DNA拓扑异构酶Ⅱ在ICR小鼠神经干细胞中的表达及意义

doi:10.12307/2022.014

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (1): 84-89.doi: 10.12307/2022.014

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

DNA拓扑异构酶Ⅱ在ICR小鼠神经干细胞中的表达及意义

孙孟军1，郭建美2，周更苏3，董泽飞4，郑春贵3，曹翠丽5

邢台医学高等专科学校，1公共教学部，2基础医学部，3护理系，4口腔医学系，河北省邢台市 054000；5河北医科大学基础医学院神经生物研究室，河北省石家庄市 050017

收稿日期:2020-07-07 修回日期:2020-07-13 接受日期:2020-10-16 出版日期:2022-01-08 发布日期:2021-10-25
通讯作者: 曹翠丽，博士，教授，河北医科大学基础医学院神经生物研究室，河北省石家庄市 050017
作者简介:孙孟军，男，1976年生，河北省邢台市人，汉族，2002年河北医科大学毕业，硕士，高校讲师，主要从事基础医学研究。
基金资助:
河北省卫健委重点科技研究计划(20200168)，项目负责人：孙孟军

Expression and significance of DNA topoisomerase II in neural stem cells of ICR mice

Sun Mengjun1, Guo Jianmei2, Zhou Gengsu3, Dong Zefei4, Zheng Chungui3, Cao Cuili5

1Public Teaching Department, 2Department of Basic Medicine, 3Department of Nursing, 4Department of Stomatology, Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei Province, China; 5Department of Neurobiology, Basic Medical College, Heibei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China

Received:2020-07-07 Revised:2020-07-13 Accepted:2020-10-16 Online:2022-01-08 Published:2021-10-25
Contact: Cao Cuili, MD, Professor, Department of Neurobiology, Basic Medical College, Heibei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China
About author:Sun Mengjun, Master, Lecturer, Public Teaching Department, Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei Province, China
Supported by:
the Key Science and Technology Research Plan of Hebei Health Commission, No. 20200168 (to SMJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

神经干细胞：是指有自我更新能力且可以发挥持续增殖以及多潜能分化功能的一类细胞，它们对于脑组织完整细胞结构的维持和正常功能的发挥具有重要作用。
DNA拓扑异构酶Ⅱ：是一类广泛存在于生物体内的核蛋白，主要功能是调节核酸结构动态变化，在DNA复制、修复、转录、重组以及染色体分离等生命活动中发挥重要作用。DNA拓扑异构酶Ⅱ有2种同工酶，DNA拓扑异构酶Ⅱα主要分布于增殖细胞中，与细胞有丝分裂中期(G2/M期)染色体DNA双链的解聚与恢复有关，DNA拓扑异构酶Ⅱβ与间期细胞核内DNA构筑和代谢以及rRNA转录有关，主要分布于增殖不典型的细胞。

背景：胚胎期的神经干细胞可向神经元和神经胶质细胞分化，而实际应用中希望神经干细胞更多地分化成神经元。因此，研究神经干细胞向神经元的定向分化机制至关重要。DNA拓扑异构酶Ⅱ是一类广泛存在于生物体内的核蛋白，在DNA复制、修复、转录、重组以及染色体分离等生命活动中发挥重要作用。
目的：探讨神经干细胞及其向神经元定向分化过程中DNA拓扑异构酶Ⅱ的表达及意义。
方法：从ICR小鼠(E12.5 d)大脑皮质中分离培养神经干细胞，将神经干细胞球消化成单细胞后，以5×108 L-1密度接种于用Matrigel铺底的培养皿上，加入含B27、N2、10 μg/L胶质细胞源性神经营养因子的成神经诱导分化条件培养液，诱导培养1，2，3 d采用免疫细胞化学、Western blot、实时定量PCR检测DNA拓扑异构酶Ⅱα和β的表达。

