2.1  实验动物数量分析  因天气炎热、艾条烟灰等吸入呼吸道导致大鼠出现摇尾、高热、吐涎等症状发生死亡。热敏灸14 d组死亡5只，剩余10只。正常组、模型组、热敏灸4 d组、热敏灸7 d组大鼠未发生死亡，每组10只。

2.2  骨质疏松症模型评价  连续5 d取得各组大鼠阴道分泌物涂片，正常组大鼠呈现动情前期→动情期→动情后期→动情间期的规律变化；其余模型组大鼠则表现为混乱的不规则动情周期改变，大多数涂片显示造模大鼠一直处于动情间期状态，细胞总数偏少，有核上皮细胞和白细胞共存，偶见角化细胞，证实造模成功。

2.3  浅筋膜内纤维走形结果  模型组细胞外基质内的纤维走形纵横交错成众多纤维网，热敏灸4，7 d组细胞外基质内的纤维排列没有明显改变，不同的是随着纤维弯曲度的增加，其排布逐渐规则起来，随着热敏灸时间延长至14 d变化逐渐突显，细胞外基质内的纤维在热敏灸外力的带动下被拉伸牵引，张力增加，总体趋势呈现向心性排布，即朝向施灸部位“命门”穴的周围，见图1。

2.4  脊髓组织学改变  脊髓苏木精-伊红染色总体变化不明显，热敏灸4 d组与模型组比较，脊髓无特殊变化，见图2；热敏灸7 d组前角内运动神经元细胞数量有所增加且体积增大，细胞核居中深染，后角处神经胶质细胞密度增加，见图2；热敏灸14 d组前角神经元细胞数目增加显著且体积增大，细胞核较大而圆，核仁明显，神经纤维增粗增长，排列规律，后角处神经胶质细胞数目明显增加且更加致密，见图3。

2.5  热敏灸14 d治疗前后血清磷、钙、碱性磷酸酶浓度的差异  经热敏灸14 d治疗后大鼠血清磷浓度和碱性磷酸酶浓度明显上升(P < 0.01)，钙离子浓度略有下降(P < 0.05)，见表1。

据流行病学统计，全世界骨质疏松症患者己超过2亿人口，中国约占40%^[1]；在美国，每年用于骨质疏松性骨折的健康保障经费约138亿美元^[2]；在英国，每年仅用于治疗因骨质疏松症所致的髋部骨折这一项的直接费用就高达6.41亿英镑^[3]，这充分说明了骨质疏松症这一疾病给患者自身生活以及社会带来了巨大的压力和负担。根据发病原因的不同，就亚洲和白人妇女而言绝经后骨质疏松症的发生率为20%-50%^[4]。

现代医学治疗原发性骨质疏松症采用抑制骨吸收、骨矿化药物和促进骨形成三大类药物，虽在前期疗效明显，但其不良反应亦不可小觑。20多年前，陈日新教授等^[5-7]提出了一种“腧穴热敏化悬灸疗法”，简称“热敏灸疗法”，因其环保、无痛苦、无不良反应等优点逐渐被大家熟悉。热敏灸疗法是以中医的经络穴位为基础，通过艾灸体表的“热敏化穴”，以求产生一种“小刺激大反应”的效果，即从点、面、深部扩散热力的传导，被灸者不能感觉到近处或体表的热量，反而在远端深面感知，出现的一种酸胀、重痛、麻酥等数种灸疗现象，促进气血运行，直达病所。目前，热敏灸疗法已广泛应用于诸如面瘫、结缔组织疾病和妇科等多种病种，在60余类热敏灸高频治疗疾病当中，骨质疏松症收效亦佳^[8-9]。

绝经后骨质疏松症患者大多表现为骨的畸形、乏力、背痛腰酸等症状，祖国传统医学中并没有骨质疏松症这一病名术语，而是将其归属至肢体经络病症，如“痿、痹”等范畴。中医内科学认为其病因病机包括肾精不足、骨络空虚、瘀痹成患等几个方面^[10]。早在《素问》中就有学者提出肾主骨的观点，还有《素问·脉要精微论篇》也明确阐述了肾主骨、骨生髓之间的关系；反之，如果肾精缺乏，会间接影响到骨髓的减少从而导致骨软、骨脆等症状，详细阐明了三者之间密切关系。该课题选用的热敏化穴即是位于督脉上的“命门”穴。“命门”穴被称之为生命大门，陈士铎在《石室秘录》中说到“发挥命门的作用，肾气则能充沛顽强”，其具有固本强肾、益精生髓、疏经和血的作用，正契合“骨痿”一病的病因病机。

