电针干预脑缺血再灌注损伤模型大鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/半胱天冬氨酸蛋白酶1表达的变化

doi:10.12307/2022.122

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (5): 749-755.doi: 10.12307/2022.122

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

电针干预脑缺血再灌注损伤模型大鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/半胱天冬氨酸蛋白酶1表达的变化

董苗苗1，2，赖涵2，李曼玲1，许秀洪2，罗梦2，王文豪1，2，周国平1，2

1南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515；2 南方医科大学中西医结合医院，广东省广州市 510315

收稿日期:2021-03-29 修回日期:2021-04-02 接受日期:2021-05-07 出版日期:2022-02-18 发布日期:2021-11-02
通讯作者: 周国平，博士，教授，主任医师，南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515；南方医科大学中西医结合医院，广东省广州市 510315
作者简介:董苗苗，女，1994年生，2019年南方医科大学毕业，硕士，主要从事中风病的基础及临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81674048)

Effect of electroacupuncture on expression of nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3/cysteinyl aspartate specific proteinase 1 in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury

Dong Miaomiao1, 2, Lai Han2, Li Manling1, Xu Xiuhong2, Luo Meng2, Wang Wenhao1, 2, Zhou Guoping1, 2

1School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; 2Integrated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510315, Guangdong Province, China

Received:2021-03-29 Revised:2021-04-02 Accepted:2021-05-07 Online:2022-02-18 Published:2021-11-02
Contact: Zhou Guoping, MD, Professor, Chief physician, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; Integrated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510315, Guangdong Province, China
About author:Dong Miaomiao, Master, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; Integrated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510315, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81674048 (to ZGP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脑缺血再灌注损伤：脑组织对缺血缺氧较为敏感，缺血后出现神经功能受损，然而缺血一定时间恢复血流再灌注供应后，反而出现继发性组织损伤，较缺血时加重，脑缺血再灌注损伤的过程由多种病理因素参与并相互作用，最终造成多系统功能障碍。
核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/半胱天冬氨酸蛋白酶1：炎症反应是参与脑缺血再灌注损伤过程的病理因素之一，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体在缺血再灌注诱导的脑损伤中被组装激活，继而活化半胱天冬氨酸蛋白酶1蛋白酶，切割炎症分子前体，诱导炎症级联反应，造成脑缺血再灌注后细胞焦亡，加重脑缺血再灌注损伤。

背景：对于脑缺血/再灌注损伤目前尚无有效的治疗方法，缓解脑缺血/再灌注损伤级联损伤对于治疗方法的探索至关重要。电针基于传统针灸和电疗法，可有效缓解缺血性脑卒中导致的神经功能损伤症状。
目的：基于核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/半胱天冬氨酸蛋白酶1通路，探讨电针对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用。
方法：48只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组、抑制剂组，每组12只，后3组应用线栓法制备脑缺血再灌注模型。半胱天冬氨酸蛋白酶1抑制剂用Z-YVAD-FMK干预，穴位选取“合谷”“尺泽”“三阴交”“足三里”。采用神经行为学评分评定神经功能症状，2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色法观察脑组织梗死情况，电镜观察神经元焦亡，荧光定量PCR和蛋白质印迹检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3及半胱天冬氨酸蛋白酶1表达，免疫荧光染色观察小胶质细胞水平，酶联免疫吸附实验检测白细胞介素1β、白细胞介素18及肿瘤坏死因子α表达水平。
结果与结论：①与模型组比较，电针组和抑制剂组的神经功能缺损评分、脑组织梗死体积减少(P均< 0.05)；②与模型组比较，电针组和抑制剂组的神经元焦亡减轻；③与模型组比较，电针组和抑制剂组的小胶质细胞减少，白细胞介素1β、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α表达水平降低(P均< 0.05)；④与模型组比较，电针组和抑制剂组核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3及半胱天冬氨酸蛋白酶1表达水平降低 (P均< 0.05)；⑤表明电针可通过减少小胶质细胞水平、减少炎症反应、下调核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/半胱天冬氨酸蛋白酶1表达、减轻脑缺血再灌注损伤大鼠的神经元焦亡，发挥神经保护作用。
缩略语：核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白：nucleotide-binding oligomerization domain，leucine rich repeat and pyrin domain containing proteins，NLRP；半胱天冬氨酸蛋白酶：cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase；2，3，5-氯化三苯基四氮唑：2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC

https://orcid.org/0000-0002-4613-4384 (周国平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 电针, 脑缺血再灌注损伤, 小胶质细胞, 细胞焦亡, 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3, 半胱天冬氨酸蛋白酶1

