动态压力联合胰岛素样生长因子1基因转染对壳聚糖/明胶支架中兔脂肪间充质干细胞成软骨分化的影响

doi:10.12307/2021.062

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (28): 4485-4491.doi: 10.12307/2021.062

• 组织工程软骨材料Tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

动态压力联合胰岛素样生长因子1基因转染对壳聚糖/明胶支架中兔脂肪间充质干细胞成软骨分化的影响

张传辉1，李建军2，杨军2

1朝阳市中心医院骨外科，辽宁省朝阳市 122000；2中国医科大学附属盛京医院创伤骨科，辽宁省沈阳市 110004

收稿日期:2020-06-23 修回日期:2020-07-01 接受日期:2020-07-31 出版日期:2021-10-08 发布日期:2021-05-20
通讯作者: 张传辉，硕士，副主任医师，朝阳市中心医院骨外科，辽宁省朝阳市 122000
作者简介:张传辉，男，1982年生，辽宁省大连市人，汉族，2010年中国医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事关节外科、创伤骨科、手外科专业疾病的诊疗研究。
基金资助:
辽宁省自然科学基金资助项目(20102264)，项目负责人：李建军

Effect of dynamic compression combined with insulin-like growth factor-1 gene transfection on chondrogenic differentiation of rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells in chitosan/gelatin scaffolds

Zhang Chuanhui1, Li Jianjun2, Yang Jun2

1Department of Orthopeadic Surgery, Chaoyang City Center Hospital, Chaoyang 122000, Liaoning Province, China; 2Department of Orthopedic Trauma, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Received:2020-06-23 Revised:2020-07-01 Accepted:2020-07-31 Online:2021-10-08 Published:2021-05-20
Contact: Zhang Chuanhui, Master, Associate chief physician, Department of Orthopeadic Surgery, Chaoyang City Center Hospital, Chaoyang 122000, Liaoning Province, China
About author:Zhang Chuanhui, Master, Associate chief physician, Department of Orthopeadic Surgery, Chaoyang City Center Hospital, Chaoyang 122000, Liaoning Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 20102264 (to LJJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

钙离子通道：是一种跨越细胞膜的结构，它严格控制着钙离子进入细胞的过程。软骨细胞膜上的几种通道，如受体电位香草醛亚家族4、机械敏感性离子通道和电压门控通道可被各种物理刺激激活，导致细胞外钙离子瞬时内流。

胰岛素样生长因子：是一组具有促生长作用的多肽类物质，其分泌细胞广泛分布在人体的肝、肾、脑、心和肠等组织中，胰岛素样生长因子家族有胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2两种。胰岛素样生长因子1的产生更依赖于生长激素，其促生长作用强，被认为是调节软骨形成和代谢最关键性的细胞因子。

背景：应用生物反应器体外模拟人体内生物力学环境，联合应用基因转染技术体外构建组织工程软骨是目前组织工程研究领域的新思路。对于机械应力促进脂肪间充质干细胞成软骨分化的作用机制，目前国内外尚无定论。
目的：研究动态压力与胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)基因转染对诱导负载于壳聚糖/明胶复合支架上的兔脂肪间充质干细胞成软骨分化的交互作用。
方法：将壳聚糖/明胶复合支架材料置于6孔培养板中，分4组干预：A组滴加脂肪间充质干细胞悬液，孵育4 h后加入完全培养基培养9 d；B组滴加IGF-1转染的脂肪间充质干细胞悬液，孵育4 h后加入完全培养基培养9 d；C组滴加脂肪间充质干细胞悬液，孵育4 h后加入完全培养基培养2 d，随后进行动态压力培养(2%形变，频率1 Hz)，加压20 min，间歇20 min，每天6个循环周期，继续培养7 d；D组滴加IGF-1转染的脂肪间充质干细胞悬液，孵育4 h后加入完全培养基培养2 d，随后进行动态压力培养，继续培养7 d。培养结束后，检测细胞-支架复合物中细胞的增殖速度、糖胺聚糖含量、钙离子含量及软骨相关基因表达(IGF-1、Sox-9、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和X型胶原)。
结果与结论：①各组细胞均具有较好的增殖能力，其中增殖速度由快至慢依次为D组、B组、C组、A组；②B、C、D组的糖胺聚糖、钙离子含量高于A组(P < 0.01)，D组高于B、C组(P < 0.01)，B组高于C组(P < 0.01)；③4组间X型胶原mRNA表达无差异(P﹥0.05)；B、C、D组的IGF-1、Sox-9、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖mRNA表达高于A组(P < 0.01)，D组高于B、C组(P < 0.01)，B组高于C组(P < 0.01)；④结果表明，动态压力联合IGF-1基因转染协同诱导壳聚糖/明胶复合支架上脂肪间充质干细胞的成软骨分化。
https://orcid.org/0000-0002-4742-2150 (张传辉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 软骨, 因子, 动态压力, 干细胞, 胰岛素样生长因子1, 组织工程, 软骨细胞, 钙离子, 钙离子通道

