川芎嗪呋咱拼合物保护肾缺血再灌注损伤模型小鼠的作用及机制

doi:10.12307/2022.034

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (2): 205-210.doi: 10.12307/2022.034

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川芎嗪呋咱拼合物保护肾缺血再灌注损伤模型小鼠的作用及机制

李万海1，董宇航2，施超1，姜亦瑶1，3，刘戈1，刁文杰1，吴振1

1蚌埠医学院第一附属医院心脏外科，安徽省蚌埠市 233000；2安徽医科大学药学院，安徽省合肥市 230031；3南开大学医学院，天津市 300071

收稿日期:2021-01-22 修回日期:2021-01-31 接受日期:2021-02-23 出版日期:2022-01-18 发布日期:2021-10-27
通讯作者: 施超，博士，主任医师，蚌埠医学院第一附属医院心脏外科，安徽省蚌埠市 233000
作者简介:李万海，男，1990年生，福建省政和县人，汉族，2021年蚌埠医学院毕业，硕士，主要从事心脏术后急性肾损伤研究。董宇航，男，2000年生，安徽省怀宁县人，汉族，安徽医科大学在读学士。
基金资助:
安徽高校省级自然科学研究(1804h08020280)，项目负责人：施超；国家自然科学基金(81800214)，项目负责人：姜亦瑶；安徽省自然科学基金(1808085QH236)，项目负责人：姜亦瑶；蚌埠医学院转化医学重点专项(BYTM2019041)，项目负责人：刘戈

Ligustrazine furoxan complex protects against renal ischemia-reperfusion injury in mice

Li Wanhai1, Dong Yuhang2, Shi Chao1, Jiang Yiyao1, 3, Liu Ge1, Diao Wenjie1, Wu Zhen1

1Department of Cardiac Surgery, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233000, Anhui Province, China; 2School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230031, Anhui Province, China; 3School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China

Received:2021-01-22 Revised:2021-01-31 Accepted:2021-02-23 Online:2022-01-18 Published:2021-10-27
Contact: Shi Chao, MD, Chief physician, Department of Cardiac Surgery, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233000, Anhui Province, China
About author:Li Wanhai, Master, Department of Cardiac Surgery, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233000, Anhui Province, China Dong Yuhang, School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230031, Anhui Province, China
Supported by:
Province-level Natural Science Research in Anhui Universities, No. 1804h08020280 (to SC); National Natural Science Foundation of China, No. 81800214 (to JYY); Anhui Natural Science Foundation, No. 1808085QH236 (to JYY); Key Special Translational Medicine Project of Bengbu Medical College, No. BYTM2019041 (to LG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
川芎嗪呋咱拼合物：课题组合成的一种化合物，该化合物在动物体内可以降解为一分子的川芎嗪和一氧化氮，同时发挥川芎嗪和一氧化氮两种物质的药物作用。
肾缺血再灌注损伤：是肾组织缺血后重新获得血流灌注和(或)氧供后，缺血的肾组织并未恢复其功能，相反细胞功能代谢障碍及结构破坏相比较于缺血时更加严重，使得肾功能进一步恶化的综合征。其机制可能与氧自由基生成过多、细胞内Ca2+超载、炎症因子及递质的参与、细胞凋亡、膜脂质过氧化、一氧化氮含量变化等多因素参与引起的肾脏组织结构紊乱、功能代谢异常有关。
背景：文献报道，川芎嗪和一氧化氮都能减轻缺血再灌注引起的急性肾损伤。课题组合成一种在动物体内可以降解成一分子川芎嗪单体和一氧化氮的川芎嗪呋咱拼合物(605-1)化合物，其具有双重防治缺血再灌注损伤的作用。
目的：观察605-1防治小鼠急性肾缺血再灌注损伤的作用，并探讨其作用的机制。
方法：将48只雄性C57小鼠随机分为6组：假手术组，模型组，单独给药组，模型给药低、中、高浓度组。假手术组和单独给药组小鼠行假手术，不作肾缺血处理；模型组和模型给药各组小鼠建立肾缺血再灌注引起急性肾损伤模型。6组均于术前24 h及2 h进行预处理，假手术组和模型组腹腔注射生理盐水；单独给药组及模型给药低、中、高浓度组分别予以川芎嗪呋咱拼合物(605-1)，10，20，30 mg/kg。于缺血再灌注24 h后，测定血清中肌酐、尿素氮水平及肾组织的病理变化；在蛋白水平检测肾组织肾损伤分子1、Nox4、p65、P-p65表达；在RNA水平检测肾组织肾损伤分子1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1的表达。所有动物实验程序均由安徽医科大学动物实验伦理委员会批准。
结果与结论：①单独给药组(30 mg/kg)无肾毒性；②与模型组相比，模型给药各组肾缺血再灌注小鼠肾组织病理显示肾组织病理肾小管扩张和刷状边界丢失、管状细胞丢失明显减轻，血清中肌酐、尿素氮水平显著降低；肾损伤分子1在肾组织蛋白水平、mRNA水平表达也明显下降，肾组织免疫组化中肾损伤分子1表达的分布、数量明显下降；Nox4、p65、P-p65的蛋白水平呈下调表达；肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1的mRNA水平显著降低；③结果说明，605-1对小鼠急性肾缺血再灌注损伤有防治作用，其机制与抗氧化应激、抑制炎症反应有关。

