敲减骨桥蛋白的膝关节滑膜细胞转录组和蛋白质组定量分析

doi:10.12307/2022.351

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (11): 1680-1685.doi: 10.12307/2022.351

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敲减骨桥蛋白的膝关节滑膜细胞转录组和蛋白质组定量分析

徐人杰1，2，钟桥1，刘宇博1，虞宵1，颜勇卿3，赛吉拉夫2，杨惠林2，陈广祥1

1南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院关节外科，江苏省苏州市 215000；2苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215000；3中国科学院大学宁波华美医院，浙江省宁波市 315000

收稿日期:2021-01-05 修回日期:2021-01-30 接受日期:2021-08-03 出版日期:2022-04-18 发布日期:2021-12-11
通讯作者: 陈广祥，博士，硕士生导师，南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院关节外科，江苏省苏州市 215000 杨惠林，博士，博士生导师，苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215000
作者简介:徐人杰，男，1983年生，江苏省苏州市人，汉族，2009年北京大学毕业，博士，主任医师，主要从事组织损伤与修复研究。钟桥，男，1983年生，安徽省马鞍山市人，汉族，2017年苏州大学毕业，博士，副主任技师，主要从事炎症性疾病免疫调控研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81971995)，项目负责人：钟桥；江苏省基础研究计划-面上项目(BK20191179)，项目负责人：钟桥；江苏省卫生计生委科研项目(LGY2017007)，项目负责人：徐人杰；苏州市医疗卫生应用基础研究项目(SYSD2016110)，项目负责人：徐人杰；浙江省医药卫生科技面上项目(2019319060)，项目负责人：颜勇卿

Quantitative analysis of transcriptome and proteome of knee joint synovial cells with osteopontin knockdown

Xu Renjie1, 2, Zhong Qiao1, Liu Yubo1, Yu Xiao1, Yan Yongqing3, Saijilafu2, Yang Huilin2, Chen Guangxiang1

1Department of Orthopedics, Suzhou Municipal Hospital/The Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; 2Orthopedic Institute, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; 3Ningbo Huamei Hospital, University of Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315000, Zhejiang Province, China

Received:2021-01-05 Revised:2021-01-30 Accepted:2021-08-03 Online:2022-04-18 Published:2021-12-11
Contact: Chen Guangxiang, MD, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Suzhou Municipal Hospital/The Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China Yang Huilin, MD, Doctoral supervisor, Orthopedic Institute, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
About author:Xu Renjie, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, Suzhou Municipal Hospital/The Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China Zhong Qiao, MD, Associate chief technician, Department of Orthopedics, Suzhou Municipal Hospital/The Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China Xu Renjie and Zhong Qiao contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Project), No. 81971995 (to ZQ); Jiangsu Basic Research Program-General Project, No. BK20191179 (to ZQ); Scientific Research Project of Jiangsu Provincial Health and Family Planning Commission, No. LGY2017007 (to XRJ); Suzhou Medical and Health Application Basic Research Project, No. SYSD2016110 (to XRJ); Zhejiang Provincial Medicine and Health Scientific Project, No. 2019319060 (to YYQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
转录组学：是研究细胞中基因转录情况及转录调控规律的学科。
蛋白质组学：对生物样品中蛋白质的含量进行比较分析。转录组代表了基因表达的中间状态，可以反映诸如转录调控、转录后调控的机制；而蛋白质是生物体直接的功能执行者。联合转录组学和蛋白组学表达量数据能观察到mRNA-蛋白质关联性，更深入解释生物学问题。