结果与结论：①DNA拓扑异构酶Ⅱα阳性细胞在神经球内数量较多，且均匀分布，在向神经元诱导分化后阳性细胞有所减少；DNA拓扑异构酶Ⅱβ阳性细胞在神经球内数量较少，主要分布在神经球中央，在向神经元诱导分化后强表达的阳性细胞开始增多，在诱导分化2 d达到高峰，之后呈减少趋势；②在神经球中DNA拓扑异构酶Ⅱα蛋白和mRNA表达较高，在向神经元诱导分化后逐渐降低；在神经球中DNA拓扑异构酶Ⅱβ蛋白和mRNA表达较低，在向神经元诱导分化后显著增高；③通过实验得出DNA拓扑异构酶Ⅱβ参与神经干细胞向神经元的定向分化。

https://orcid.org/0000-0002-6326-5159(曹翠丽)；https://orcid.org/0000-0002-1930-1431(孙孟军)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 神经干细胞, TopoⅡα, TopoⅡβ, 免疫细胞化学, 免疫印迹, 实时定量PCR

Abstract: BACKGROUND: Embryonic neural stem cells can differentiate into neurons and glial cells. In practical applications, we hope that neural stem cells will differentiate into neurons more. Therefore, it is very important to study the mechanism of directional differentiation of neural stem cells into neurons. DNA topoisomerase II is a type of nucleoprotein widely present in organisms and plays an important role in life activities such as DNA replication, repair, transcription, recombination and chromosome separation.
OBJECTIVE: To explore the expression and significance of DNA topoisomerase II in neural stem cells and their directional differentiation into neurons.
METHODS: Neural stem cells were isolated from cerebral cortex of ICR mice (E12.5 d) and cultured. The single cells after digestion were inoculated in a petri dish at 5×108 L-1 after matting with Matrigel. The conditioned medium of neurogenic differentiation containing B27, N2 and 10 μg/L glial cell line derived neurotrophic factor was added. At 1, 2, and 3 days after culture, the expression of DNA topoisomerase II α and β was detected by immunocytochemistry, western blot assay, and real time-quantitative PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The number of DNA topoisomerase IIα-positive cells in neurospheres was large and evenly distributed, and the number of positive cells after induced differentiation was reduced. The number of DNA topoisomerase IIβ-positive cells in neurospheres was relatively small, mainly distributed in the center of neurospheres. After induced differentiation, the number of positive cells began to increase gradually. At 2 days, the expression reached a peak, and then showed a decreasing trend. (2) The expression of DNA topoisomerase IIα protein and mRNA in neurospheres was high and gradually decreased after the differentiation into neurons. The expression of DNA topoisomerase IIβ protein and mRNA in neurospheres was low and significantly increased after neuronal differentiation. (3) Through experiments, it is concluded that DNA topoisomerase IIβ participates in the directional differentiation of neural stem cells into neurons.

Key words: neural stem cells, DNA topoisomerase II α, DNA topoisomerase II β, immunocytochemistry, western blot, real time-quantitative PCR

中图分类号:

孙孟军, 郭建美, 周更苏, 董泽飞, 郑春贵, 曹翠丽. DNA拓扑异构酶Ⅱ在ICR小鼠神经干细胞中的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 84-89.

Sun Mengjun, Guo Jianmei, Zhou Gengsu, Dong Zefei, Zheng Chungui, Cao Cuili. Expression and significance of DNA topoisomerase II in neural stem cells of ICR mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(1): 84-89.

图/表（结果） 5

2.1 ICR小鼠神经干细胞体外培养与鉴定结果[12] 接种后细胞从单细胞形式向细胞团转化，并且体积增大，形成神经球。神经球内大部分细胞呈nestin阳性，阳性反应产物主要聚集在细胞浆内。经诱导分化后，先爬出的细胞为GFAP阳性细胞，胞体较小，突起较多，染色深浅不一，向多个方向伸展；后爬出的细胞为NSE阳性细胞，随着诱导时间增加，突起逐渐延伸增长，体积较大，突起明显的细胞NSE染色较深，体积较小，突起少的细胞NSE染色较浅。
2.2 ICR小鼠神经干细胞诱导分化结果[12] 将神经球消化成单细胞后，接种在Matrigel基质胶铺底的培养皿中，用条件培养液诱导分化。诱导后1 d，可以观察到两种形态的细胞：突起较细小，胞体呈三角形或圆锥形的具备神经元形态的细胞和另一种突起较粗大且较长的具备星形胶质细胞特征的细胞；诱导后2 d，具备神经元形态特征的细胞突起继续生长，相互交织；另一种具备胶质细胞特征的细胞突起变化不明显，细胞数量下降；诱导后3 d，具备神经元形态特征的细胞突起继续生长，具有胶质细胞特征的细胞死亡较多。
免疫荧光染色结果显示：nestin阳性细胞在神经球中数量较多且分布均匀；随着诱导分化时间的延长，nestin阳性细胞逐渐减少。MAP-2阳性细胞仅在神经球中央少量存在；随着诱导分化时间的延长，MAP-2阳性细胞逐渐增多。GFAP阳性细胞在神经球中较多；随着诱导分化时间的延长，GFAP阳性细胞逐渐减少，见表2。

