2.1  骨髓间充质干细胞的培养与鉴定  细胞接种24 h开始贴壁，形态为圆形，48 h后细胞形态变为短梭形，此后细胞数量快速增加；第3代细胞为长梭形，呈旋涡状排列，细胞数量较多，见图1。成脂诱导分化12 d，油红O染色可见橘红色的脂滴，见图2A；成骨诱导分化14 d，茜素红染色可见大量红色的矿化结节，见图2B。

流式细胞仪检测显示，骨髓间充质干细胞低表达CD34、CD45表面标记物，高表达CD73、CD90、CD105表面标记物，见图3。

2.2  基因转染效果  以Lenti-SOX9-EGFP慢病毒载体感染骨髓间充质干细胞48 h后，共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，可见大量的绿色荧光蛋白，说明慢病毒已成功导入骨髓间充质干细胞中，见图4A；流式细胞仪检测显示，转染48 h后的转染效率为(90.5±3.6)%，见图4B。Western blot方法检测细胞转染前后骨髓间充质干细胞内SOX9蛋白表达，见图5。

2.3  各组大体观察结果  术后4周，60只兔的关节液正常，膝关节内无滑膜炎症与骨赘形成，模型组软骨缺损部位未见修复，由纤维样组织填充；对照组可见清晰的软骨缺损轮廓；实验组也可见较清晰的缺损轮廓。术后12周，60只兔的关节液正常，膝关节内无滑膜炎症与骨赘形成，对照组缺损部位仍未见修复，由纤维样组织填充；对照组中央缺损区凹陷，可见明显的修复组织与周围正常软骨边界；实验组缺损部位由透明样软骨组织填充，无法区分新生软骨组织与周围正常软骨边界，见图6。

2.4  各组 Micro-CT三维重建结果  术后4周，模型组缺损部位未见明显修复，可见明显凹陷；对照组缺损部位周围可见修复，中央可见凹陷；实验组缺损部位可见明显的修复。术后12周，模型组缺损区域较术后4周稍有减少，但中央仍有较大的凹陷；对照组可见明显的修复，中央凹陷区域明显减小，可见较多的再生骨小梁结构；实验组缺损部位基本完成修复，见图7。

   术后12周，对照组骨体积分数、骨小梁厚度与骨小梁数量多于模型组(P < 0.05)，骨小梁间隙少于模型组(P < 0.05)；实验组骨体积分数、骨小梁厚度与骨小梁数量多于模型组(P < 0.05)，骨小梁间隙少于模型组(P < 0.05)；实验组骨体积分数、骨小梁厚度与骨小梁数量多于对照组(P < 0.05)，骨小梁间隙少于对照组(P < 0.05)，见表2。

2.5  各组苏木精-伊红染色结果  术后4周，模型组缺损区可见较大的凹陷，由无定形组织填充；对照组缺损区域可见少量骨组织重建，缺损区域由成纤维组织与软骨样组织填充；实验组缺损区域可见较多的骨组织重建，缺损区域由软骨样细胞与软骨样细胞外基质填充。术后12周，模型组缺损区仍未见骨小梁结构，细胞分布紊乱，未见软骨陷窝；对照组可见较多的骨组织重建，缺损区域主要由软骨样组织与纤维组织填充，表面不规则；实验组骨组织重建较充分，缺损区域主要由软骨样细胞与软骨样细胞外基质填充，表面光滑，细胞呈柱状排列，与周围软骨相似，见图8。

2.6  各组番红O染色结果  术后4周，模型组基本未见糖胺多糖表达，对照组也未见明显的糖胺多糖表达，实验组可见明显的糖胺多糖表达；术后12周，模型组可见少量糖胺多糖表达，对照组可见较多的糖胺多糖表达，实验组糖胺多糖表达最多，见图9。