背景：骨关节炎患者关节软骨和关节液中骨桥蛋白mRNA水平及蛋白表达均较正常人明显增高，但是骨桥蛋白在膝骨关节炎发展进程中的作用及其具体机制在既往文献中尚未阐明。
目的：探讨膝骨关节炎患者膝关节滑膜细胞中骨桥蛋白水平及其与骨关节炎严重程度的关系，并通过转录组和蛋白质组测序，进一步阐述其影响骨关节炎进展的机制。
方法：选取2019年诊治的42例原发性膝骨关节炎患者，根据胫股关节受累情况，分为单间室骨关节炎组和双间室骨关节炎组。获取滑膜标本及关节液标本，PCR法检测滑膜标本中骨桥蛋白基因在细胞中的表达丰度，ELISA法检测关节液标本中骨桥蛋白水平。应用酶消化法获取培养人膝骨关节炎滑膜成纤维样细胞，用骨桥蛋白siRNA干预24 h后，对样品进行转录组和蛋白质组检测。
结果与结论：①与单间室骨关节炎组相比，双间室骨关节炎组关节滑膜及关节液中骨桥蛋白均升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；②体外培养人膝骨关节炎滑膜成纤维样细胞，通过siRNA敲减骨桥蛋白后，转录组与蛋白质组定量研究分别鉴定了14 662个转录本和3 608个蛋白，其中 5种蛋白的转录组与蛋白质组分析结果显示同步下降，2种蛋白的转录组与蛋白质组分析结果显示同步上升；③结果表明，骨桥蛋白对骨关节炎产生不利影响，其机制可能是通过促炎作用和胰岛素样生长因子结合蛋白3对软骨的负面作用。

https://orcid.org/0000-0002-6147-2453 (徐人杰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 膝关节, 骨关节炎, 骨桥蛋白, 滑膜细胞, 转录组, 蛋白质组, 机制

Abstract: BACKGROUND: The mRNA and protein levels of osteopontin in articular cartilage and synovial fluid of patients with osteoarthritis are significantly higher than those of normal controls. However, the role and specific mechanism of osteopontin in the development of knee osteoarthritis have not been clarified.
OBJECTIVE: To investigate the level of osteopontin in synovial cells of knee joint osteoarthritis patients and its relationship with the severity of osteoarthritis, and to further elucidate the mechanism that affects the progression of osteoarthritis through transcriptome and proteome sequencing.
METHODS: A total of 42 patients with primary knee osteoarthritis diagnosed and treated in 2019 were divided into unicompartment knee osteoarthritis group and bicompartment knee osteoarthritis group based on the involvement of the tibiofemoral joint. Synovial and joint fluid specimens were harvested. PCR method was used to measure the abundance of osteopontin gene expression in synovial specimens, and ELISA method was used to measure osteopontin protein level in synovial fluid specimens. Enzymatic digestion method was used to obtain and culture human knee osteoarthritis synovial fibroblast-like cells. After osteopontin-siRNA intervention for 24 hours, the samples were tested for transcriptome and proteome.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the unicompartment knee osteoarthritis group, the osteopontin levels in the synovium and synovial fluid of the bicompartment knee osteoarthritis group increased significantly (P < 0.05). In in vitro cultured human knee osteoarthritis synovial fibroblast-like cells, after osteopontin knockdown by siRNA, quantitative studies of the transcriptome and proteome identified 14 662 transcripts and 3 608 proteins, respectively. Among them, the transcriptome and proteome analysis results of five proteins showed a simultaneous decrease, and the transcriptome and proteome analysis results of two proteins showed a simultaneous increase. To conclude, osteopontin has an adverse effect on chondrocytes. The mechanism may be through the pro-inflammatory effect and the negative effect of insulin-like growth factor-binding protein 3 on cartilage.

Key words: knee joint, osteoarthritis, osteopontin, synovial cells, transcriptome, proteome, mechanism

中图分类号:

徐人杰, 钟桥, 刘宇博, 虞宵, 颜勇卿, 赛吉拉夫, 杨惠林, 陈广祥. 敲减骨桥蛋白的膝关节滑膜细胞转录组和蛋白质组定量分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1680-1685.

Xu Renjie, Zhong Qiao, Liu Yubo, Yu Xiao, Yan Yongqing, Saijilafu, Yang Huilin, Chen Guangxiang. Quantitative analysis of transcriptome and proteome of knee joint synovial cells with osteopontin knockdown[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(11): 1680-1685.