Abstract: BACKGROUND: It is a new idea that the application of bioreactor to simulate the biomechanical environment of human body, and the combination with gene transfection technology to construct tissue-engineered cartilage in vitro in the field of tissue engineering research. At present, there is no conclusion about the action mechanism of mechanical stress promoting the chondrogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells at home and abroad.
OBJECTIVE: To investigate the comparative and interactive effects of dynamic compression and insulin-like growth factor-1 on the chondrogenesis of rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells in chitosan/gelatin scaffolds.
METHODS: Chitosan/gelatin composite scaffolds were placed in a six-well culture plate and divided into four groups. In group A, rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells were added into the complete medium for 9 days after incubation for 4 hours. In group B, rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells transfected with insulin-like growth factor-1 were incubated for 4 hours and then cultured in complete medium for 9 days. In group C, rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells with insulin-like growth factor-1 had been cultured in chitosan/gelatin scaffolds for 2 days before dynamic compression after incubation for 4 hours. The cells/scaffold constructs were subjected to cyclic compression with 2% strain and 1 Hz, pressure for 20 minutes, interval of 20 minutes, 6 cycles per day for 7 consecutive days. In group D, adipose-derived mesenchymal stem cells transfected with insulin-like growth factor-1 were incubated for 4 hours in chitosan/gelatin scaffolds and then cultured in complete medium for 2 days, followed by dynamic pressure culture for 7 days. After the trial intervention, the cell proliferation rate, total glycosaminoglycan content, calcium content and cartilage related gene expression (insulin-like growth factor 1, Sox-9, type II collagen, aggrecan and type X collagen) were quantified.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) All the cells in each group had good proliferative ability, and the proliferative speed from fast to slow was group D, group B, group C, and group A. (2) The total glycosaminoglycan and calcium ion contents of groups B, C and D were higher than those of group A (P < 0.01), those of group D were higher than those of groups B and C (P < 0.01), and those of group B were higher than those of group C (P < 0.01). (3) There was no difference in the expression of type X collagen mRNA among the four groups (P > 0.05). The mRNA expression levels of insulin-like growth factor-1, Sox-9, type II collagen, and aggrecan in groups B, C and D were higher than those in group A (P < 0.01), higher in group D than in groups B and C (P < 0.01), and higher in group B than in group C (P < 0.01). (4) Our results suggest that dynamic compression combined with insulin-like growth factor-1 overexpression induced chondrogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells on chitosan/gelatin composite scaffold.

Key words: cartilage, factor, dynamic pressure, stem cells, insulin-like growth factor-1, tissue engineering, chondrocytes, calcium ion, calcium ion channel

中图分类号:

张传辉, 李建军, 杨军. 动态压力联合胰岛素样生长因子1基因转染对壳聚糖/明胶支架中兔脂肪间充质干细胞成软骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(28): 4485-4491.

Zhang Chuanhui, Li Jianjun, Yang Jun. Effect of dynamic compression combined with insulin-like growth factor-1 gene transfection on chondrogenic differentiation of rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells in chitosan/gelatin scaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(28): 4485-4491.