https://orcid.org/0000-0003-0931-0251 (李万海)；https://orcid.org/0000-0002-7799-4184 (董宇航)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 川芎嗪呋咱拼合物, 肾缺血再灌注损伤, 急性肾损伤, 氧化应激, 炎症反应

Abstract: BACKGROUND: Ligustrazine and nitric oxide can both reduce acute kidney injury caused by renal ischemia-reperfusion. Our team synthesized a compound of ligustrazine furoxan (605-1) which can be degraded into ligustrazine monomer and nitric oxide in animals. This compound has therapeutic and preventive effects against ischemia-reperfusion injury.
OBJECTIVE: To observe the therapeutic and preventive effects of 605-1 against acute renal ischemia-reperfusion injury in mice, and to explore its mechanism.
METHODS: Forty-eight male C57 mice were randomly divided into six groups: sham operation group, model group (ischemia-reperfusion group), single administration group (605-1, 30 mg/kg), low, medium and high dose groups (ischemia-reperfusion+10, 20, 30 mg/kg 605-1, respectively). Mice in the sham operation group and the single administration group underwent sham operation without renal ischemia treatment, and those in the model group and the three administration groups were used to make acute kidney injury models caused by renal ischemia-reperfusion. Pre-treatments in each group were conducted at 24 and 2 hours before operation. Normal saline was intraperitoneally given in the sham operation and model groups. After 24 hours of ischemia-reperfusion, the levels of serum creatinine and urea nitrogen and the pathological changes of renal tissue were measured. The expression of kidney injury molecule 1, Nox4, p65, and P-p65 was detected at the protein level. The expression of kidney injury molecule 1, tumor necrosis factor α, interleukin 6, and monocyte chemoattractant protein 1 were detected at the RNA level. All animal experiment procedures were approved by the Animal Ethics Committee of Anhui Medical University.
RESULTS AND CONCLUSION: The single administration group (30 mg/kg) had no renal toxicity. Compared with the model group, in the low, medium and high dose groups, histomathological examinations of the renal tissue showed pathological renal tubule dilation and brush border loss, tubular cell loss was significantly reduced, serum creatinine and urea nitrogen levels were significantly reduced; the protein and mRNA levels of kidney injury molecule 1 in renal tissue also decreased significantly, and immunohistochemical examination showed that the distribution and quantity of kidney injury molecule 1 expression in renal tissue decreased significantly; the protein levels of Nox4, p65, and P-p65 were down-regulated; the mRNA levels of tumor necrosis factor-α, interleukin-6 and monocyte chemoattractant protein 1 were significantly reduced. To conclude, 605-1 has a preventive effect against renal ischemia-reperfusion injury in mice, and its mechanism is related to anti-oxidative stress and inhibition of inflammation.

Key words: ligustrazine furoxan complex, renal ischemia-reperfusion injury, acute kidney injury, oxidative stress, inflammatory reaction

中图分类号:

李万海, 董宇航, 施超, 姜亦瑶, 刘戈, 刁文杰, 吴振. 川芎嗪呋咱拼合物保护肾缺血再灌注损伤模型小鼠的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 205-210.

Li Wanhai, Dong Yuhang, Shi Chao, Jiang Yiyao, Liu Ge, Diao Wenjie, Wu Zhen. Ligustrazine furoxan complex protects against renal ischemia-reperfusion injury in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(2): 205-210.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析实验选用小鼠48只，分为6组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 605-1在肾脏缺血再灌注损伤过程中的防治作用为了排除605-1自身的肾毒性，增加了单独给药组(605-1 30 mg/kg)。见图1。当605-1剂量达到最高给药剂量30 mg/kg时，未发现明显的肾毒性。与假手术组相比，血肌酐、尿素氮水平无明显差异，肾形态学改变也无明显差异。PAS染色显示假手术组肾组织正常，然而，模型组肾脏近端小管出现急性肾小管损伤，肾小管扩张和刷状边界丢失、管状细胞丢失。605-1干预后肾管状上皮不肿胀，刷缘完整，并且浓度为30 mg/kg时防治作用最强(图1A)。此外，相比较于模型组，不同剂量605-1预处理的小鼠血肌酐、尿素氮水平下降，在浓度为30 mg/kg时血肌酐、尿素氮最低，防治作用最为明显(图1B，C)。说明605-1治疗可降低肾脏缺血再灌注损伤，并以剂量依赖的方式降低。因此，选择30 mg/kg的剂量进行后续的实验。