Abstract: BACKGROUND: There is currently no effective treatment for cerebral ischemia/reperfusion injury, and for the exploration of treatments, it is crucial to mitigate cerebral ischemia/reperfusion injury cascade damage. Electroacupuncture can alleviate cerebral ischemia/reperfusion injury.
OBJECTIVE: To explore the neuroprotective effect of electroacupuncture on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats based on nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3 (NLRP3)/cysteinyl aspartate specific proteinase 1 (Caspase-1) pathway.
METHODS: Forty-eight Sprague-Dawley rats were randomly divided into a sham group, a model group, an electroacupuncture group and an inhibitor group, with 12 rats in each group. Animal models of cerebral ischemia/reperfusion injury were made in the latter three groups using the suture-occluded method. Caspase-1 inhibitor was intervened with Z-YVAD-FMK, and acupoints were selected as “Hegu,” “Chize,” “Sanyinjiao” and “Zusanli.” Zea longa method was used to evaluate the neurological symptoms. 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride staining was used to observe the condition of cerebral infarction. Electron microscope was used to observe the pyroptosis of neurons. Fluorescence quantitative PCR and western blot were used to detect the expression of NLRP3 and Caspase-1. Immunofluorescence staining was used to observe the level of microglia. Enzyme linked immunosorbent assay was used to detect the levels of interleukin-1β, interleukin-18 and tumor necrosis factor-α.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the model group, the neurological deficit score and infarct volume of brain tissue were decreased in the electroacupuncture group and inhibitor group (all P < 0.05). (2) Compared with the model group, pyroptosis of the cells was reduced in the electroacupuncture group and inhibitor group. (3) Compared with the model group, the number of microglia and the expression of interleukin-1β, interleukin-18 and tumor necrosis factor-α were decreased in the electroacupuncture group and inhibitor group (all P < 0.05). (4) Compared with the model group, the expression levels of NLRP3 and Caspase-1 were decreased in the electroacupuncture group and inhibitor group (all P < 0.05). In conclusion, electroacupuncture can reduce the level of microglia, reduce inflammatory reactions, and down-regulate the expression of NLRP3/Caspase-1, so as to reduce neuronal pyroptosis and exert a neuroprotective effect in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury.

Key words: electroacupuncture, cerebral ischemia/reperfusion injury, microglia, pyroptosis, nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3, cysteinyl aspartate specific proteinase 1

中图分类号:

董苗苗, 赖涵, 李曼玲, 许秀洪, 罗梦, 王文豪, 周国平. 电针干预脑缺血再灌注损伤模型大鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/半胱天冬氨酸蛋白酶1表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 749-755.

Dong Miaomiao, Lai Han, Li Manling, Xu Xiuhong, Luo Meng, Wang Wenhao, Zhou Guoping. Effect of electroacupuncture on expression of nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3/cysteinyl aspartate specific proteinase 1 in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(5): 749-755.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 48只SD大鼠随机分组，操作过程中若大鼠死亡，随机补充缺失大鼠进行造模或干预，共48只大鼠进入结果分析。
2.2 各组大鼠神经功能缺损评分脑缺血再灌注后，大鼠表现出不同程度的神经功能缺损行为表现。与假手术组比较，模型组神经功能缺损评分升高(P < 0.05)；与模型组比较，电针组和抑制剂组神经功能缺损评分降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.3 各组大鼠脑梗死体积大鼠脑缺血再灌注后，经TTC染色，梗死区脑组织呈现白色。与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积增加(P < 0.05)；与模型组比较，电针组和抑制剂组SD大鼠脑梗死体积减少(P < 0.05)，差异有显著性意义，见图2。

2.4 各组大鼠小胶质细胞变化与假手术组比较，模型组离子钙结合衔接分子1相对免疫荧光强度升高，离子钙结合衔接分子1表达水平升高，提示小胶质细胞增多(P < 0.05)；与模型组比较，电针组离子钙结合衔接分子1相对免疫荧光强度降低，离子钙结合衔接分子1表达水平降低，提示小胶质细胞减少(P < 0.05)，差异有显著性意义，见图3。