2.7  各组Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果  术后4周，模型组未见Ⅱ型胶原表达，对照组可见少量Ⅱ型胶原表达，实验组Ⅱ型胶原表达多于对照组；术后12周，模型组仍未见Ⅱ型胶原表达，对照组可见大量的Ⅱ型胶原表达，实验组Ⅱ型胶原表达最多，与周围正常软骨类似，见图10。

2.8  各组组织学评分结果  随着术后时间的延长，3组Wakitani软组织损伤修复组织学评分逐渐降低，对照组、实验组术后4，12周的评分低于模型组(P < 0.05)；实验组术后4，12周的评分低于对照组(P < 0.05)，见表3。

关节软骨是人体重要的结缔组织，由软骨组织与周围的软骨膜组成，主要起保护、支撑、分散应力与减小震荡等作用，但由于其无血管、神经与淋巴通过，一旦损伤难以自行修复，目前尚缺乏有效的治疗手段。因此探讨更好的软骨缺损修复方法具有重要的临床意义。组织工程学的出现为软骨损伤修复提供了新的思路，并且随着组织工程技术的发展，软骨缺损修复研究取得了较大的进展。

利用组织工程学方法修复软骨损伤是目前的研究热点之一。组织工程的3大要素为种子细胞、支架材料与细胞因子。骨髓间充质干细胞在体、内外可定向分化为多种间充质细胞^[1-3]，为组织工程中最重要且应用最广泛的种子细胞之一。Pluronic F-127是一种聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯三嵌段共聚物，具有在低温下为液态、常温下为固态的特性，为温固化水凝胶，具有良好的生物相容性与生物可降解性^[4-5]。作为组织工程中的细胞支架，Pluronic F-127已被广泛应用于软骨与皮肤等的构建。SOX9基因在软骨的分化形成中发挥着重要作用，是软骨分化必须的转录因子，并且研究证实其不仅影响间充质干细胞的凝集，还决定间充质干细胞向软骨细胞的分化^[6-7]。有研究显示，以慢病毒作为载体将SOX9基因转导至骨髓间充质干细胞中，体外培养后植入兔股骨滑车关节面全层关节软骨损伤模型中，发现其促进软骨缺损修复的作用强于单纯骨髓间充质干细胞。预实验显示，SOX9基因转染的骨髓间充质干细胞可在Pluronic F-127水凝胶内良好的生长与增殖，促进细胞外基质的分泌，增加软骨基质的表达。因此，实验利用慢病毒基因诱导方式将SOX9基因转导至骨髓间充质干细胞中，将其与可注射Pluronic F-127水凝胶复合，观察Pluronic F-127水凝胶复合物修复软骨缺损的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  对比观察动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年1至12月在武汉科技大学完成。

1.3  材料  Pluronic F-127购自上海一研生物科技有限公司，见表1。

实验动物：4月龄与4周龄健康雄性新西兰大白兔，4月龄兔体质量(2.23±0.32) kg，4周龄兔体质量(1.57±0.26) kg，均由武汉科技大学实验动物中心提供。实验获得武汉科技大学伦理委员会批准。

主要试剂与仪器：Lenti-SOX9-EGFP慢病毒载体委托云舟生物科技(广州)有限公司设计并合成；戊巴比妥钠购自武汉易泰科技有限公司上海分公司；DMEM/F12培养液购自武汉普诺赛生命科技有限公司；鼠抗兔Ⅱ型胶原购自购自广州市肖悦生物科技有限公司；生物素标记山羊抗小鼠IgG二抗购自厦门慧嘉生物科技有限公司；C2共聚焦显微镜购自北京美嘉图科技有限公司；BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪购自北京科誉兴业科技发展有限公司；细胞培养箱购自广州市康恒仪器有限公司。