2.3 605-1降低肾脏损伤标志物表达 Western blot和RT-PCR检测结果显示，与假手术组相比，模型组中KIM-1的mRNA和蛋白水平均升高；模型给药各浓度组KIM-1表达降低，随着605-1剂量的增加(10，20，30 mg/kg)，KIM-1表达下降明显增强，见图2A，B。免疫组织化学显示模型组KIM-1阳性染色，模型给药各浓度组KIM-1表达明显减弱，见图2C。免疫组化检测KIM-1表达与western blot结果一致。综上，进一步验证605-1可以减轻肾脏缺血再灌注损伤。

2.4 605-1可减轻肾脏缺血再灌注损伤引起的氧化应激及炎症反应为探讨605-1减轻肾脏缺血再灌注损伤的氧化应激及炎症反应，检测了经典的氧化应激和炎症反应蛋白表达，见图3。与假手术组相比，模型组增强了Nox4、p65、P-p65的表达，而单独给药组中Nox4、p65、P-p65的表达较模型组明显降低，见图3A；605-1干预后能减轻模型组中肿瘤坏死因子ɑ、白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1的 mRNA水平表达，见图3B。综上所述，605-1可减轻肾脏缺血再灌注损伤引起的氧化应激及炎症反应。

参考文献

[1] YUAN SM. Acute Kidney Injury after Cardiac Surgery: Risk Factors and Novel Biomarkers. Braz J Cardiovasc Surg. 2019;34(3):352-360.
[2] ROSNER MH, OKUSA MD. Acute kidney injury associated with cardiac surgery. Clin J Am Soc Nephrol. 2006;1(1):19-32.
[3] NADIM MK, FORNI LG, BIHORAC A, et al. Cardiac and Vascular Surgery-Associated Acute Kidney Injury: The 20th International Consensus Conference of the ADQI (Acute Disease Quality Initiative) Group. J Am Heart Assoc. 2018;7(11):e008834.
[4] ORTEGA-LOUBON C, FERNÁNDEZ-MOLINA M, CARRASCAL-HINOJAL Y, et al. Cardiac surgery-associated acute kidney injury. Ann Card Anaesth. 2016;19(4):687-698.
[5] KO T, HIGASHITANI M, SATO A, et al. Impact of Acute Kidney Injury on Early to Long-Term Outcomes in Patients Who Underwent Surgery for Type A Acute Aortic Dissection. Am J Cardiol. 2015;116(3):463-468.
[6] RAUP-KONSAVAGE WM, WANG Y, WANG WW, et al. Neutrophil peptidyl arginine deiminase-4 has a pivotal role in ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury. Kidney Int. 2018;93(2):365-374.
[7] ELTZSCHIG HK, ECKLE T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 2011;17(11):1391-1401.
[8] KORKMAZ A, KOLANKAYA D. Inhibiting inducible nitric oxide synthase with rutin reduces renal ischemia/reperfusion injury. Can J Surg. 2013; 56(1):6-14.
[9] LEVEY AS, JAMES MT. Acute Kidney Injury. Ann Intern Med. 2017;167(9): ITC66-ITC80.
[10] PATSCHAN D, MÜLLER GA. Acute kidney injury. J Inj Violence Res. 2015; 7(1):19-26.
[11] 沈龙海,安泳潼,杨庆尧,等.中国被毛孢菌丝体提取物抗肾损伤作用体内外实验研究[J].中国药理学通报,2011,27(11):1537-1540.
[12] 呼敏凤,尚立芝,韦大文.川芎嗪预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠保护作用的实验研究[J].上海中医药杂志,2008,42(4):66-68.
[13] 杨家荣,张密霞,常亮堂,等.川芎嗪、阿魏酸及其配伍对心肌缺血再灌注模型大鼠的保护作用及对黏附分子的影响[J].中草药, 2008,39(7):1054-1056.
[14] 王娜,许海江,赵春玲.川芎嗪对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制[J].山西中医学院学报,2016,17(4):19-21.
[15] 霍展样,牛桂萍,刘晓丽.川芎嗪对小鼠急性肾缺血再灌注损伤的保护作用研究[J].中国临床药理学与治疗学,2004,9(2):230-233.
[16] GABBAI FB, HAMMOND TC, THOMSON SC, et al. Effect of acute iNOS inhibition on glomerular function in tubulointerstitial nephritis. Kidney Int. 2002 ;61(3):851-814.
[17] UM SC, SUZUKI S, TOYOKUNI S, et al.Formation of 4-hydroxy-2-nonenal-modified proteins and 3-nitro-L-tyrosine in rat island skin flaps during and after ischemia. Ann Plast Surg. 1999;42(3):293-298.
[18] WANG WZ, FANG XH, STEPHESON LL, et al. Acute microvascular action of vascular endothelial growth factor in skeletal muscle ischemia/reperfusion injury. Plast Reconstr Surg. 2005;115(5):1355-1365.
[19] CARROLL CM, CARROLL SM, OVERGOOR ML, et al. Acute ischemic preconditioning of skeletal muscle prior to flap elevation augments muscle-flap survival. Plast Reconstr Surg. 1997;100(1):58-65.