2.5 各组大鼠细胞焦亡变化电镜下观察各组大鼠海马区神经元形态变化，假手术组的细胞形态结构正常；在模型组中，细胞超微结构形态发生改变，细胞膜完整性丧失，胞内存在大面积水肿区，细胞核局部核膜凹陷模糊，异染色质固缩增多，分布不均匀并聚集核膜周围；胞质内细胞器减少，线粒体及粗面内质网有明显扩张；电针组和抑制剂组细胞形态特征较模型组改善，核膜仍存在轻微凹陷，但染色质固缩减少，肿胀扩张的细胞器如线粒体、粗面内质网等数量减少，见图4。

2.6 各组大鼠NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表达与假手术组比较，模型组NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA的表达水平升高(P < 0.05)；与模型组比较，电针组和抑制剂组的NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表达水平降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.7 各组大鼠NLRP3和Caspase-1蛋白表达与假手术组比较，模型组NLRP3和Caspase-1的表达水平升高(P < 0.05)；而在电针组和抑制剂组中NLRP3和Caspase-1的表达水平低于模型组(P < 0.05)，见图6。

2.8 各组大鼠白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α表达与假手术组比较，模型组白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α的表达水平升高(P < 0.05)；与模型组比较，电针组和抑制剂组的白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α表达水平降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

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引言

脑卒中是全球范围内死亡和致残的主要病因之一[1]，缺血性脑卒中占脑卒中的87%，其发病率呈持续上升趋势[2]，因其高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率的特点，给患者的家庭和社会带来严重的社会和经济负担[3]。目前有效的治疗方法是尽快恢复血流灌注，随后血管修复和组织复氧。而脑缺血一定时间后快速再灌注时出现的氧化应激、线粒体失调、白细胞浸润、血脑屏障破坏等消除了血流恢复的有利作用，引起神经炎症和神经元丢失，最终导致组织损伤加重[4]，此过程称为脑缺血/再灌注损伤[5]。
研究表明，细胞焦亡在脑缺血/再灌注损伤病理过程中充当重要角色[6]，并与上述机制相互作用，导致组织损伤加重。目前研究显示细胞焦亡参与了脑缺血再灌注后神经细胞损伤，海马区是脑缺血再灌注后细胞焦亡和炎症反应诱发继发性神经损伤的主要部位[7]。细胞焦亡是由Gasdermin介导的细胞程序性死亡，主要是Gasdermin E等在内的Gasdermin家族成员被多种Caspase剪切成片段，进而使细胞膜穿孔，破坏细胞完整性[8]。细胞焦亡的特点是细胞质膜迅速肿胀破裂，炎症小体形成，大量促炎症因子释放[9]，引发炎症反应。
核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain，leucine rich repeat and pyrin domain containing proteins，NLRP)家族中的NLRP3炎症小体是包含多种蛋白质的炎性复合体[10]，缺血再灌注诱导脑损伤后被激活，进一步活化半胱天冬氨酸蛋白酶 (cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族中 Caspase-1蛋白酶及多种炎症分子，加剧炎症反应，引起细胞焦亡，加重脑缺血再灌注损伤[11]。此外，炎症细胞因子如白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达升高[12]，导致白细胞和其他激活的炎症细胞浸润脑实质，诱导小胶质细胞活化，促炎细胞因子分泌增加，加剧氧化应激和血脑屏障损伤，造成严重脑损伤[13-14]。
对于脑缺血/再灌注损伤目前尚无有效的治疗方法，缓解脑缺血/再灌注损伤级联损伤对于治疗方法的探索至关重要。电针基于传统针灸和电疗法，目前被用作脑卒中防治的有效工具，可有效缓解缺血性脑卒中导致的神经功能损伤症状。研究显示，电针傍刺经筋结点与常规针刺治疗都可以改善缺血性卒中急性期上肢瘫痪[15]，头针联合电针可明显改善缺血性脑卒中后失语症患者的语言理解、表达及沟通能力[16]。基于电针对缺血性脑卒中的有效干预，以及细胞焦亡和小胶质细胞水平在脑缺血/再灌注损伤的重要作用，此次研究从神经炎症出发，对电针是否调节小胶质细胞水平，缓解神经元焦亡发挥缺血性脑卒中后脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用进行探讨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，单因素方差分析(One-Way ANOVA)、非参数检验Mann-Whiteney检验及Kruskal-Wallis检验。
1.2 时间及地点于2017年8月至2019年4月在南方医科大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物清洁级雄性SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2016-0041，体质量(250±10) g。饲以大鼠标准育成饲料，自由饮水，控制室内温度20-24 ℃，相对湿度65%-80%，12 h光-暗循环光照。实验方案经南方医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号：L2017216。
1.3.2 主要试剂及仪器戊巴比妥钠、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)染液(雷根生物技术有限公司)；caspase-1 inhibitor Z-YVAD-FMK、HRP标记山羊抗兔、HRP标记驴抗山羊、ELISA试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)；离子钙结合衔接分子1抗体(Servicebio公司)；一次性无菌针灸针(中国苏州医疗器械厂)；英迪kwd-808i全能脉冲电针仪(苏州天协针灸器械有限公司)；大鼠大脑立体定位仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)；Lightcy-cler 480II荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)；Nanodrop 2000核酸蛋白测定仪(赛默飞世尔中国公司)；酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；透射电子显微镜(FEI公司)；TI-SR倒置荧光显微镜(日本尼康公司)。
1.4 方法
1.4.1 分组与处理将48只雄性SD大鼠按随机数字表法随机分为假手术组、模型组、电针组、Caspase-1抑制剂组，每组12只。Caspase-1抑制剂组在模型制备前30 min于大鼠侧脑室注射10 μL Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK(溶于DMSO)。
1.4.2 模型制备采用大脑中动脉闭塞法制作大鼠脑缺血再灌注模型。方法如下：将SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠 (40 mg/kg)麻醉固定，备皮消毒，颈前行纵向切口，暴露分离左侧颈总、颈外及颈内动脉，结扎颈外动脉，血管夹暂时夹闭颈总及颈内动脉，在颈外动脉分叉处剪约45°斜向切口，将线栓从颈外动脉送至颈内动脉颅内段，遇到阻力时停止(18-20 mm)，固定线栓并去除血管夹。逐层缝合切口，栓塞2 h后，拔出线栓至颈外动脉处，进行缺血后再灌注。造模后SD大鼠单独饲养观察。