2.3 神经干细胞分化过程中TopoⅡ的表达
2.3.1 免疫细胞化学染色 TopoⅡα阳性细胞在神经球内数量较多，且均匀分布，阳性细胞率为(83.0±6.5)%；TopoⅡα阳性细胞在向神经元诱导分化1 d后数量有所减少，阳性细胞率为(76.0±4.9)%；诱导分化2 d后明显减少，阳性细胞率为(24.0±1.7)%；诱导分化3 d后继续减少，阳性细胞率为(16.0±2.2)%，见图1。统计学结果表明，TopoⅡα阳性细胞率在各组之间差异有显著性意义(P < 0.05)，进一步两两组间比较，神经球组和向神经元诱导分化1 d组之间，向神经元诱导分化2 d组与3 d组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，其他各组之间差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

TopoⅡβ阳性细胞在神经球内数量较少，阳性细胞率为(55.0±2.4)%，主要分布在神经球中央；TopoⅡβ阳性细胞在向神经元诱导分化1 d后开始逐渐增多，阳性细胞率为(68.0±3.7)%，同时强表达的细胞也开始增多；TopoⅡβ阳性细胞在诱导分化2 d后显著增多，阳性细胞率为(77.0±3.3)%，且以强表达细胞为主；诱导分化3 d后仍然很多，与2 d组比较呈减少趋势，阳性细胞率为(64.0±2.2)%，见图1。统计学结果表明，TopoⅡβ阳性细胞率在各组之间差异有显著性意义(P < 0.05)，进一步两两组间比较，向神经元诱导分化1 d
组与3 d组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，其他各组之间差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表2。
共聚焦显微镜免疫荧光双标显示：只有在突起较长的MAP-2阳性细胞中，其胞核内TopoⅡβ呈强阳性表达，说明二者在同一细胞中出现共表达，见图2。

2.3.2 Western blot检测结果 TopoⅡα分子质量为170 kD，
TopoⅡβ分子质量为180 kD。在神经球中TopoⅡα蛋白表达较高，在向神经元诱导分化1，2 d细胞中TopoⅡα蛋白表达仍然较高，达到高峰，在诱导分化3，4 d细胞中TopoⅡα蛋白表达逐渐降低。由此推测，TopoⅡα可能参与细胞的分裂增殖，而在分化细胞中出现下调。在神经球中TopoⅡβ蛋白表达很低，在向神经元诱导分化1 d细胞中TopoⅡβ蛋白表达稍高，在诱导分化2 d细胞中TopoⅡβ蛋白表达显著增高达到高峰，在诱导分化3，4 d缓慢下降。由此推测，TopoⅡβ在增殖细胞中的表达较低，但在向神经元分化过程中表达升高，见图3。

2.3.3 实时定量PCR检测结果在神经球中TopoⅡα mRNA的表达较高，在向神经元诱导分化1 d细胞中TopoⅡα mRNA表达开始升高，2 d时表达明显下降，3-5 d仍逐渐降低，维持在较低水平。在神经球中TopoⅡβ mRNA表达较低，在向神经元诱导分化1 d细胞中TopoⅡβ mRNA表达缓慢增高，2 d时达到高峰，3-5 d又缓慢降低，见图4。
2.4 生物相容性神经干细胞增殖性实验显示[12]：细胞在传代后4 d内以增殖为主。以5×108 L-1进行传代，CCK-8法测得吸光度值为0.117，细胞倍增时间为2 d；4 d时吸光度值达0.331，此时细胞密度最高，是传代细胞数的2.83倍；5 d后细胞增殖减慢，吸光度值逐渐下降。因此传代时间选择在神经球培养三四天进行。