图/表（结果） 9

2.1 兔ADSCs的形态学观察及表型鉴定分离培养的原代ADSCs接种后6 h就有少许贴壁，24 h贴壁增多，形态呈典型的长梭形或多角形细胞，呈团簇状生长，接种后5 d左右细胞融合超过80%时传代。细胞倍增时间约为2 d，传20代以上仍具有较高增殖速率，且形态未见显著改变，见图1。

进一步应用经荧光免疫法检测显示细胞中CD44和CD109均呈阳性反应，判定所获得细胞为ADSCs，见图2。

2.2 IGF-1转染效果鉴定成功构建稳定表达IGF-1的ADSCs细胞株，证实转染后细胞在mRNA及蛋白水平均获得IGF-1的高表达，而在未转染组及空载体组则无特异性表达，见图3。

2.3 细胞-支架复合物的形态学观察 D组细胞-支架复合材料表面光滑，有光泽，弹性好；C组次之；A、B组细胞-支架复合材料表面欠光滑，无光泽，质软，弹性差。苏木精-伊红染色显示，D组的细胞生长密度明显高于其他3组，并有更多的基质分泌；同时也发现动态压力条件下的细胞生长分布较为均匀，而静态培养条件下的细胞则多分布于支架表面，见图4。

甲苯胺蓝染色显示，各组均有丰富的软骨特异性蛋白多糖分泌，D组的细胞外基质染色强，分布均匀；B组细胞-支架复合物的顶部及边缘有更多的细胞外基质染色；C组的染色较B组弱，但分布更为均匀；A组细胞密度较小，分布欠均匀，只有顶部区域着色且颜色较淡，见图5。

2.4 细胞增殖能力检测应用MTT法绘制细胞增殖曲线，见图6。

2.5 各组糖胺聚糖含量比较见表2。 2.7 各组细胞内钙离子含量检测结果应用激光共聚焦技术观察各组细胞内钙离子浓度的差异，见图8。B、C、D组的钙离子含量高于A组(P < 0.01)，D组高于B、C组(P < 0.01)，B组高于C组(P < 0.01)，见表2。

2.6 各组软骨相关基因检测结果 RT-PCR检测结果显示，经过相应实验因素刺激后，B、C、D组细胞-支架复合物的胰岛素样生长因子1、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和Sox-9 mRNA表达均较A组显著上调(P < 0.01)，D组高于B、C组(P < 0.01)，B组高于C组(P < 0.01)；4组间Ⅹ型胶原mRNA表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图7。

2.7 各组细胞内钙离子含量检测结果应用激光共聚焦技术观察各组细胞内钙离子浓度的差异，见图8。另外，实验发现一个有趣的现象，各组ADSCs的细胞内钙离子浓度在实验因素干预下达到峰值的速度存差异，C组峰值出现较早(约为30 s)，平均荧光强度略差；B组峰值出现相对较晚，约为60 s，但平均荧光强度值较强；D组峰值出现的速度和平均荧光强度值均存在明显优势，见图8。