1.4.3 电针干预电针组在再灌注2 h后进行电针干预，取患侧(右侧)合谷、尺泽、三阴交、足三里进行电针干预[17-18]。采用一次性无菌针灸针针刺穴位后，连接电针仪，波型选择疏密波，频率5-10 Hz，以穴位周围组织轻微抖动为度，电压3-5 V，干预时间20 min。假手术组和模型组统一进行固定，不针刺。干预1次，在再灌注24 h后取材。

1.4.4 神经行为学评分大鼠清醒且生命体征平稳后，参照Zea Longa法评价神经功能缺损程度，具体评定标准见表1，其中1-3 分纳入实验组。

1.4.5 TTC染色每组取3只大鼠全脑组织制备冷冻切片 (2 mm)，置于2%TTC染液中，37 ℃恒温避光染色30 min，不时翻动切片使之均匀染色，30 min后取出切片，置于40 g/L多聚甲醛PBS中固定过夜，固定好的脑片取出晾干，脑梗死区显示白色，正常脑组织显示红色。采用Image J软件分析每层脑片梗死区面积，梗死区体积=梗死区面积之和×脑片厚度(2 mm)，计算各组梗死区体积百分比。梗死体积百分比(%)=梗死区体积/大脑半球体积×100%。
1.4.6 铀铅双染色每组取3只大鼠缺血侧海马区，置于2.5%戊二醛缓冲液中，4 ℃固定2-4 h，PBS漂洗，置于1%的锇酸中，室温固定2 h，PBS漂洗，脱水，渗透包埋，切片，用铀铅双染色，室温干燥过夜。将切片置于透射电镜下观察海马区神经元，采集图像分析。
1.4.7 荧光定量PCR 每组取3只大鼠缺血侧半球脑组织，分别用于荧光定量PCR，蛋白免疫印迹(Western Blot)和酶联免疫吸附实验(ELISA)。用于荧光定量PCR的组织样本中加入Trizol，反复吹打至无明显沉淀，离心取上清液，加入氯仿后混匀离心，吸取上层清液，加入等体积异丙醇混匀离心，离心后的白色沉淀即为总RNA，加入 DEPC水溶解，使用紫外分光光度仪检测RNA浓度及纯度。溶解后的RNA样品继续反转录，反转录后的cDNA进行荧光定量PCR反应。配置PCR反应体系，加入PCR引物，进行PCR扩增。结果以Ct值显示，采用2-∆∆Ct相对定量法计算mRNA相对表达量，以β-actin为内参。其中引物序列信息见表2。