[20] LEI C, BERRA L, REZOAGLI E, et al. Nitric Oxide Decreases Acute Kidney Injury and Stage 3 Chronic Kidney Disease after Cardiac Surgery. Am J Respir Crit Care Med. 2018;198(10):1279-1287.
[21] ORTEGA-LOUBON C, FERNÁNDEZ-MOLINA M, CARRASCAL-HINOJAL Y, et al. Cardiac surgery-associated acute kidney injury. Ann Card Anaesth. 2016 ;19(4):687-698.
[22] LEWINGTON AJ, CERDÁ J, MEHTA RL. Raising awareness of acute kidney injury: a global perspective of a silent killer. Kidney Int. 2013;84(3):457-467.
[23] GOLIGORSKY MS, NOIRI E, TSUKAHARA H,et al. A pivotal role of nitric oxide in endothelial cell dysfunction. Acta Physiol Scand. 2000;168(1): 33-40.
[24] ROSNER MH, PORTILLA D, OKUSA MD. Cardiac surgery as a cause of acute kidney injury: pathogenesis and potential therapies. J Intensive Care Med. 2008;23(1):3-18.
[25] 梅长林,刘森炎.急性肾损伤诊治进展[J].解放军医学杂志,2013, 38(5):342-346.
[26] 尹连红,齐蒙,彭金咏.急性肾损伤的分子机制及中药干预研究进展[J].中国药理学通报,2016,32(11):1494-1500.
[27] 王汉民,谭华,赵洪雯,等.川芎嗪对大鼠肾脏缺血/再灌注损伤保护作用及抗细胞凋亡作用[J].第四军医大学学报,2008,29(9):833-836.
[28] 汪燕,马传荣,贺国芳,等.川芎嗪对大鼠肾缺血-再灌注后核因子-κB表达与一氧化氮合酶活性的影响[J].医药导报,2008,27(2): 128-131.
[29] 孙万森,吴喜利,乔成林.川芎嗪对慢性肾功能衰竭大鼠血浆内皮素和肿瘤坏死因子的影响[J].中国中医急症,2004,13(2):109-110+64.
[30] LI VOLTI G, SORRENTI V, MURABITO P, et al. Pharmacological induction of heme oxygenase-1 inhibits iNOS and oxidative stress in renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 2007;39(10):2986-2991.
[31] 叶青,徐达.丹参和川芎嗪对肾脏缺血-再灌注损伤的防治作用[J].上海交通大学学报(医学版),2008,28(3):342-344.
[32] OZTURK H, TUNCER MC, OZTURK H, et al. Nitric oxide regulates expression of sonic hedgehog and hypoxia-inducible factor-1alpha in an experimental model of kidney ischemia-reperfusion. Ren Fail. 2007;29(3):249-256.
[33] XU T, CHEN X, WANG XF, et al. Electron paramagnetic resonance in monitoring of nitric oxide production after kidney transplantation in rats. Chin Med J (Engl). 2004 ;117(10):1552-1557.
[34] 许益笑,张睿喆,王德选,等.左卡尼汀对肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织MPO和NO含量的影响[J].郑州大学学报(医学版),2012, 47(6):810-813.
[35] KUNTSCHER V, TRESKA V, RACEK J, et al. Does the administration of antioxidants as scavengers of reactive oxygen species in kidney transplantation really have sense.Bratisl Lek Listy. 2007;108(9):385-387.
[36] 邱涛,周江桥,陈晖,等.臭氧氧化预处理在肾缺血再灌注损伤中对内皮型一氧化氮合酶表达的影响[J].中华移植杂志(电子版), 2013,7(2):83-88.
[37] 陈辉乐,毛朝鸣,金可可,等.川芎嗪干预肾缺血再灌注损伤时内皮素-1、一氧化氮和超微结构变化[J].中华中医药学刊,2013,31(2): 318-320+461.
[38] SPINA S, LEI C, PINCIROLI R, et al. Hemolysis and Kidney Injury in Cardiac Surgery: The Protective Role of Nitric Oxide Therapy. Semin Nephrol. 2019;39(5):484-495.
[39] PARK KM, BYUN JY, KRAMERS C, et al. Inducible nitric-oxide synthase is an important contributor to prolonged protective effects of ischemic preconditioning in the mouse kidney. J Biol Chem. 2003;278(29): 27256-27266.
[40] HOLTERMAN CE, READ NC, KENNEDY CR. Nox and renal disease. Clin Sci (Lond). 2015;128(8):465-481.
[41] GORIN Y, BLOCK K. Nox4 and diabetic nephropathy: with a friend like this, who needs enemies? Free Radic Biol Med. 2013;61:130-142.
[42] MENG XM, REN GL, GAO L, et al. NADPH oxidase 4 promotes cisplatin-induced acute kidney injury via ROS-mediated programmed cell death and inflammation. Lab Invest. 2018;98(1):63-78.