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引言

脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)同骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能，并因其具有来源广泛、容易获得、增殖能力强等诸多优点日益引起研究者的广泛关注。近年来，研究者利用ADSCs在体内外成功构建了组织工程软骨，显示出ADSCs具有很强的成软骨分化能力，且能够保持稳定的软骨细胞表型，使之有望成为软骨组织工程领域理想的种子细胞[1-3]。
在组织工程软骨研究领域中，生长因子和施加力学刺激手段均被用于诱导、加速或促进种子细胞成软骨分化。胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)被认为是调节软骨形成和代谢最关键的细胞因子。作者的前期研究表明，IGF-1基因转染ADSCs能够显著促进细胞增殖，提高细胞外基质中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的含量，上调低氧诱导因子1α的表达，IGF-1和骨形态发生蛋白2联合转染可更为明显地增加其软骨基质合成[4-5]。适当的力学环境作为一个必要的物理性刺激因素可在一定程度上克服传统组织工程软骨培养条件的不足，改善其组织结构和提高其力学性能，模拟体内环境，从而更适应关节软骨修复的需要[6-8]。但是，对于机械应力促进ADSCs成软骨分化的理化机制尚不明确。实验将机械应力因素与基因转染技术结合体外构建组织工程软骨，目的在于研究周期性动态压力联合IGF-1基因转染对于诱导ADSCs成软骨分化的影响，通过观察二者对细胞内钙离子浓度及软骨相关基因表达的影响，初步探讨机械应力促进ADSCs成软骨分化的作用机制，为组织工程软骨的研究提供新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2017年8月至2019年5月在中国医科大学附属盛京医院小儿外科中心实验室完成。
1.3 材料 pcDNA3.1-IGF-1由吉林大学徐莘香教授馈赠。壳聚糖/明胶复合支架由天津大学生物材料研究所制造，壳聚糖/明胶比例为1∶1，圆片状，厚度为3 mm，直径为15 mm，孔径100-200 μm。
1.3.1 实验动物成年清洁级新西兰大白兔8只，体质量(2.31±0.42) kg，由中国医科大学附属盛京医院小儿外科中心实验室动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK (辽)2003-0019。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。动物实验方案经中国医科大学实验动物福利与伦理委员会批准。
1.3.2 实验试剂与仪器 DMEM-HG及标准胎牛血清(Hyclone，USA)；Ⅰ型胶原酶、MTT (Biosharp，USA)；Trizol(Invitrogen，USA)；1，9-二甲基亚甲蓝、硫酸软骨素及木瓜蛋白酶(Sigma，USA)；鼠抗人CD44、CD109单克隆抗体(中杉金桥，中国北京)；反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa，Japan)；Fluo 4-AM(Dojindo Laboratory，Kumamoto，Japan)；压力型生物反应器(BIODYNAMIC TM5110，Bose，USA)；酶标仪Elx808(BioTek，USA)；S1000TM Thermal Cycler(Bio-RAD，USA)；LightCycler荧光定量PCR仪(Roche，Switzerland)；激光共聚焦显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)。
1.4 实验方法
1.4.1 ADSCs的基因转染采用Ⅰ型胶原酶消化法，经过密度梯度离心分离、培养兔ADSCs[4-5，9]，应用免疫荧光法分析细胞表面相关标记物CD44、CD109的表达，按1∶2比例传代，传至第3代备用。
利用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导的基因转染法转染脂肪间充质干细胞。取第2代ADSCs，以0.5×106/孔接种于6孔板中孵育过夜，次日细胞融合密度至90%时随机分为未转染组、转染空载体pcDNA 3.1组及转染质粒pcDNA3.1-IGF-1组，利用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导的基因转染法转染空载体pcDNA3.1、真核表达质粒pcDNA3.1-IGF-1，转染后24 h按照1∶20比例传代，48 h后利用G418筛选(G418筛选质量浓度为500 mg/L，维持质量浓度为200 mg/L)，挑单克隆传代培养以获得稳定表达pcDNA3.1-IGF-1的细胞株。