图/表（结果） 6

2.1 参与者数量分析单间室骨关节炎组纳入患者23例，双间室骨关节炎组纳入患者19例，均进入结果分析。
2.2 两组基线资料比较见表1。两组患者年龄、性别和体质量指数比较，差异无显著性意义(均P > 0.05)。与单间室骨关节炎组相比，双间室骨关节炎组关节滑膜及关节液中骨桥蛋白均升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.3 试验流程图见图1。

2.4 原发性膝骨关节炎患者X射线片图2A为单间室骨关节炎患者的X射线片图像，可见内侧胫股关节面硬化，关节间隙狭窄，边缘可见骨赘形成；图2B为双间室骨关节炎患者的X射线片图像，可见内、外侧胫股关节面不平整，关节间隙狭窄，边缘可见骨赘形成。

2.5 人膝骨关节炎滑膜成纤维样细胞形态及生物信息学分析结果按照上述方法，培养得到人膝骨关节炎滑膜成纤维样细胞。200倍光学显微镜镜下见细胞呈三角形、长梭形，细胞核呈卵圆形，位于细胞中央，核仁清晰，细胞周围可见分泌物聚集，见图3。通过RT-PCR检测显示，siRNA显著降低滑膜成纤维样细胞中骨桥蛋白水平，见图4。通过转录组与蛋白质组定量鉴定了14 662个转录本和3 608个蛋白，其中有3 291个基因在转录组和蛋白质组水平都得到鉴定，见图5。通过转录组与蛋白质组联合分析发现，差异表达的蛋白有15个下调，25个上调；差异表达的基因有1 541个下调，2 391个上调；其中有5个共同下调，2个共同上调，见图6，表2。

经过查阅文献，发现胰岛素样生长因子结合蛋白3 (insulin-like growth factor-binding protein 3，IGFBP3)、HSPA1B对关节炎的影响比较明确，而TXNDC17、FAM129B、B2M、ATP5H、RBBP4的意义尚不明确。采用Western blot验证了骨桥蛋白表达量降低时，IGFBP3表达量同步下降，见图7。另外，炎症相关基因热图显示，siRNA敲减骨桥蛋白后，炎症相关基因表达降低，见图8。

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引言

材料方法

1.1 设计体外第4-6代成纤维细胞生物信息学分析数据采用Student’s t 检验分析。
1.2 时间及地点实验于2019年1-12月在苏州市立医院完成。
1.3 对象 2019年全年诊治的原发性膝骨关节炎患者42例，男11例，女31例；年龄60-68岁，平均(63.98±2.54)岁，排除继发性骨关节炎和其他如类风湿关节炎等炎性关节炎。膝X射线片Kellgren-Lawrence(K-L)分级均为Ⅲ、Ⅳ级。根据胫股关节受累情况，分为单间室骨关节炎组和双间室骨关节炎组。单间室骨关节炎组纳入患者23例，双间室骨关节炎组纳入患者19例，患者具体资料见表1。