引言

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是心脏外科手术后常见且严重的并发症[1]。心血管手术术后急性肾损伤的发生可显著延长患者术后重症监护病房(ICU)的观察护理时间，增加死亡率[2]。相关学者将其命名为心脏外科相关性急性肾损伤(CSA-AKI)[3-4]。而主动脉手术心脏外科相关性急性肾损伤的发生率高于一般心脏手术[5]。心脏手术后肾脏缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是急性肾损伤的常见原因[6]。肾脏缺血再灌注损伤的病理生理特点是肾脏缺血重新获得血流灌注后，肾组织细胞损伤没有减轻，相反的，细胞功能代谢障碍及结构破坏相比较于缺血时更加严重[7-8]，其临床表现为血清肌酐含量明显升高，或伴有少尿或无尿，严重时可导致死亡[9]。急性肾损伤的治疗方法涉及扩容、利尿、使用血管活性药物、肾脏替代治疗以及血液净化治疗等[10]。虽然，现有的治疗方法对早期急性肾损伤有一定程度的改善，但是远期效果仍不乐观[9]。
中草药具备毒副作用小、治疗靶点多和价格低廉等优点，逐渐作为补充和替代治疗药物[11]。川芎嗪是从伞形科植物川芎的根茎中分离提纯的一种中药成分的生物碱单体，对心、脑血管缺血性疾病具有防治作用[12-13]。研究表明，川芎嗪对肾脏缺血再灌注损伤引起的急性肾损伤同样有防治效果[14-15]。在肾脏缺血再灌注损伤过程中，由于一氧化氮含量降低导致微循化变差，再灌注时诱发一氧化氮合酶反馈性调节一氧化氮大量生成，过量的一氧化氮激活、释放多种细胞因子，这些细胞因子再次激活诱导型一氧化氮合成酶表达，而诱导型一氧化氮合成酶过量产生的一氧化氮及其毒性代谢产物-ONOO-和-OH等是造成肾脏损伤的重要原因[16]。适量的一氧化氮是维持血管稳态的调节剂，它通过调节血管弹性，抑制血小板的聚集、黏附以及抑制中性粒细胞黏附于内皮细胞，清除氧自由基，维持血管正常通透性，抑制平滑肌增殖，加强免疫功能及刺激内皮细胞再生等机制防治缺血损伤组织[17-19]。最近的临床试验表明，在心脏手术中和术后使用一定剂量一氧化氮气体可显著减少术后急性肾损伤的发生[20]。因此，如果能将川芎嗪与一氧化氮拼接在一起，将有益于肾脏缺血再灌注损伤引起的急性肾损伤的治疗。
作者所在课题组自主合成了一分子川芎嗪单体及一氧化氮拼接物(605-1)，通过观察小鼠血清中肌酐、尿素氮水平及肾组织的病理变化，分析肾损伤分子1(kidney injury molecule-1，KIM-1)等生物标记的表达，探究605-1对肾脏缺血再灌注损伤的防治作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计完全随机设计，多组比较的动物实验，组间比较采用单因素方差分析和Tukey的事后检验。
1.2 时间及地点实验于2019年12月至2020年12月在安徽医科大学药学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性成年C57小鼠，体质量20-30 g，由安徽医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(皖)2017- 001。动物研究是按照实验动物护理原则进行(美国国家卫生研究院出版物第1号)。所有动物实验程序均由安徽医科大学动物实验伦理委员会批准。在实验过程中，提供充足的食物和水，并保持在12 h光照/12 h黑暗周期。在术前24 h及2 h不同组腹腔注射对应体质量的药物或生理盐水。
1.3.2 药品、试剂和仪器川芎嗪呋咱拼合物(605-1)由安徽医科大学药剂实验室合成；RIPA缓冲液(碧云天，上海，中国)；RNeasy分离试剂盒(Qiagen，Valencia，加拿大)； KIM-1、P-p65、p65和β-actin特异性抗体(Abcam公司)；Anti-NOX4(Bioss，北京，中国)；引物由Abcam公司合成(序列见表1)；希-夫染色 (PAS)、血肌酐检测试剂盒、血尿素氮检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。Western blot电泳仪、RT-PCR仪(BIO-RAD，美国)；倒置荧光显微镜及照相系统、石蜡切片机(Leica，德国)；酶联免疫检测仪(闪谱，中国)；红外图像系统(Li-cor，美国)。