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引言

神经干细胞是指有自我更新能力并可以发挥持续增殖以及多潜能分化功能的一类细胞[1-3]，对于维持脑组织的完整结构和正常功能起重要作用[4]。DNA拓扑异构酶Ⅱ (topoisomerase Ⅱ，TopoⅡ)是一类广泛存在于生物体内的核蛋白，主要功能是调节核酸结构动态变化，在DNA复制、修复、转录、重组以及染色体分离等生命活动中发挥重要作用。TopoⅡ有2种同工酶[5-8]，TopoⅡα主要分布于增殖细胞中，与细胞有丝分裂中期(G2/M期)染色体DNA双链的解聚与恢复有关，TopoⅡβ与间期细胞核内DNA构筑和代谢以及rRNA转录有关，主要分布于增殖不典型的细胞。已有文献报道，TopoⅡβ主要通过调节染色质构型变化，调控适宜的细胞内环境，以及促进相关基因表达等因素，参与神经的发育、分化[9-10]，而缺乏TopoⅡβ将会导致神经系统发育障碍[11]。
近年来，关于神经干细胞增殖、分化的基因调控和蛋白表达方面的研究很多，比如细胞外信号BMP和Notch参与维持神经干细胞的静息状态，Wnt信号能促进神经干细胞及其子代细胞增殖并激活神经发生过程。然而，关于神经干细胞中TopoⅡ的表达情况报道较少。体外培养的神经干细胞既存在增殖又存在分化现象，TopoⅡ存在的α和β 2种同工酶恰与细胞的增殖和分化相关，因此有必要研究TopoⅡα和β的表达情况，探讨其与神经干细胞增殖、分化的关系，进而可以通过调节其表达，对神经干细胞的增殖和分化进行人工调控。该研究选择ICR小鼠作为研究对象，通过检测神经球及其向神经元定向分化过程中TopoⅡα和β的表达，探讨TopoⅡ可能参与神经分化的机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2017年6月至2018年12月在河北医科大学神经生物研究室完成。
1.3 材料河北医科大学实验动物中心提供的ICR孕鼠(孕12.5 d)，体质量30-40 g；Matrigel 基质胶(BD Labware，美国)；TaqDNA聚合酶(北京赛百盛公司)；Rnasin、Random
Primers、dNTP、MgCl2、M-MLV RT 5×Buffer、M-MLV反转录酶(Promega，美国)；PCR引物(北京赛百盛公司)；TritonX-100
SDS(电泳级)、Tween-20、HEPES、过硫酸铵、TEMED
(Sigma，美国)；兔抗nestin单克隆抗体、兔抗TopoⅡβ一抗、兔抗人β-actin多克隆抗体(Santa Cruz公司)；兔抗TopoⅡα一抗(Cell signaling，美国)；DyLightTM488标记山羊抗兔IgG、DyLightTM488标记山羊抗小鼠IgG、DyLightTM594标记山羊抗小鼠IgG、DyLightTM594标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥)；蛋白分子质量标记物(MBI公司)；硝酸纤维素膜(Millipore公司)；脱脂奶粉(黑龙江松鹤乳品厂)；N，N'-甲叉双丙烯酰胺、抑酞酶、苯甲基磺酰氟、丙烯酰胺单体(Amresco公司，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 ICR小鼠神经干细胞体外培养与鉴定取E12.5 d ICR孕鼠，用戊巴比妥腹膜下注射麻醉(65 mg/kg)，手术剪打开腹腔，剪开子宫，取出胎鼠，将胎鼠用体积分数为75%乙醇消毒后断头处死，用眼科手术剪剪开全脑，置于含D-Hank’s液的培养皿中。在解剖显微镜下充分去除软脑膜和脉络丛组织，取出皮质剪成约1 mm3大小，移入无菌离心管，用3倍体积的Acutase消化，37 ℃水浴5 min；用火焰抛光的玻璃吸管轻轻吹打成单细胞悬液，静置15-30 min，使未吹开的大块组织沉底。将上清移入另一无菌离心管，加无菌PBS或Hank’s液，吹打均匀，1 000 r/min离心5 min，离心洗涤两三次，至上清清澈。将细胞重悬于含B27和20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，20 μg/L表皮细胞生长因子的DMEM/F12培养基中，以5×108 L-1密度接种于75 mL玻璃培养瓶，置
37 ℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内培养，每两三天换液1次，每天进行倒置显微镜观察，接种后三四天形成神经球后进行传代培养以及nestin、GFAP、NSE免疫荧光染色鉴定，具体参照文献[12]。