1.4.8 蛋白质印迹每组取3只大鼠缺血侧脑组织研磨后，以蛋白裂解离心取上清液。参照BCA试剂盒说明书测定蛋白质浓度，变性蛋白备用，配胶，加样，湿转法转膜，PVDF膜置于封闭液中室温封闭1 h。加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST漂洗，加入二抗，室温下孵育1 h，TBST漂洗。避光等体积混合ECL A和B试剂，加入混匀的ECL溶液浸润PVDF膜反应，置于曝光仪中进行曝光，仪器扫描记录蛋白条带图像，采用Image J 软件分析条带灰度值。
1.4.9 免疫荧光染色每组取3只大鼠缺血侧脑组织，固定，制备石蜡切片，脱蜡水化，去除内源性酶，置于0.01 mol/L
柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复，封闭后，加入IBA一抗4 ℃孵育过夜，PBS冲洗，加入荧光标记的二抗，室温下避光孵育1 h，冲洗，用DAPI染色，室温下避光孵育 10 min。冲洗，抗荧光猝灭剂封固，切片置于荧光显微镜观察杏仁核染色情况，采用 Image J 软件分析相对免疫荧光强度。
1.4.10 酶联免疫吸附试验每组取3只大鼠缺血侧脑组织，研磨匀浆，离心取上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作分别检测白细胞介素1β、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α水平。
1.5 主要观察指标 ①神经功能缺损评分；②脑梗死体积；③神经元焦亡形态；④小胶质细胞水平；⑤NLPR3、Caspase-1及mRNA水平；⑥白细胞介素1β、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α水平。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行数据分析，各种实验结果数值采用x±s表示。数据符合正态分布，则使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。进行方差齐性检验，若方差齐，则采用LSD分析；若方差不齐，则采用Dunnett’s T3进行多重比较。对不符合正态分布的数据，采用非参数检验Mann-Whiteney检验两两比较，Kruskal-Wallis检验多重比较。P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