1.4 实验方法
1.4.1 动物分组将48只小鼠随机分成6组，每组8只。根据实验设计分为：①假手术组行假手术处理，术前24 h及 2 h予以腹腔注射0.01 mL/g的生理盐水；②模型组行造模手术建立小鼠肾缺血再灌注引起急性肾损伤模型，术前24 h及2 h予以腹腔注射0.01 mL/g的生理盐水；③单独给药组行假手术处理，术前24 h及2 h予以腹腔注射30 mg/kg川芎嗪呋咱拼合物(605-1)0.01 mL/g；④模型给药低、中、高浓度组行造模手术处理，术前24 h及2 h各组分别予以腹腔注射10，20，30 mg/kg川芎嗪呋咱拼合物(605-1)0.01 mL/g，以筛选最佳实验使用剂量。
1.4.2 模型制备小鼠使用3%戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯位四肢固定于37 ℃恒温板上，无菌条件下在背部两侧行1.0-2.0 cm切口。游离出左、右肾脏，分别找到并游离左右肾肾蒂。用无损动脉夹夹闭左、右肾肾蒂，造成左、右肾缺血。缺血45 min放开动脉夹，缝合切口。假手术组小鼠仅游离出双侧肾脏，切口表面用生理盐水纱布覆盖，不作肾缺血处理暴露45 min后缝合切口，再灌注24 h。单纯给药组同样予以假手术处理。
1.4.3 动物安乐死小鼠在戊巴比妥钠麻醉下眼球采血后脱颈处死，取出肾组织后交由安徽医科大学动物中心统一处理。
1.5 主要观察指标
1.5.1 血肌酐、尿素氮测定模型制备再灌注24 h后，摘眼球取血。血液经离心后取2 mL血清按试剂盒说明加入试剂，用分光光度法分别测定血清尿素氮和肌酐水平。

1.5.2 肾组织病理切片在取血后，取出小鼠左右肾脏。切分肾组织，肾组织染色及免疫组化先固定包埋，然后制备 4 μm厚的切片，进行希-夫(PAS)染色，光镜下进行组织学检查并对希-夫染色部分给予评分，总分为5分，分数越高说明肾小管损伤程度越严重。
1.5.3 肾蛋白提取及Western blot检测按照生产商说明进行免疫组化染色。将KIM-1特异性抗体在4 ℃孵育过夜，二抗在37 ℃孵育30 min。DAB染色和苏木精反染后，切片在显微镜下观察。肾组织的蛋白质用预冷的RIPA裂解液分离提取，获得总蛋白，并用BCA蛋白试剂盒对其浓度进行定量。然后在不同浓度的SDS-PAGE凝胶上电泳分离并转移到硝化纤维素膜上。随后，膜在4 ℃条件下与KIM-1，P-P65，P65， NOX4和β-actin一抗(1∶800配制)孵育过夜。洗净，孵育用IRDye 800偶联二抗在37℃条件下作用1.5 h(1∶10 000配制)。在LiCor/Odyssey红外检测显像波段强度图像系统获得显影带图像并使用Image J软件进行量化。
1.5.4 肾RNA提取及RT-PCR 使用RNeasy分离试剂盒从肾脏组织中按照说明书分离总RNA，进行实时PCR。总RNA通过用RNA-iso试剂从新鲜分离的肾组织中提取。随后用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA浓度，再通过反转录制得cDNA。使用CFX96实时RT-PCR检测系统，检测KIM-1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化蛋白1和β-actin的mRNA表达水平。
1.6 统计学分析应用SPSS 20.0统计软件(IBM公司，美国)对数据进行分析，GraphPad Prism 5(GraphPad，La Jolla，加利福尼亚，美国)用于作图。数据以平均标准误差(SEM)表示。数据分析采用单因素方差分析，Tukey的事后检验。 P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