1.4.2 ICR小鼠神经干细胞的诱导分化将消化后的神经球单细胞以5×108 L-1的密度接种于用Matrigel进行铺底的培养皿中，先在含B27和20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，
20 μg/L表皮细胞生长因子的DMEM/F12培养基中原始培养
4 h，待细胞贴壁后换成含B27、N2、10 μg/L胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化条件培养液，培养1，2，3 d后进行Nestin、MAP-2、GFAP免疫细胞化学染色，同时取增殖旺盛的神经球冰冻切片做对照，具体参照文献[13]。
1.4.3 免疫细胞化学染色观察神经干细胞分化过程中TopoⅡ的表达
(1)实验分组：①条件培养液诱导神经干细胞向神经元分化组(向神经元分化组)：将增殖旺盛的神经球消化成单细胞后，接种在用Matrigel进行铺底的玻璃盖玻片上，按照上述方法加入条件培养液进行诱导分化，在诱导分化后1，2，
3 d制备切片，40 g/L多聚甲醛固定30 min，浸泡在0.01 mol/L
PBS中4 ℃保存备用；②神经球对照组：将增殖旺盛的神经球离心成细胞团，40 g/L多聚甲醛固定30 min，用OCT包埋剂包埋后行冰冻切片，片厚10 μm，-80 ℃保存备用。
(2)免疫细胞化学染色：取上述冰冻切片和细胞爬片分别做TopoⅡα和TopoⅡβ免疫细胞化学染色。首先用含0.3%Triton X-100的PBS透膜10 min，0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次；用含10%BSA和体积分数为2%马血清的封闭液于37 ℃孵育30 min；加入2% BSA稀释的特异性一抗[兔抗TopoⅡα一抗(1∶100)，兔抗TopoⅡβ一抗(1∶100)，鼠抗nestin一抗(1∶100)，鼠抗MAP-2一抗(1∶100)，鼠抗GFAP一抗(1∶100)]，在湿盒中4 ℃孵育过夜，用含0.1% Tween 20的PBS洗3次，5 min/次；加入2% BSA稀释的二抗(DyLightTM594标记山羊抗兔IgG，DyLightTM488标记山羊抗小鼠IgG，含有DAPI)，湿盒中避光室温孵育1 h，用含0.1% Tween 20的PBS洗3次，5 min/次，0.01 mol/L PBS洗1次，5 min；避光封固后，在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察结果，采集图像。
1.4.4 Western blot检测神经干细胞分化过程中TopoⅡ的表达取快速增殖的神经球、诱导分化后1，2，3，4 d处于不同分化阶段的神经干细胞，加入全细胞裂解液，吹打均匀，4 ℃静置30 min，超声裂解15 min，4 ℃，12 000 r/min离心20 min，吸取上清，-20 ℃冻存，采用考马斯亮蓝G250试剂盒检测蛋白浓度。根据蛋白浓度制备20 μL样品体系，用5%浓缩胶、8%分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后恒压90 V
电压转膜12-15 h，放入5%脱脂奶粉中室温摇床上封闭一两个小时，加入一抗[兔抗TopoⅡα一抗(1∶1 000)，兔抗TopoⅡβ一抗(1∶1 000)，兔抗人β-actin多克隆抗体
(1∶1 000)]孵育，4 ℃摇床过夜；加入IRDyeTM700羊抗兔二抗(1∶10 000)，37 ℃温育1 h，用Odessey仪器检测杂交信号，保存结果并进行数字化分析。
1.4.5 实时定量PCR检测神经干细胞分化过程中TopoⅡ的表达取快速增殖的神经球、诱导分化后1，2，3，4，5 d处于不同分化阶段的神经干细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，以分光光度计测定细胞总RNA的纯度及浓度，然后用反转录试剂盒将其反转录为cDNA，所用引物在Genbank查询序列，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。按照TOYOBO公司的SYBR Green Real-time PCR Master Mix说明书，在ABI7700型定量PCR仪中进行real-time PCR反应，通过计算2-ΔΔCt来比较不同样品之间特定基因的表达差异。