缺血性脑卒中后脑内代谢供需失衡导致组织出现严重缺氧和微血管功能障碍，血流恢复再灌注供应后，脑组织损伤程度继发性加重[19]，此过程为脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤的机制复杂，目前研究主要涉及钙离子超载[20]、兴奋性氨基酸毒性[21]、自由基生成[22]、一氧化氮损伤[23]、细胞凋亡等[24-25]。作者前期研究证实，电针通过调控MAPK通路减少细胞凋亡，减轻脑缺血再灌注损伤，从而发挥脑保护作用[26-28]。电针对缺血性脑卒中的临床干预疗效显著[29-30]，其机制目前尚未明确，此次研究以脑缺血再灌注损伤SD大鼠为模型，继续探讨电针对脑缺血再灌注损伤的作用及机制。
中医认为，缺血性脑卒中的发病机制主要在于阴阳失调、气血逆乱、经脉痹阻，导致脏腑的功能发生紊乱[31]。基于《素问•阴阳别论篇》提出“三阳三阴发病，为偏枯痿易，四肢不举”。《素问•阴阳应象大论》中指出“故善用针者，从阴引阳，从阳引阴”，根据经脉阴阳表里关系进行配穴治疗中风。阳明经为多气多血之经，“合谷”为手阳明大肠经穴，是大肠经气血汇聚的地方，故选用此穴以疏风开窍，宣通气血。与相表里的手太阴肺经合穴“尺泽”相配，共同调节阴阳气血。“足三里”是足阳明胃经的合穴，经气充盈，能通经活络。与联络足三阴经气血的“三阴交”相配，共同调和阴阳，行气活血。因而此次研究穴位选择为“合谷、尺泽”“足三里、三阴交”两组配穴，选穴同时也结合导师周国平教授所创的“全经针刺法”，“全经针刺法”是综合陈玉老中医、王哲天教授及严洁教授治疗中风偏瘫的经验，结合针灸学理论、经脉气血多少理论及现代康复学原理所创立的一种专用于治疗中风偏瘫的针刺方法，以阴阳表里相配为依据选穴[32]。
此次研究以电针干预脑缺血再灌注损伤大鼠合谷、尺泽、三阴交、足三里，采用 Zea Longa法进行神经功能缺损评定，结果显示电针可减轻SD大鼠脑缺血再灌注造成神经功能缺损症状。TTC是一种对光比较敏感的脂溶性复合物，可与正常组织中的琥珀酸脱氢酶结合发生反应，从而使正常组织呈现红色或粉红色，由于在缺血缺氧情况下，组织中脱氢酶的活性会下降，所以缺血组织不能与TTC结合反应，故而呈现出白色。此次研究采用TTC染色法检测电针对脑缺血再灌注损伤SD大鼠梗死体积影响，结果显示，电针干预后脑缺血再灌注损伤SD大鼠脑梗死体积百分比降低。以上结果表明，电针可减少脑缺血再灌注损SD大鼠梗死体积，有效缓解脑缺血再灌注损伤SD大鼠神经缺损症状。
新近研究显示，细胞焦亡与脑缺血再灌注损伤病理损伤及后期神经缺损症状形成密切相关[33]，经典的细胞焦亡信号通路通过活化Caspase-1介导[34]。在脑缺血发生损伤后，NLRP3炎症小体被组装激活，Caspase-1前体分裂成活性片段，裂解的Caspase-1诱导成熟的促炎细胞因子白细胞介素1β和白细胞介素18释放，启动或放大不同的下游信号通路，诱导细胞发生肿胀和渗透溶解，加剧炎症反应，加重脑缺血再灌注损伤[35]。此次研究采用透射电镜观察海马神经元超微结构变化，显示脑缺血再灌注后部分细胞内水肿，细胞肿胀破裂，胞膜完整性丧失，细胞器明显扩张，异染色质固缩增多。经电针和Caspase-1抑制剂干预后，神经元焦亡现象得到了改善。炎症小体是细胞内模式识别受体参与组装的多种蛋白组成的大分子复合体，它在调节机体炎症、维持固有免疫应答中具有重要作用，其中NLRP3炎症小体是分布最为广泛，能被多种刺激物活化的炎症小体亚型[36]，一些分子和细胞效应被认为是NLRP3炎症小体激活的触发剂，包括K+外流、Ca2+信号、活性氧、线粒体功能失调和溶酶体破裂[37]。炎症小体可以激活炎性胱天蛋白酶并激活白细胞介素1家族细胞因子，Caspase-1是与炎症小体相关的最主要的炎性半胱天冬氨酸蛋白酶之一。研究显示，活化的Caspase-1具有剪切细胞焦亡效应蛋白消皮素D的功能，使消皮素D的N末端结构域释放。N-消皮素D通过与细胞膜上内页的磷脂酰丝氨酸和磷酸肌醇结合，在细胞膜上打孔，同时该通道造成胞外Na+、Ca2+内流，使细胞肿胀，在打孔处形成大泡，细胞内容物释放到细胞外，引起炎症反应[38]。Caspase除了剪切消皮素D，还可以剪切白细胞介素1β前体和白细胞介素18前体，促进其成熟，细胞死亡后白细胞介素1β和白细胞介素18会释放到细胞外[39]。此次研究采用荧光定量PCR和蛋白质印迹检测Caspase-1和NLRP3的表达，结果显示以电针和Caspase-1抑制剂干预后，Caspase-1和NLRP3的表达水平较模型组下降，表明电针可以下调NLRP3/Caspase-1表达，减少神经元焦亡，发挥神经保护作用。此次研究以Caspase-1抑制剂干预后，NLRP3的mRNA和蛋白表达均有下降趋势，考虑可能为Caspase-1的不可逆抑制，减少了细胞焦亡发生，减轻细胞外Na+、Ca2+内流，减少了炎症递质释放和炎症反应，从而影响了NLRP3的激活和表达。
小胶质细胞是大脑中先天免疫系统的常驻吞噬细胞，其激活触发先天和适应性免疫反应，包括促炎因子的释放，对中枢神经系统炎症反应至关重要[40]。研究显示，脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞被激活，炎症递质的分泌和最终导致继发性脑损伤的炎症级联反应，包括神经元坏死、血脑屏障破坏、脑水肿和氧化应激反应，加剧脑缺血再灌注损伤[41]。离子钙结合衔接分子1是小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白，在小胶质细胞和巨噬细胞的活化过程中表达升高[42]。此次研究采用离子钙结合衔接分子1标记小胶质细胞进行免疫荧光染色，结果提示电针干预后，模型组离子钙结合衔接分子1水平增加，这与以往的研究结果一致[43]。电针组离子钙结合衔接分子1水平较模型组降低，提示电针可调节小胶质细胞水平，在脑缺血再灌注损伤模型中发挥神经保护作用。同时，此次研究采用酶联免疫吸附试验检测脑内炎症因子水平，结果显示电针干预可以下调白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α的表达，表明电针可减少脑缺血再灌注后炎症反应发生。
基于以上，此次研究得出结论，电针可缓解脑缺血再灌注损伤SD大鼠的神经缺损症状和脑梗死体积，减轻神经元焦亡和神经炎症从而发挥神经保护作用，其机制可能与下调NLRP3/Caspase-1相关。此次研究的不足之处在于使用的标记物没有区分小胶质细胞表型，促进向抗炎表型的转换可能是未来重要的研究方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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文题释义：#br# 脑缺血再灌注损伤：脑组织对缺血缺氧较为敏感，缺血后出现神经功能受损，然而缺血一定时间恢复血流再灌注供应后，反而出现继发性组织损伤，较缺血时加重，脑缺血再灌注损伤的过程由多种病理因素参与并相互作用，最终造成多系统功能障碍。#br# 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/半胱天冬氨酸蛋白酶1：炎症反应是参与脑缺血再灌注损伤过程的病理因素之一，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体在缺血再灌注诱导的脑损伤中被组装激活，继而活化半胱天冬氨酸蛋白酶1蛋白酶，切割炎症分子前体，诱导炎症级联反应，造成脑缺血再灌注后细胞焦亡，加重脑缺血再灌注损伤。