1.4  方法

1.4.1  骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定  取3只4周龄新西兰大白兔，6%戊巴比妥钠25 mg/kg耳缘静脉注射麻醉后脱毛、消毒，切开皮肤及皮下组织，暴露股骨近端干垢端，每侧抽取骨髓3.0-4.0 mL，将骨髓以100目钢网过滤后置于离心管内，以骨髓稀释液稀释后800 r/min离心8 min，去除最上层的脂肪，反复吹打制成单细胞悬液，以8×10⁴/cm²的细胞密度接种于培养瓶内，然后置于37 ℃、体积分数5%二氧化碳培养箱内培养，4 d后半量换液，以后每48 h全量换液。当细胞达到80%融合时进行传代培养。选择第3代细胞进行移植实验。

  取第3代骨髓间充质干细胞，利用流式细胞仪检测细胞表面标记物，并分别进行成脂与成骨诱导分化^[8]，鉴定骨髓间充质干细胞的多向分化能力。

1.4.2  骨髓间充质干细胞的基因转染  取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后离心重悬，制成细胞浓度为1×10⁸ L^-1的细胞悬液，接种于培养皿内，待细胞达到80%融合时，加入无血清的DMEM/F12培养液、Lenti-SOX9-EGFP慢病毒载体与感染增强液，感染复数MOI=50，然后置于37 ℃、体积分数5%二氧化碳培养箱内培养。转染后48 h，胰酶消化细胞后收集细胞，PBS清洗离心2次后调整细胞浓度为5×10⁸ L^-1，共聚焦显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况；取200 µL细胞悬液，流式细胞仪检测细胞转染效率。参照以往文献方法^[9]，采用Western blot方法检测细胞转染前后骨髓间充质干细胞内SOX9蛋白表达。

1.4.3  Pluronic F-127水凝胶复合物的制备  将Pluronic F-127分装于安瓿瓶内，每瓶2 g，⁶⁰Co消毒灭菌，在每瓶中加入5 mL PBS制备Pluronic F-127水凝胶。①复合物1：取未转染的骨髓间充质干细胞，胰酶消化后1 500 r/min离心5 min，重悬细胞，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1；在5 mL离心管内分别加入Pluronic F-127水凝胶0.5 mL与未转染骨髓间充质干细胞悬液0.5 mL^[10]，制作复合物1，4 ℃密封保存。②复合物2：取基因转染48 h的骨髓间充质干细胞，胰酶消化后1 500 r/min离心5 min，重悬细胞，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1；在5 mL离心管内分别加入Pluronic F-127水凝胶0.5 mL与转染的骨髓间充质干细胞悬液0.5 mL，制作复合物2，4 ℃密封保存。

1.4.4  兔软骨缺损模型的制备  取60只4月龄新西兰大白兔，6%戊巴比妥钠25 mg/kg耳缘静脉注射麻醉后脱毛、消毒，在右侧膝关节髌骨内侧做一长约2 cm的切口，逐层切开皮下组织、筋膜与关节囊，充分暴露股骨内侧髁，在内侧髁处制造长4. 5 mm、宽3 mm、深度4.5 mm的锥形缺损，生理盐水冲洗后随机分3组处理：模型组缺损处不植入任何材料，对照组缺损处植入复合物1(Pluronic F-127水凝胶与未转染骨髓间充质干细胞复合物)，实验组缺损处植入复合物2(Pluronic F-127水凝胶与基因转染骨髓间充质干细胞复合物)，每组20只。复位髌骨后逐层缝合，单笼饲养，自由活动，术后肌注青霉素预防感染。

1.4.5  取材  术后4，12周每组各取10只兔，麻醉后处死，取缺损部位组织进行大体观察，随后剔除股骨周围的肌肉及软组织，进行各种相关检测。

1.5  主要观察指标

Micro-CT三维重建：将股骨样本置于体积分数10%甲醛中固定48 h，随后置于样本槽内进行Micro-CT扫描和三维重建，观察各组软骨缺损修复情况，同时利用Micro-CT自带的Scanco分析软件分析骨小梁间隙、骨小梁厚度、骨小梁数量与骨体积分数等参数。