急性肾损伤在心脏手术术后有较高的发病率和死亡率[21]。急性肾损伤每年的死亡率高于乳腺癌、前列腺癌和合并心脏衰竭患者[22]。许多需要接受心脏手术的患者手术前可能会经历一次或多次外周循环灌注不良，这会使血管内皮损伤，内皮素、血管紧张素Ⅱ和儿茶酚胺的局部释放，从而导致肾血管收缩，加剧肾缺血[23]，从而增加了肾组织在重新获得血流灌注后损伤的可能性。已经证实的是肾脏缺血再灌注损伤引起的急性肾损伤是一系列的炎症反应、细胞凋亡、氧化应激等复杂的过程。而心脏手术体外循环机中使用的血泵对血液造成机械损伤，同样会加重氧化应激及全身炎症反应的产生[24]，引起急性肾损伤的发生。虽然，已有药物具有防治急性肾损伤的作用，但是，还处于基础实验阶段。现如今仍然缺乏特殊有效的药物治疗，肾脏替代治疗是急性肾损伤的主要治疗措施[25]。透析治疗可以解决输注碳酸氢钠不能纠正的严重代谢性酸中毒，药物治疗无效的高血钾症等电解质紊乱，利尿剂治疗无效的肺水肿以及严重的尿毒症，但是部分患者无需肾脏替代治疗，肾功能就可恢复。过度肾脏替代治疗，反而可能损害肾功能，其次，不仅过度浪费医疗资源而且增加了患者的经济负担。目前，对于何时开始肾脏替代治疗，还未取得统一意见；而且在急性肾损伤发生的早期治疗，还没有特殊有效药物可减轻肾脏损伤及促进组织恢复，所以早期防治尤为重要。
天然产物在防治急性肾损伤方面具有明显疗效，且不良反应相对较少，越来越受到重视[26]。大量动物实验和临床实践证明，川芎嗪防治肾脏缺血再灌注损伤引起的急性肾损伤的机制可能与抗脂质过氧化、抑制及清除自由基、拮抗Ca2+、下调Bax蛋白表达、增强Bcl-2蛋白表达[27]、抑制白细胞黏附、调节一氧化氮合酶mRNA 表达、调节一氧化氮生成[28]、抑制肿瘤坏死因子α mRNA表达[29]、调节血红素氧合酶1(HO-1)[30]、扩张小血管、改善微循环等作用有关[31]。肾缺血再灌注损伤中一氧化氮含量随时间延长逐渐下降，适当的增加一氧化氮可以有效防治急性肾损伤，提高肾的抗氧化能力[32-37]。内源性一氧化氮是一种强有效血管扩张分子，可松弛血管平滑肌，负责调节器官灌注和血管稳态。而血浆氧合血红蛋白使一氧化氮减少和高氧合血红蛋白导致血管收缩、损害组织灌注、炎症、氧化应激和直接肾小管损伤，共同促进心脏手术后肾损伤的发展。最初，一氧化氮被批准用于治疗肺动脉高压，通过防止血管一氧化氮耗尽来维持器官灌注。此外，这种治疗通过减少肺血管阻力和右心负荷来改善心输出量。在这种情况下，清除血管中的氧合血红蛋白一氧化氮发挥着重要的作用，通过补充一氧化氮消除内源性损耗是一种有效治疗方法，能减少溶血引起的急性肾脏损伤[20，38]。陈辉乐等[37]研究发现川芎嗪可以通过增加一氧化氮含量刺激鸟苷酸环化酶，从而使鸟苷酸转变为环鸟苷酸(cGMP)，进而激活蛋白激酶G并通过开放线粒体钾通道而产生肾脏保护作用[39]。综上，作者所在的课题组通过合成的605-1在动物体内降解为川芎嗪和一氧化氮可对心脏手术后肾脏损伤发挥多重防治作用。
此次研究中，采用自主合成的化合物605-1对肾脏缺血再灌注损伤动物模型进行干预。研究组发现605-1具有防治肾缺血再灌注损伤、抑制氧化应激和炎症反应的作用，有效改善肾脏缺血再灌注损伤小鼠出现急性肾功能障碍。
Nox4主要表达于肾脏。最近研究表明，Nox4参与了肾脏疾病的病理过程[40-41]。Nox4促进了活性氧的产生导致肾脏损伤加速急性肾损伤[42]。此次研究发现，在肾缺血再灌注后Nox4与正常组相比表达明显升高，605-1预处理能有效的抑制肾缺血再灌注引起的Nox4表达。说明605-1可能通过抑制氧化应激对急性肾损伤起防治作用，提示Nox4可能作为治疗急性肾损伤的治疗靶点。通过检测细胞炎症反应过程中起关键性作用因子核因子ĸB(p65、P-p65)及炎症反应中经典蛋白白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1、肿瘤坏死因子α 表达变化。结果表明，在模型组促炎症细胞因子p65、P-p65、白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1和肿瘤坏死因子α呈上调表达，而在模型给药组(605-1预处理)上述蛋白或mRNA表达受到抑制。所以，605-1可能通过抑制炎症反应对肾缺血再灌注损伤导致的急性肾损伤起防治作用。综上，605-1对肾缺血再灌注引起的急性肾损伤有防治作用，其机制可能与抗氧化应激、抑制炎症反应有关。
此次研究发现，肾缺血再灌注前，经腹腔预注射605-1，能降低血肌酐、尿素氮，改善肾小管扩张和刷状边界丢失、管状细胞丢失，说明605-1对肾脏缺血再灌注损伤有防治作用。605-1降低KIM-1表达，进一步肯定605-1对肾脏缺血再灌注损伤的防治作用。经605-1预处理后，肾脏缺血再灌注损伤中Nox4、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等生物标记物受到抑制，说明605-1防治肾脏缺血再灌注损伤的作用机制与抑制氧化应激，降低炎症反应有关。然而，此次研究对605-1治疗肾脏缺血再灌注损伤的研究尚处于动物实验阶段，真正利用于临床还需要进一步探究与验证。605-1治疗肾脏缺血再灌注损伤的机制仍需深入研究。
综上，605-1可能通过抑制小鼠肾缺血再灌注引起的氧化应激、炎症反应等机制对肾损伤起防治作用。605-1可作为一种治疗肾脏缺血再灌注损伤的新型药物，具有较好的临床应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