42例患者行膝关节置换术时留取滑膜标本及关节液标本。该研究通过苏州市立医院伦理委员会审核，并经过患者知情同意。
1.4 方法
1.4.1 采用RT-PCR方法检测滑膜组织中骨桥蛋白的表达 ①术中取得病变滑膜组织后迅速送至实验室，于超净台内将滑膜组织剪成1 mm×1 mm×1 mm小块后立即进行RNA抽提。取15 mg滑膜组织，采用Omega (Norcross，GA，USA)公司E.Z.N.A.® HP Total RNA Kit 试剂盒抽提RNA，实验步骤按说明书操作。②cDNA合成：采用Takara公司(Kyoto，JP) Reverse Transcriptase M-MLV，按说明书操作，得到以Oligo dT为引物，随机合成的cDNA。③骨桥蛋白定量PCR检测：采用SYRB green法(Takara，Kyoto，JP)，以HPRT作为内参照。骨桥蛋白基因引物序列：5’-GCC GAC CAA GGA AAA CTC ACT-3’ (forward)；5’-TGC CTA GGA GGC AAA AGC A-3’ (reverse)。HPRT基因引物序列：5’-CCT GGC GTC GTG ATT AGT GA-3’ (forward)；5’-CGA GCA AGA CGT TCA GTC CT-3’ (reverse)。引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。反应体系为cDNA 1 μL，上游引物0.2 μL，下游引物0.2 μL，Rox 0.2 μL，SYBR Green 5 μL，DEPC水3.4 μL。引物终浓度为20 nmol/L，反应总体积为10 μL。定量PCR仪为ABI 7900 Sequence Detection System(Applied Biosystem，Foster City，CA)。反应条件为：第一步95 ℃预变性10 min，第二步为95 ℃ 15 s，第三步 55 ℃ 1 min；第二到第三步循环40次。PCR产物的纯度通过熔解曲线来分析。每个样品组内各种基因转录水平的表达阀值(Ct)根据内参(HPRT)的表达量进行标准化。标准化后的值(∆Ct)经变量变换(2-∆Ct)后可反映骨桥蛋白基因在细胞中表达丰度。每个滑膜组织标本检测3次，取平均值。
1.4.2 采用ELISA方法检测关节液中骨桥蛋白水平关节滑液离心去除细胞及关节残存物后，立即置入-80 ℃冷藏保存直至检测。采用Assay Designs公司人骨桥蛋白酶联免疫测定试剂盒，按照说明书操作。取出预先包被抗体的96孔板，洗涤2次，甩干液体后，每孔加入100 μL骨桥蛋白标准品或样品，37 ℃孵育1 h，孵育结束后洗涤7次，甩干液体后，每孔加100 μL标记抗体(空白孔除外)，4 ℃孵育30 min，孵育结束后洗涤9次，甩干液体后，每孔加100 μL显色液，室温暗处孵育30 min，每孔加100 μL终止液，450 nm波长酶标仪读数。每个滑液标本检测3次，取平均值。
1.4.3 滑膜成纤维样细胞转录组、蛋白质组检测
(1)人膝骨关节炎滑膜成纤维样细胞体外培养与鉴定：获取关节炎患者膝关节滑膜标本后，应用酶消化法培养人膝骨关节炎滑膜成纤维样细胞。具体方法：于超净台内将滑膜组织剪成1 mm×1 mm×1 mm小块，加入适量D-Hank’s液，轻晃后静置3-5 min；待组织块沉底后，弃去上清液，加入适量的高糖DMEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清和抗生素)，轻轻晃动，使成糊状，倒入培养瓶中，并将培养瓶倒置，即有组织块的面在上，空白面在下，于37 ℃、体积分数为5%CO2条件下放置1-3 h；随后，正置培养瓶，轻轻加入高糖DMEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清和抗生素)，以液面没过组织块为宜，动作需轻，防止组织块被吹起，继续于37 ℃、体积分数为5%CO2条件下培养；约2 d后，逐渐有细胞从组织块周围爬出，待细胞长满后，可用胰酶消化细胞，并弃去剩余组织块，所得细胞即滑膜成纤维细胞。
成纤维样细胞传4-6代，采用抗Vimentin抗体作免疫组化染色鉴定：镜下见细胞呈三角形、长梭形，细胞核呈卵圆形，位于细胞中央，核仁清晰，细胞周围可见分泌物聚集。细胞免疫组织化学染色反应示A型细胞Vimentin阴性；B型细胞Vimentin阳性，应用 ABC免疫酶染色法鉴定滑膜细胞活性。