苏木精-伊红染色：将股骨样本置于体积分数10%甲醛中固定48 h，完全浸入脱钙液中脱钙20 d；完全脱钙后将标本分别依次以体积分数90%，100%乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋标本，矢状位切片，切片厚度为5 µm，进行常规苏木精-伊红染色，乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封固，镜下观察。

番红O染色：参照苏木精-伊红染色制作切片，融蜡、脱蜡，苏木精染色2 min，自来水冲洗6 min，盐酸乙醇清洗2次，自来水清洗2 min，固绿染色6 min，1%乙酸冲洗5 s，自来水冲洗1 min，番红染色6 min，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封固，镜下观察。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：参照苏木精-伊红染色步骤制作切片，常规脱蜡至水，加入0.1%胰蛋白酶工作液抗原修复15 min，加入正常山羊血清封闭液室温孵育15 min，PBS清洗后加入按1∶200稀释的鼠抗兔Ⅱ型胶原，4 ℃孵育24 h；加入生物素标记山羊抗小鼠IgG二抗37 ℃孵育 30 min，DAB显色5 min，苏木素染液染核数秒，脱水、透明、中性树脂封固。

组织学评分：结合苏木精-伊红染色、番红O染色与Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对缺损处组织进行Wakitani软组织损伤修复组织学评分，该评分包括细胞形态、修复组织表面平整度、修复组织厚度、修复组织与周围软骨的结合情况与Ⅱ型胶原染色5个方面，得分越低修复效果越好。

1.6  统计学分析  采用 SPSS 23.0统计软件进行数据处理，Wakitani软组织损伤修复组织学评分以x(_)±s表示，多组间比较进行方差分析，两两比较进行SNK法，均以P < 0.05为差异有显著性意义。

SOX9基因在性别决定与分化过程中具有重要的作用，在胚胎发育过程中参与骨的形成，同时其也参与神经系统与胰腺的发育及肿瘤的发生^[11-13]。在骨骼形成过程中，SOX9通过与DNA特定区域结合促进间充质细胞的聚集：首先是在软骨前体细胞中，随后是在分化中的或成熟的前体细胞中表达，维持软骨细胞增殖，抑制其向肥大软骨细胞分化^[14]，因此SOX9在软骨形成过程中起着十分重要的作用。在软骨分化过程中，软骨细胞中的SOX9表达呈先升后降的趋势，其可激活大量软骨特异性基因表达，比如：细胞外基质、聚集蛋白聚糖、Col2a1、Col11a2等。为了获得较为长期、高效与局部的效果，同时避免直接应用生长因子可能发生的过量反应与全身毒副作用，实验采用慢病毒基因转染技术将SOX9基因转导至骨髓间充质干细胞中。相对于腺病毒载体与反转录病毒载体，慢病毒载体具有转移基因片段大、目的基因表达时间长、感染率高与免疫反应小等优势^[15-16]，为组织工程基因改造最具潜力的载体之一。实验共聚焦显微镜结果显示慢病毒已成功导入骨髓间充质干细胞中，并且具有较高的染效率，证实慢病毒载体是基因治疗较为理想的载体。

Pluronic F-127是被美国食品药品监督管理局批准用于人体的可注射温控性水凝胶，为一种聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯三嵌段共聚物，具有亲水性、良好的生物相容性与机械性能，被广泛用于骨、软骨、肌腱、上皮组织与脂肪组织的重建。同时由于特殊的分子结构，Pluronic F-127还可以作为药物与细胞因子的载体，稳定药物的生物结构，降低药物的降解^[17-18]。因此，实验选择Pluronic F-127水凝胶作为软骨再生的支架材料。