川芎嗪呋咱拼合物保护肾缺血再灌注损伤模型小鼠的作用及机制

Ligustrazine furoxan complex protects against renal ischemia-reperfusion injury in mice

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[1]	唐文静, 伍思源, 杨晨, 陶希. 炎症反应与卒中后抑郁[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1278-1285.
[2]	李安安, 姜涛, 詹敏, 蔡宇宁, 宋敏, 李聪聪, 林文政, 张家媛, 刘文刚. 参苓白术散治疗膝骨关节炎作用机制的网络药理学和分子对接技术分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 197-204.
[3]	朱春晖, 张宜, 宋黄鹤, 梁文卫. 虾青素对叔丁基过氧化氢诱导软骨细胞损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1648-1655.
[4]	徐林, 齐宏顺, 葛汝村, 李培培, 甄丽晓, 冯肖亚. 微创清除术联合二甲双胍对家兔脑出血炎症反应的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1741-1746.
[5]	邢宏昶, 曹建平, 朱静, 姚鲲. 依那普利减轻肢体缺血-再灌注模型大鼠心肌损伤的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1747-1751.
[6]	宋慧芳, 谈佳音, 康毅, 李斌, 毕志斐, 龙女, 夏仲年, 郭蕊. 低氧预处理增强老年人骨髓间充质干细胞条件培养基对H9C2细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 1-6.
[7]	柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.
[8]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[9]	吴丹丹, 刘琪. 表观遗传学对牙周疾病及牙周细胞成骨和骨再生的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5716-5722.
[10]	李嘉, 付婷婷, 马元琛, 刘向前, 陈民. 外固定架结合中频脉冲疗法治疗C型桡骨远端骨折患者血清炎症因子和氧化应激指标的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(33): 5351-5355.
[11]	郭敏芳, 张慧宇, 章培军, 白振军, 于婧文, 王玉银, 魏文悦, 宋丽娟, 柴智, 尉杰忠, 马存根. 法舒地尔通过调节Nrf2/HO-1信号通路抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 5012-5017.
[12]	伍伟挺, 黎润光, 曹生鲁, 梁双武. 过度周期性机械应力刺激可引起软骨细胞炎症反应及凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(29): 4608-4613.
[13]	覃健芳, 王欢, 吴冰冰, 马小京. GOLM1基因敲除对单侧输尿管梗阻小鼠肾纤维化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(26): 4162-4167.
[14]	薛庆, 童梁成, 杨智伟, 汪剑龄, 赵磊, 周胜, 彭赛, 李颖. 表没食子儿茶素没食子酸酯可减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(26): 4145-4149.
[15]	阮光萍, 姚翔, 刘高米洋, 蔡学敏, 李自安, 庞荣清, 王金祥, 潘兴华. 脐带间充质干细胞移植治疗树鼩创伤性全身炎症反应综合征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3994-4000.