(2)骨桥蛋白siRNA的构建：①siRNA的设计、合成：在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中寻找人骨桥蛋白的序列全长，根据文献报道和ELBASHIR等[9]提出的目标序列的选取原则，利用网上设计工具进行目标序列的筛选，使用BLAST将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列，确定人骨桥蛋白的siRNA目标基因序列，设计骨桥蛋白的siRNA序列，正义链序列：5’-GAA ACU CCC UGU AAA CUA A dTdT-3’；反义链序列：5’-UAA GUU UAC AGG GAG UUU C dTdT-3’。为监测siRNA的转染效率，合成带荧光标记的序列非特异性siRNA，正义链序列：5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG U dTdT-3’；反义链序列：5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA A dTdT-3’。②siRNA/lipofectamine复合物制备：250 μL无血清DMEM中加入siRNA 20 μmol/L 8 μL，室温孵育5 min；另在250 μL无血清DMEM中加入LipofectamineTM2000 5 μL，室温孵育5 min，将上述两种溶液混匀，室温孵育 20 min，制备 siRNA/lipofectamine复合物。
(3)转录组和蛋白质组检测：取第4-6代滑膜成纤维样细胞进行实验，先用含体积分数为1%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养24 h，从而使细胞同步化出现在非活动期，然后继续用含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基孵育并予以分组：空白对照组、骨桥蛋白siRNA干预组，其中骨桥蛋白siRNA干预组细胞用骨桥蛋白siRNA干预24 h，通过RT-PCR检测siRNA的干扰效率，并且对样品进行转录组检测和蛋白质组检测。
转录组检测：样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠，通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集真核生物的mRNA，随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA，纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。用Illumina HiSeq平台进行测序。
蛋白质组检测：样品加入4倍体积裂解缓冲液(8 mol/L尿素、1%蛋白酶抑制剂)进行超声裂解，4 ℃ 12 000×g离心10 min，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，利用BCA试剂盒(沈阳万类生物WLA004a)进行蛋白浓度测定。根据浓度测定结果取等量蛋白，用8 mol/L尿素按体积最大的样品调整至体积一致，加入终浓度5 mmol/L DTT于56 ℃孵育30 min，冷却至室温后加入终浓度11 mmol/L IAM室温避光孵育15 min。将烷基化好的样本转移至超滤管，室温12 000×g离心10 min，并用置换buffer置换尿素3次，按照1∶50的比例(蛋白酶∶蛋白)加入胰蛋白酶液，37 ℃酶解过夜，室温12 000×g离心10 min回收肽段，再用酶解buffer回收肽段1次，合并2次肽段溶液。用液相色谱流动相A相溶解肽段后使用EASY-nLC 1200超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流动相B为含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离，然后使用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪进行分析。离子源电压设置为2.0 kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1 550 m/z，扫描分辨率设置为60 000；二级质谱扫描范围则固定起点为100 m/z，二级扫描分辨率设置为15 000。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序。
1.4.4 生物信息学分析方法
(1)转录组基因差异表达筛选：对于有生物学重复的样本，DESeq适用于进行样品组间的差异表达分析，获得两个生物学条件之间的差异表达基因集；对于没有生物学重复的样本，使用EBSeq进行差异分析。在差异表达基因检测过程中，将差异倍数≥1.4且错误发现率< 0.05作为筛选标准。差异倍数(fold change)表示两样品(组)间表达量的比值。错误发现率(false discovery rate，FDR)是通过对差异显著性P值进行校正得到的。由于转录组测序差异表达分析是对大量的基因表达值进行独立的统计假设检验，会存在假阳性问题，因此在进行差异表达分析过程中，采用了公认的Benjamini-Hochberg校正方法对原有假设检验得到的显著性P值进行校正，并最终采用错误发现率作为差异表达基因筛选的关键指标。
(2)蛋白差异表达分析：通过质谱分析技术检测蛋白在每个样本中对应信号丰度，通过非标定量计算方法得到蛋白在每个样本中的LFQ intensity，根据不同样本之间蛋白LFQ intensity得到每个样本的相对定量值。第一步计算比较组中两个样本间蛋白的差异表达量，首先计算出每个样本在多次重复中定量值的平均值，然后再计算两个样本之间平均值的比值，该比值作为最终的差异表达量；第二步计算该蛋白在两个样本中的差异表达显著性P值，首先将各个样本的相对定量值取log2(以使得数据符合正态分布)，然后用双样本双尾t检验方法计算P值。当P < 0.05时，以差异表达量变化超过1.5作为显著上调的变化阈值，小于1.0/1.5作为显著下调的变化阈值。
根据生物信息学分析结果，进一步采用Western blot验证蛋白质组检测结果。统计比较炎症相关基因(白细胞介素、趋化因子、肿瘤坏死因子)在空白对照组和骨桥蛋白siRNA干预组的表达。
1.5 主要观察指标 ①滑膜组织中骨桥蛋白基因的表达；②关节液中骨桥蛋白水平；③骨桥蛋白敲减前后膝关节滑膜细胞的转录组和蛋白质组的变化。
1.6 统计学分析应用SPSS 17.0统计软件(SPSS公司，美国)进行统计学分析。单间室骨关节炎组与双间室骨关节炎组年龄、体质量指数比较采用Student’s t检验，性别、K-L分级比较采用卡方检验。单间室骨关节炎组与双间室骨关节炎组关节滑液中骨桥蛋白水平比较、滑膜组织中骨桥蛋白表达比较均采用Student’s t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