实验将负载SOX9基因的骨髓间充质干细胞与Pluronic F-127水凝胶复合物植入兔软骨缺损部位，结果显示软骨缺损部位生长出类似透明软骨的新生组织，同时可分泌正常的细胞外基质，Wakitani软组织损伤修复组织学评分与其他两组相比具有统计学意义，提示以骨髓间充质干细胞作为种子细胞、Pluronic F-127水凝胶作为支架材料、SOX9作为成软骨诱导因子的组织工程软骨成功修复了损伤的关节软骨。实验中模型组也有一定程度的自行修复，说明虽然受损软骨的修复能力极差，但是其仍可以通过募集机体干细胞等机制进行自行修复，可是其新生组织结构与正常关节软骨相差甚远，此种修复仅是对缺损部位的填充，并非从结构与功能上修复损伤的关节软骨。与实验造模相比，临床中的关节软骨损伤机制要复杂得多，软骨修复能力可能更差。对照组软骨缺损部位植入负载未转染骨髓间充质干细胞的Pluronic F-127水凝胶，其中骨髓间充质干细胞具有成软骨分化的能力，同时Pluronic F-127水凝胶可促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化，其修复效果虽然不及实验组，但是明显好于模型组，说明骨髓间充质干细胞与Pluronic F-127水凝胶对软骨损伤具有一定的修复作用，与以往的研究结果一致^[19-20]。但是实验观察周期较短，负载SOX9基因骨髓间充质干细胞与Pluronic F-127水凝胶复合物的软骨损伤修复效果还有待进一步的观察。

关于SOX9促进软骨形成的机制，目前认为主要有以下几个方面：①SOX9可在间充质干细胞直接激活细胞外基质基因，因Col2a1、Col11a2、软骨寡聚基质蛋白及蛋白聚糖的转录因子，使其高表达，而这些基因的表达产物均为软骨基质的重要组成成分；并且其也能促进多种软骨组织特异性蛋白的表达与多糖的生成；②SOX9通过抑制Wnt/-catenin信号通路与RUNX2转录因子来抑制软骨细胞的肥大及继续骨化，维持软骨细胞的形态与功能，这也是实验选择SOX9作为诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的重要原因之一；③SOX9可直接与甲状旁腺激素相关肽的启动子结合，增加其活性，而甲状旁腺激素相关肽被认为是促进软骨细胞增殖而抑制软骨细胞肥大及骨化的重要因子之一。

 实验结果说明以骨髓间充质干细胞作为种子细胞、Pluronic F-127水凝胶作为支架材料、SOX9作为成软骨诱导因子的组织工程软骨，可促进关节软骨损伤的修复，SOX9作为软骨形成与维持软骨形态的主要调控因子，将其应用于软骨组织工程学将是未来软骨损伤修复的重要方向之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

#br#

文题释义：

Pluronic F-127：是一种聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯三嵌段共聚物，具有在低温下为液态、常温下为固态的特性，为温固化水凝胶，具有良好的生物相容性与生物可降解性。作为组织工程中的细胞支架，Pluronic F-127已被广泛应用于软骨与皮肤等的构建。

SOX9基因：在性别决定与分化过程中具有重要的作用，在胚胎发育过程中参与骨的形成，同时其也参与神经系统与胰腺的发育及肿瘤的发生。在骨骼形成过程中，SOX9通过与 DNA 特定区域结合促进间充质细胞的聚集：首先是在软骨前体细胞中，随后是在分化中的或成熟的前体细胞中表达，维持软骨细胞增殖，抑制其向肥大软骨细胞分化，因此SOX9在软骨形成过程中起着十分重要的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

#br#

本实验将负载SOX9基因的骨髓间充质干细胞与Pluronic F-127水凝胶复合物植入兔软骨缺损部位，结果显示软骨缺损部位生长出类似透明软骨的新生组织，同时可分泌正常的细胞外基质，Wakitani软组织损伤修复组织学评分与其他两组具有统计学意义，提示以骨髓间充质干细胞作为种子细胞、Pluronic F-127水凝胶作为支架材料、SOX9作为成软骨诱导因子的组织工程软骨成功修复了损伤的关节软骨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程