将筋膜理论与经络结合，白宇等^[11]首先利用数字人研究经络的形态结构，发现重建的经络与国标记载的走形分布多处重合，再利用计算机自动识别分析基本可以确定在经络腧穴附近能产生较强的结缔组织生物信息；姜雪梅  等^[12]也致力于该方面的研究，她从针刺入手对大鼠皮下筋膜进行针刺疗法，同样发现丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号在样本中的结缔组织内呈现出有规律的传导，且对中枢神经系统也有一定的影响。

上述学者以及广大从事这方面研究的学者所做出的成果，都为该课题提供了理论支撑。就热敏灸其机制而言，特别是热敏灸信号是如何传导到“病所”以及热敏灸的最佳疗程是多少等问题尚未见足够的研究报道。因此，实验从结缔组织以及神经系统角度对热敏灸的机制进行探讨，并试图从不同疗程的角度去探讨热敏灸的最佳疗程时间。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年4月至2018年3月在江西中医药大学中医学院实验中心科研平台完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物及分组  选SPF级雌性SD大鼠55只，体质量180-220 g，两三个月龄，购买于安徽医科大学，实验动物合格证编号：SCXK(皖)2017-001，实验动物质量检测单位：安徽省实验动物质量监督检测中心。购进大鼠之后，为保证大鼠的生命体征稳定，先将所有大鼠放入20 ℃、50%湿度环境中适应性喂养5 d之后随机分为5组：正常组(n=10)、模型组(n=10)、热敏灸4 d组(n=10)、热敏灸7 d组(n=10)和热敏灸14 d组(n=15)，后4组制备骨质疏松症模型。

1.3.2  实验主要设备与试剂  CX41型倒置相差显微镜(日本OLYMPUS)；小型台式离心机(Eppendorf公司)；正电荷防脱黏附载玻片(江苏世泰实验仪器有限公司)；PBS(pH 7.2-7.4)(北京中杉金桥生物有限公司)；高效切片石蜡(上海华申康复器材有限公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)；C006-3无机磷测试盒(南京建成生物工程研究所)；A059-2碱性磷酸酶测试盒(南京建成生物工程研究所)；C004-2钙测试盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4  实验方法

1.4.1  骨质疏松症模型的制备  采用双侧卵巢摘除法制备骨质疏松症模型，约3周后对大鼠阴道分泌物取样，通过瑞氏染色观察分泌物中各细胞的数量和动情周期变化，1次/d，连续5 d^[13]。

1.4.2  热敏灸治疗  选穴：以华兴邦的大鼠穴位图谱作为主要定穴参考，寻找大鼠第2腰椎棘突下凹陷处，即“命门”穴，进行热敏灸。热敏灸操作：将大鼠固定在大鼠固定架上，剔去穴区长毛，用体积分数为95%乙醇引燃艾条，于上午9点开始进行热敏灸治疗，40 min/次，1次/d，治疗时间分别为4，7，14 d。

1.4.3  取材及染色方法 

(1)浅筋膜：将长毛剔除后浸泡在盛有体积分数为95%乙醇容器内数分钟，取穴区周围0.5-1.5 cm的皮下浅筋膜，用大头针平铺在黏附性载玻片上，随后滴加甲醇于组织表面(覆盖即可)，待自然干后将组织放在暗盒内置于2-8 ℃冰箱内过夜，24 h后即可行荧光染色观察。

(2)脊髓：将长毛剔除后浸泡在盛有体积分数为95%乙醇容器内数分钟，用组织剪从背部皮肤-肌肉逐层剪开直至暴露出棘突，左手持止血钳固定棘突，右手紧握咬骨钳沿椎弓根剪开，打开椎板小心切取出腰膨大区内的灰白色脊髓，按下述步骤进行苏木精-伊红染色，将取下的脊髓用包埋框装好放置在40 g/L多聚甲醛内固定3-5 d，流水冲洗   8 h。按脱水、透明和浸蜡等步骤包埋组织。将蜡块于切片机切下6 μm左右厚度，在水中按“直上直下”的原则迅速捞出，放入50 ℃后烘箱内烘烤至无水(约40 min)，最后进行透明、封固及拍照。