1.5 主要观察指标 ①免疫细胞化学染色检测TopoⅡα和TopoⅡβ阳性细胞表达；②Western blot检测TopoⅡα蛋白条带和TopoⅡβ蛋白条带的吸光度比值；③实时定量PCR检测TopoⅡα mRNA和TopoⅡβ mRNA的表达。
1.6 统计学分析计量资料用x±s表示，所有数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，数据服从正态分布及方差齐时应用单因素方差分析及LSD检验进行多个均数的两两组间比较；方差不齐时采用Kruskal-Wallis H秩和检验，两两组间比较用Nemenyi法。

讨论

DNA拓扑异构酶是细胞的一种基本核酶，广泛存在于各类生物种群中，对细胞的转录、复制及有丝分裂等起着重要的调控作用。由于作用机制不同，Topo分为TopoⅠ和TopoⅡ两种类型，TopoⅠ介导1条链的断裂和再链接，TopoⅡ介导2条链的断裂和再链接[14-15]。Topo Ⅱ是多种临床相关抗肿瘤药物的细胞靶标[16]。Topo Ⅱ对于解决DNA的拓扑问题至关重要，并在各种细胞过程(例如复制、转录和染色体分离)中发挥重要作用[17]。同时，Topo Ⅱ在塑造有丝分裂染色体和确保姐妹染色单体的有序分离中也至关重要[18]。
真核生物TopoⅡ包括α和β 2种亚型[19]，在基因和蛋白质的结构方面，两者具有70%的序列同一性[20]，而在生理功能方面，二者差别较大：TopoⅡα对正超螺旋的DNA和细胞增殖起作用，在快速增殖期含量较高，可作为判断细胞增殖程度的标志物；Topo Ⅱβ在细胞中含量相对稳定[21-22]。
近年来，有研究显示TopoⅡβ与神经分化相关[23]。TSUTSUI等[24]提出TopoⅡβ可能参与细胞有丝分裂后的一些生理过程，他们在1986年TopoⅡβ还没有被公认前就报道过，在停止增殖并且达到终末分化的神经元的核提取物中检测到高水平的TopoⅡ活性[25]，1993年，他们用出生后14 d大鼠的脑组织合成TopoⅡ的cDNA，发现了脑组织中存在2种TopoⅡ异构体，并且它们与人类的TopoⅡα和β有高度的同源性[26]。在胎鼠和成年大鼠脑组织中均可检测到TopoⅡβ，而在成年大鼠脑组织中检测不到TopoⅡα[27]。哺乳动物TopoⅡβ在经过最终细胞分裂并分化为神经元细胞中高度表达。当酶的作用在体外受到特定抑制剂的干扰时，在神经元分化过程中不会发生基因亚群的转录诱导。TopoⅡβ对于在最终分化神经元细胞中某些基因的发育调控表达是必需的[28]。后续研究表明，小脑区域和大脑中TopoⅡβ的活性最高，因此，TopoⅡβ在小脑中可能具有某些未知功能[29]。在哺乳动物TopoⅡ同工酶[TopoⅡα(170 kD)
和TopoⅡβ(180 kD)]中，TopoⅡβ被认为可以调节神经元的发育和细胞的分化[30]。另有报道，由于TopoⅡβ缺乏，细胞变大和扁平化；而TopoⅡβ的过表达促使所有细胞表现出神经细胞形态，其特征是神经突更长[31]，进一步证实了TopoⅡβ参与神经分化[32-33]。
实验研究发现，TopoⅡα mRNA和蛋白在神经球中的表达水平均较高，考虑应该与神经球内的细胞增殖能力较强有一定关系。在诱导分化的不同时间点，从1 d到2 d其表达显著下降，诱导分化到3 d时其表达仍继续下降。因此得出结论：TopoⅡα在分化细胞中的表达出现下调，TopoⅡα分子表达节点的转变可能与神经元分化相关。TopoⅡ β mRNA和蛋白的表达与TopoⅡα不同，其在诱导分化过程中逐渐增高，而在神经球中较低表达。在诱导分化1 d时增高，2 d时达到高峰，3 d后又开始下降，这一过程与神经干细胞向神经元的分化过程一致。通过研究认为，TopoⅡβ在增殖细胞中的表达较低，但在向神经元分化过程中的表达增高。通过MAP-2阳性细胞和TopoⅡβ阳性细胞免疫双标观察到，只有诱导分化过程中向神经元分化的细胞中，TopoⅡβ才有高表达，因此，进一步明确了TopoⅡβ与神经分化的关系。通过实验建立了神经干细胞在体外进行神经分化的新平台，并依据平台证实了TopoⅡβ与神经分化相关。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

DNA拓扑异构酶Ⅱ在ICR小鼠神经干细胞中的表达及意义

Expression and significance of DNA topoisomerase II in neural stem cells of ICR mice

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