采用RT-PCR及Western blot法检测转染后细胞中IGF-1的表达。①RT-PCR检测：分别提取各组细胞总RNA，反转录合成第一链cDNA，以cDNA为模版PCR扩增IGF-l及内参β-actin，共计30个循环，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳结果；②Western blot检测：收取各组细胞，裂解提取蛋白并定量，经SDS·PAGE电泳、转膜、一抗杂交(IGF-l鼠抗人单克隆抗体)，滴加AP标记的二抗，底物显色Western blot法检测IGF-l蛋白表达。
1.4.2 支架材料的处理按环氧乙烷消毒操作规程，将壳聚糖/明胶复合支架材料分装、消毒，真空包装封存，紫外灯下照射备用，实验前以10 mL完全培养基(DMED-HG)于37 ℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中预湿30 min。
1.4.3 细胞的接种与分组培养实验均以壳聚糖/明胶复合支架材料作为ADSCs三维立体培养的载体，负载或不负载IGF-1基因转染的第3代ADSCs。
将壳聚糖/明胶复合支架材料置于6孔培养板中，分4组干预：①A组滴加200 μL的ADSCs悬液，细胞浓度为5×1010 L-1，温箱孵育4 h，待细胞附着贴壁后，每孔加5 mL DMED-HG完全培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养2 d，期间换液一次，继续静态培养7 d；②B组滴加200 μL的IGF-l转染ADSCs悬液，细胞浓度为5×1010 L-1，温箱孵育4 h，待细胞附着贴壁后，每孔加5 mL DMED-HG完全培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养2 d，期间换液一次，继续静态培养7 d；③C组滴加200 μL的ADSCs悬液，细胞浓度为5×1010 L-1，温箱孵育4 h，待细胞附着贴壁后，每孔加5 mL DMED-HG完全培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养2 d，期间换液一次，随后进行动态压力培养(2%形变，频率1 Hz)，加压20 min，间歇20 min，每天6个循环周期，继续培养7 d；④D组滴加200μL的IGF-l转染ADSCs悬液，细胞浓度为5×1010 L-1，温箱孵育4 h，待细胞附着贴壁后，每孔加5 mL DMED-HG完全培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养2 d，期间换液一次，随后进行动态压力培养(2%形变，频率1 Hz)，加压20 min，间歇20 min，每天6个循环周期，继续培养7 d。
1.4.4 组织形态学观察 7 d后收集标本，以PBS漂洗二三遍，观察标本大体形态变化的差异。常规固定，包埋，切片，应用苏木精-伊红染色及甲苯胺蓝染色观测细胞在支架上的分布及细胞外基质分泌情况。
1.4.5 MTT法绘制细胞增殖曲线培养1，3，5，7 d时，应用MTT法观察细胞-支架复合物的吸光度(A)值。选取490 nm波长读取A值，每组设有3个平行实验，计算各组平均值，以时间点为X轴，不同时间点各组的平均值为Y轴，绘制细胞增殖曲线。
1.4.6 糖胺聚糖含量测定 7 d后，应用DMMB法测定细胞外基质中糖胺聚糖含量。取出细胞-支架复合物，冷冻干燥后剪碎，加入300 μL木瓜蛋白酶溶液(5 g/L，pH=6.5)，65 ℃水浴中消化16 h，取250 μL上述孵化消化液加入2.5 mL(1，9)-二甲基亚甲蓝溶液(16 mg/L，pH=2.0)，5 min后于525 nm波长比色测定A值，制作标准曲线，计算糖胺聚糖含量。标准品为硫酸软骨素。
1.4.7 RT-PCR 检测 7 d后，取各组细胞/支架复合物，以Trizol裂解细胞，提取总RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行反转录操作，然后以第一链cDNA为模板，应用real time PCR 法(两步法扩增程序，20 μL反应体系)定量检测组织工程软骨中IGF-1、Ⅱ型胶原、X型胶原、蛋白聚糖和Sox-9基因的相对表达。以GAPDH作为内参，应用2−ΔΔCt法比较各组中相关基因相对表达水平。