1.4.4  血清相关指标的测定  戴好无菌防咬手套将大鼠稳定于操作台边缘，左手紧捏颈部皮肤顺势固定大鼠头部，迫使被采眼球鼓出血液充盈饱满。用事先灭菌的毛细玻璃管(针尖斜面朝内)从目内眦沿着眼球表面滑到球后静脉处，并往同一方向旋转毛玻璃，两三圈后将EP管放置在眼眶下采血。根据说明书分别采用磷钼酸法、微量酶标法、微板法测量热敏灸14 d治疗前后大鼠血清磷、钙离子、碱性磷酸酶浓度。

1.5  主要观察指标  ①大鼠“命门”穴附近浅筋膜内纤维的走形；②脊髓前角细胞及后角胶质细胞的数量变化；③热敏灸14 d前后大鼠血清内磷、钙、碱性磷酸酶浓度的差异。

1.6  统计学分析  采用SPSS 22.0统计软件，数据以x(_)±s表示，统计前进行正态分布检验和方差齐性检验，选非独立两样本均数进行t 检验，α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

该实验主要从筋膜、脊髓角度探究热敏灸“命门”穴作用的基本机制，将不同疗程作为全文的主线，以期为临床实践奠定基本的理论依据。以下也将围绕这3个部分展开讨论，即热敏灸的作用机制、关于针灸时间的思考以及热敏灸对骨质疏松症相关指标的影响。

在热敏灸的作用下被拉伸牵引使得胶原纤维排列整齐，呈波浪式传递，单位面积内细胞数量明显增加。疏松结缔组织主要包含胶原纤维、网状纤维、弹性纤维，具有支持、保护及维持弹性与韧性等功能；就细胞而言主要包括纤维细胞、浆细胞、巨噬细胞等，各种细胞分工明确，各自发挥作用。有学者认为关于细胞信号的传导可分为4个基本阶段：①刺激耦联阶段；②生化耦联阶段；③细胞内生化信号转导阶段；④效应细胞反应阶段^[14]。由此可以联想热敏灸是先与结缔组织发生耦合，将热信号传导到结缔组织内使细胞内产生化学信号，间接引起基质产生变形，发生“波浪”式传导，通过纤维细胞发生逆行性收缩刺激整个间隙结缔组织形变，最终引动效应细胞产生反应。后角细胞主要接受后根的各种感觉纤维，其轴突主要有2种途径：后角细胞突起进入同侧或对侧白质成上行纤维束，并将神经冲动传至大脑；另一些则在脊髓节段之间发挥联系疏通的作用。当热刺激作用于大鼠皮肤时，皮肤上的效应器则能引发动作电位，将类同于脉冲电信号通过下行神经纤维传导至脊髓后角，从而刺激有关神经细胞。热敏灸14 d组前角神经元细胞和后角胶质细胞数目增加显著，再次验证了上述机制的发生与形成。

热敏灸疗法是经点燃的艾条激发“热敏化”腧穴，通过激发经络传感，促全身经气的运行，使得灸信号到达病灶并依据个体差异性给予饱和消敏灸量以获得最高效的一种新型疗法^[15]。总体归纳而言，即灸感、灸位、灸效、灸量(艾灸强度、面积、时间)的不同。但是不论在临床试验或是基础性实验中，对于灸感、灸位、灸量都还尚未界定清晰，同样也并非艾灸时间越长，艾灸灸量越大，产生的疗效就越好^[16]。中医的特色着重讲究整体观念和辨证论治，当因体质不同、年龄差异、病情迥异等，来选择合适的灸量，在基础实验中可适当扩大样本量，从多角度探索。由于灸量的操作方式存在局限性，而灸感的评价大多受主观因素的干扰，作者建议可将目光投入到对灸时间的探讨。不同疗程干预得出不同的治疗结果，综合该动物实验，即在一定时间范围内热敏灸治疗时间越长效果越显著，这有可能是因为热敏灸时间叠加产生的效果，热敏灸达到一定时间可以更大限度的激发机体的应激反应，达到最佳治疗效果。基于此，作者建议在临床试验或者临床治疗中推广以14 d作为一个基本的治疗周期。另外，普通的针灸疗法是否也存在这样的规律，还有待进一步探讨，需要通过大量的基础性实验和临床试验加以佐证。关于热敏灸的基础实验研究，经作者深刻思考认为存在3点模糊问题亟待解决：①在治疗疾病时关于组合配穴方面尚未明确，无规律可寻；②对于治疗周期、灸法灸量，不同疾病的相关参数不齐，实施起来时效关系混乱，不能提供一个相对量化、规范的操作准则；③针灸疗法大多仍停留在简单的临床观察，在实验方面有所欠缺，缺乏严格的数理统计分析。

