注后的细菌生物膜清除情况。实验结果表明，在5-20 min区间内，次氯酸溶液浸泡作用时间的延长可增强次氯酸对细菌生物膜的清除作用；次氯酸溶液足够长时间浸泡内固定物可降解破坏细菌生物结构，清除菌落，达到消毒目的，这与CHEN等[3]的实验结果基本相符。目前临床针对内固定物感染的局部治疗往往多采用灌注冲洗方法，冲洗液多为生理盐水加广谱抗生素或者碘伏等，一般都不能彻底杀灭内固定物附着的细菌生物膜，导致不得不拆除内固定物[39-40]。此次实验结果提示，若给予次氯酸溶液足够时间冲洗，完全有可能彻底杀灭内固定物附着的细菌生物膜，达到不取出内固定物而治愈目的，这可能会改变传统治疗方式，具有重要临床价值。
实验结果初步表明，次氯酸可清除骨科内固定物感染形成的细菌生物膜，为临床不取出内固定物但治愈骨科内固定术后感染提供了新的思路，但存在实验细菌种类偏少、检测手段单一、没有量化指标等问题，次氯酸溶液的最佳作用时间及作用浓度尚需要进一步的实验探究。更严谨的动物实验和大样本、多中心、随机对照临床试验将进一步开展。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

次氯酸对骨科内固定物表面细菌生物膜的清除作用

Scavenging effect of hypochlorous acid on bacterial biofilm on the surface of orthopedic internal fixation devices

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