引物的设计与合成委托大连宝生物公司完成，反应条件及产物长度见表1。

1.4.8 细胞内钙离子含量测定细胞内钙离子能够被荧光探针Fluo 4-AM特异性标记。7 d后，按照Fluo 4-AM说明书进行标记细胞/支架复合物上的ADSCs(工作液中含
5 μmol/L Fluo 4-AM和0.1% Pluronic F-127)，37 ℃孵育
1 h后，按照原定的实验因素干预20 min，收集标本，立即于激光共聚焦显微镜下观察(激发波长490 nm，发射波长528 nm)并测定相应的荧光强度值。按照预先设定的程序，在20倍物镜条件下每个视野随机选取15个细胞，每10 s记录一次信息，总时间为5 min，计算各组得平均荧光强度值，分别用以代表相应的细胞内钙离子浓度，比较各组之间的差异。
1.5 主要观察指标各组细胞-支架复合物组织形态学观察，复合物中细胞增殖、糖胺聚糖与钙离子含量及软骨相关基因的相对表达。
1.6 统计学分析实验数据以x±s表示，由第一作者采用SPSS 13.0软件对实验结果进行方差分析和student-Newman-Keuls检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

虽然动态压力联合转化生长因子β等相关基因转染促进骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究已有报道[10-12]，但关于动态压力联合IGF-1转染促进ADSCs成软骨分化的研究国内外尚鲜有报道，对于动态压力促进ADSCs成软骨的作用机制尚无定论。作者前期通过研究发现，动态压力和IGF-1基因转染能够有效上调ADSCs表达低氧诱导因子1α，低氧诱导因子1α表达与细胞成软骨分化密切相关。此次实验进一步探讨动态压力联合IGF-1基因转染是否能有效促进ADSCs成软骨，同时初步探索钙离子通道在其过程中的重要作用。
ANDERSON等[13]综述分析显示，不同的机械应力均可有效促进种子细胞表达软骨细胞表型，利于构建组织工程软骨，但对于机械应力的频率、负荷大小、作用时间等关键因素仍然无统一的标准。此次实验发现相对于静态培养，在1 Hz动态压力培养条件下三维支架上的ADSCs增殖更为旺盛，分布更为均匀，同时软骨相关基因如Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等明显上调，软骨特异性细胞外基质糖胺聚糖的分泌明显增加，这说明动态压力刺激能够有效促进ADSCs增殖、成软骨分化及合成和分泌软骨特异性细胞外基质。但是，似乎单纯压力条件并不能十分有效地诱导ADSCs成软骨分化，因为单纯基因转染组的各项增殖、软骨分化等相关指标均明显优于单纯动态压力组。在动态压力与IGF-1转染联合培养的条件下二者存在明显的协同作用，可见动态压力可以有效促进IGF-1对ADSCs的成软骨分化作用，可以更为显著地提高组织工程软骨的机械性能，说明动态压力与IGF-1转染联合培养远远优于二者的单独作用。同时实验检测了Ⅹ型胶原的表达，结果发现各组之间无明显差异，说明在设定的实验条件下组织工程软骨没有向肥大软骨分化的趋势，这是十分重要的。软骨细胞是一种机械力传导的传感器和力学刺激的效应器，软骨细胞功能的变化主要取决于细胞因子表达的变化。同样，机械压力决定了以细胞因子为媒介的干细胞分化途径。此次实验证实，动态压力上调ADSCs的IGF-1和Sox-9表达。众所周知，Sox-9是调节干细胞成软骨分化的重要基因[14-15]，是调控动态压力促进干细胞成软骨分化的早期反应基因[16]。同时，活化和上调的Sox-9表达进一步诱导Ⅱ型胶原的表达和合成。现有的证据表明，IGF-1的表达与细胞暴露于机械压力条件之下具有高度的相关性[17]。IGF-1的自分泌可能与机械应力刺激和细胞自身的反应有关[18]。总之，普遍公认IGF-1可以上调干细胞Sox-9的表达。此次实验发现相比于二者单独作用，动态压力联合IGF-1基因转染能够更加有效上调Sox-9的表达。对于这一现象的可能解释为：IGF-1首先触发和激活细胞内Sox-9的表达，动态压力进一步协同上调Sox-9的表达水平。此次实验证实，Sox-9是调控动态压力促进ADSCs成软骨分化的关键反应基因。
研究表明，适当的力学刺激能够促进间充质干细胞向软骨细胞分化，并分泌软骨基质[19-20]。那么，动态压力诱导干细胞成软骨分化的机制是什么呢? 目前的研究揭示，细胞内钙离子及钙离子通道在这种信号转导中起着极为重要的作用[21]。GUILAK等[22]研究发现，在机械压力作用于软骨细胞的条件下，最早发生的事件之一就是细胞内出现一个钙离子浓度的瞬时变化，这种钙离子浓度的变化是通过机械敏感通道来实现的。LV等[23]的研究提示，在10%的机械应变作用于软骨细胞时其细胞膜上的受体电位香草醛亚家族4、机械敏感性离子通道和电压门控通道均被激活。此次实验研究发现，单纯动态压力组的细胞内平均钙离子浓度明显高于A组(对照组)，说明动态压力通过特异性钙离子途径诱导ADSCs成软骨分化。同时，各实验组细胞内钙离子浓度和达到荧光强度峰值的速度均存在明显差异，这说明动态压力和IGF-1转染均能够通过钙离子通道影响细胞内钙离子浓度的变化；而基因转染与动态压力联合应用组的细胞内平均钙离子浓度明显高于二者的简单加和，说明动态压力与基因转染对细胞内钙离子的影响可能为一种协同作用。
综上，作者认为动态压力通过开放ADSCs细胞膜钙离子通道激活特异性钙离子途径，然后诱导ADSCs上调Sox-9的表达和成软骨分化，并使软骨相关特异性细胞外基质分泌增加。类似于动态压力，IGF-1基因转染也上调了Sox-9基因的表达，所以推测Sox-9基因应该为动态压力与IGF-1 基因转染共同的靶基因。动态压力联合IGF-1基因转染能够有效诱导ADSCs成软骨分化，体外构建组织工程软骨，并且获得良好的机械性能，具有良好的临床应用前景。当然，目前国内外关于最佳的压力培养体系条件(压应力强度、频率、负荷/间歇时间等)的选择仍然存在很大争议，仍需进一步实验探究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

动态压力联合胰岛素样生长因子1基因转染对壳聚糖/明胶支架中兔脂肪间充质干细胞成软骨分化的影响

Effect of dynamic compression combined with insulin-like growth factor-1 gene transfection on chondrogenic differentiation of rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells in chitosan/gelatin scaffolds

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