目前热敏灸在治疗骨质疏松症方面的研究主要从观察血清生化指标、内分泌角度2个方面开展大量基础性实验。如李丰等^[17]热敏灸30例患骨质疏松症患者对比30例口服盖天力患者，发现热敏灸组总有效率高达约87%，盖天力组则低于10%，检测各组治疗前后的骨密度、尿钙/尿肌酐比值和碱性磷酸酶数值变化，热敏灸组提高了腰椎骨密度和降低了碱性磷酸酶、尿钙/尿肌酐比值，热敏灸组患者改善情况显著高于盖天力组(P < 0.05)。邹来勇等^[18-19]通过对60只大鼠构建骨质疏松模型，经热敏灸6个月检测到大鼠血清磷及碱性磷酸酶活性增强，血磷浓度略显降低(P < 0.05)。易静等^[20]将42例因肝肾不足而引起骨质疏松患者分为观察组(22例)和对照组(20例)，分别给予热敏灸和鲑降钙素治疗，热敏灸组总有效率明显高于鲑降钙素组(P < 0.05)，治疗1个月后热敏灸组降钙素水平显著升高，甲状旁腺激素水平显著减低。钙磷是骨组织的主要矿物质，有利于增加成骨细胞的活动。碱性磷酸酶作为成骨细胞分化的特异性指标之一，其在人体内的含量可以预见骨细胞的增殖情况。大量研究表明碱性磷酸酶可作为骨形成的特异性指标^[21]。热敏灸使得大鼠血清中碱性磷酸酶浓度上升，促成骨细胞活性及骨重建活跃性，增加骨密度，从而加速骨愈合。

展望：2018-03-28据英国《独立报》报道，美国科学家报出人类体内存在一种新的且最大的器官——间质器官，其解剖结构和生理功能与筋膜有着很大的关联性，许多前辈早已在研究筋膜、经络与三焦焦膜三者关系中收获颇丰，这无不启发可以将疾病的诊断、效应机制研究与治疗放眼于“间质器官”中来。例如热敏灸治疗的其他信号是如何传导的，与全身淋巴系统是否存在一定关联；从中医角度来看热敏灸治疗又是否同三焦、脏腑、经络之间有着奥秘的联系；针灸、气功的作用机制可否从“间质器官”着手等等，这一系列问题需要在科研实验的道路上不断探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

热敏灸疗法：是以中医的经络穴位为基础，通过艾灸体表的“热敏化穴”，以求产生一种“小刺激大反应”的效果，即激发透热、扩热、传热、局部不(微)热远部热、表面不(微)热深部热、非热觉等热敏灸感，出现的一种酸胀、重痛、麻酥等数种灸疗现象，促进气血运行，直达病所。

浅筋膜：居于真皮之下，薄软且富有弹性，由疏松结缔组织构成，主要包含大量基质、弹性纤维、胶原纤维和未分化的间充质细胞等，具有维持人体正常体温和保护深面组织的重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

热敏灸疗法作为中医的特色治疗手段，在临床中收效较好，因其环保、安全、无副作用等特点日益受到大众青睐，但就其作用机制而言目前尚未研究清楚，该文受前辈启发，着重从“筋膜”角度试图探寻热敏灸的内在机制。该领域国内研究主要以南方医科大学原林教授提出的“筋膜学说”为代表，他认为筋膜结缔组织有着类似又超于其他系统的功能。随着研究逐步深入，在2016年11月在《柳叶刀·胃肠与肝脏病学》论述了“肠系膜学说”，认为它是由腹膜衍生而来的双层结缔组织，并将腹腔内重要脏器包裹连接起来。不约而同，于2018年3月通过pCLE实现活体组织观察，惊人地发现了人类的“第三器官”---间质器官。结合国内外研究不难联想，这与中医学中的“三焦焦膜学说”“经络理论”等有着共通之处，但仍存在些模糊问题未能透彻阐明。在此，笔者寄希望于学术界，相信在不久将来能通过分子生物水平、基因组学等科学技术手段揭开它们神秘的面纱。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程