长期以来，人们对骨关节炎发病机制的研究集中于关节软骨和软骨细胞的病理改变，对关节滑膜的炎性改变未予重视，甚至认为其只是骨关节炎发病过程中的继发性改变。而随着近些年研究的深入[10-17]，发现关节滑膜炎症产生的炎性递质既可以直接作用于关节软骨，还可以作用于调节关节软骨代谢的一些细胞因子和蛋白酶，一方面直接导致关节软骨结构发生改变，破坏和降解软骨基质，另一方面，使一些细胞因子和蛋白酶发生理化作用，加速关节退变的进程。
既往对于骨关节炎的研究，按照KL分级进行分组，可以代表不同程度的骨关节炎，但是正常膝关节和轻度关节炎关节液量较少，为0.3-3 mL，很难通过膝关节穿刺抽液获取足够的样本开展研究，并且正常膝关节和轻度关节炎病例通常不需要手术，很少有机会获取关节滑膜。既往有报道按照单间室骨关节炎和双间室骨关节炎进行分组开展研究[18]。虽然目前尚无法得知，单间室关节炎与双间室关节炎是骨关节炎的不同阶段，还是骨关节炎的不同亚型。但是无论在哪种情况，单间室骨关节炎的关节炎严重程度轻于双间室骨关节炎。由于这类患者比较容易取得关节滑膜及关节液，所以进行了此次研究。
研究发现，膝关节滑膜和关节液中骨桥蛋白水平随着骨关节炎程度加重而升高，这提示骨桥蛋白可能是骨关节炎发病过程中一种重要功能因子，但骨桥蛋白对骨关节炎病程的影响尚不明确。通过分析炎症相关基因(白细胞介素、趋化因子、肿瘤坏死因子)在空白对照组和骨桥蛋白siRNA干预组的表达，发现siRNA干预后炎症相关基因表达降低，结果与此前骨桥蛋白在类风湿关节炎软骨细胞中表现出促炎效应相一致[19]。
另外，研究发现，在骨桥蛋白siRNA干扰后进行蛋白质组与转录组检测，发现IGFBP3共同下降。胰岛素样生长因子在软骨细胞生长和发育中发挥着重要的调控作用。文献报道，胰岛素样生长因子可以促进软骨细胞表型维持，可以抑制软骨细胞去分化，促进再分化[20]，胰岛素样生长因子可以保持软骨细胞的特异表型并且抑制了程序性凋亡[21]，还可以促进软骨细胞合成细胞外基质[22]。IGFBPs则具有对抗细胞增殖的作用。IGFBPs通过与胰岛素样生长因子Ⅰ和胰岛素样生长因子Ⅱ结合，减少胰岛素样生长因子与其相应的受体相结合，从而发挥调控作用。IGFBPs是胰岛素样生长因子功能和转运的调控者。在软骨发育过程中，胰岛素样生长因子Ⅰ促进细胞外软骨基质表达，而IGFBP2抑制细胞外软骨基质表达[23]。针对人的正常软骨和骨关节炎软骨的IGFBPs研究中，发现IGFBP3水平随着骨关节炎病变程度加重而增高[24]。慢性骨关节患者软骨细胞分泌的IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5均明显升高[25]。
根据研究结果，作者推测，骨桥蛋白对骨关节炎产生不利影响，其机制可能是通过促炎作用和IGFBP3对软骨的负面作用。
该研究的不足之处：蛋白质组学研究虽然鉴定出3 608个蛋白，但是差异表达蛋白与差异表达RNA数量较少。考虑可能的原因如下：用siRNA干扰后，培养24 h的时间较短，而从RNA转录到蛋白表达所需时间较长，因此蛋白水平差异表现不明显，后续进一步研究可能解决以上问题。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

敲减骨桥蛋白的膝关节滑膜细胞转录组和蛋白质组定量分析

Quantitative analysis of transcriptome and proteome of knee joint synovial cells with osteopontin knockdown

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