#br# 背景：对于脑缺血/再灌注损伤目前尚无有效的治疗方法，缓解脑缺血/再灌注损伤级联损伤对于治疗方法的探索至关重要。电针基于传统针灸和电疗法，可有效缓解缺血性脑卒中导致的神经功能损伤症状。#br# 目的：基于核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/半胱天冬氨酸蛋白酶1通路，探讨电针对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用。#br# 方法：48只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组、抑制剂组，每组12只，后3组应用线栓法制备脑缺血再灌注模型。半胱天冬氨酸蛋白酶1抑制剂用Z-YVAD-FMK干预，穴位选取“合谷”“尺泽”“三阴交”“足三里”。采用神经行为学评分评定神经功能症状，2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色法观察脑组织梗死情况，电镜观察神经元焦亡，荧光定量PCR和蛋白质印迹检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3及半胱天冬氨酸蛋白酶1表达，免疫荧光染色观察小胶质细胞水平，酶联免疫吸附实验检测白细胞介素1β、白细胞介素18及肿瘤坏死因子α表达水平。#br# 结果与结论：①与模型组比较，电针组和抑制剂组的神经功能缺损评分、脑组织梗死体积减少(P均< 0.05)；②与模型组比较，电针组和抑制剂组的神经元焦亡减轻；③与模型组比较，电针组和抑制剂组的小胶质细胞减少，白细胞介素1β、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α表达水平降低(P均< 0.05)；④与模型组比较，电针组和抑制剂组核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3及半胱天冬氨酸蛋白酶1表达水平降低 (P均< 0.05)；⑤表明电针可通过减少小胶质细胞水平、减少炎症反应、下调核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/半胱天冬氨酸蛋白酶1表达、减轻脑缺血再灌注损伤大鼠的神经元焦亡，发挥神经保护作用。

缩略语：核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白：nucleotide-binding oligomerization domain，leucine rich repeat and pyrin domain containing proteins，NLRP；半胱天冬氨酸蛋白酶：cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase；2，3，5-氯化三苯基四氮唑：2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC

https://orcid.org/0000-0002-4613-4384 (周国平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

电针干预脑缺血再灌注损伤模型大鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/半胱天冬氨酸蛋白酶1表达的变化

Effect of electroacupuncture on expression of nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3/cysteinyl aspartate specific proteinase 1 in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury

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