2.1  实验动物数量分析  实验选用大鼠120只，共103只大鼠经链脲佐菌素诱导后，第8周空腹血糖≥11.1 mmol/L，挑选造模成功的糖尿病大鼠模型90只，随机分为3组，脑缺血再灌注模型构建手术中及术后均未发生大鼠死亡。 

2.2  小檗碱可减轻糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤  在体内实验中，首先评价了外源性给予小檗碱对糖尿病大鼠脑缺血/再灌注损伤的影响。所有缺血/再灌注组与缺血/再灌注+小檗碱组的大鼠模型均构建成功。经过生理盐水或小檗碱处理7 d后，缺血/再灌注组血糖为(23.1±4.11)mmol/L，缺血/再灌注+小檗碱组的血糖为(22.8±5.11)mmol/L，2组间的血糖水平未见显著的统计学差异。与缺血/再灌注组比较，缺血/再灌注+小檗碱组脑梗死体积明显缩小(P < 0.05，见图1)。苏木精-伊红染色显示缺血/再灌注组梗死区死亡细胞明显多于缺血/再灌注+小檗碱组(见图2A)。电镜观察显示，与缺血/再灌注+小檗碱组相比，缺血/再灌注组梗死区的细胞核膜明显退化(见图2B)。







2.3  小檗碱降低糖尿病大鼠脑缺血再灌注后梗死区丙二醛和一氧化氮含量并提高超氧化物歧化酶活性  见图3。缺血/再灌注组丙二醛和一氧化氮水平明显高于对照组(P < 0.01)，超氧化物歧化酶活性显著低于对照组(P < 0.01)。缺血/再灌注+小檗碱组丙二醛和一氧化氮水平明显低于缺血/再灌注组(P < 0.05)，超氧化物歧化酶活性明显高于缺血/再灌注组(P < 0.05)。



2.4  小檗碱对2型糖尿病大鼠脑缺血/再灌注损伤后脑细胞凋亡的影响  TUNEL染色显示缺血/再灌注组梗死区细胞凋亡明显多于对照组。预先给予小檗碱，缺血/再灌注+小檗碱组梗死区细胞凋亡较缺血/再灌注组明显减少，见图4A。Western-blot分析显示缺血/再灌注组梗死区Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显高于对照组，Bcl-2蛋白表达水平显著低于对照组，与缺血/再灌注组相比，小檗碱预处理组Bax和cleaved Caspase-3表达减弱，Bcl-2表达增强(P < 0.05)，见图4B和4C。提示小檗碱对2型糖尿病大鼠脑缺血/再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与抑制神经细胞凋亡有关。



2.5  小檗碱通过PI3K-Akt信号通路减轻2型糖尿病大鼠脑缺血/再灌注损伤  为进一步了解小檗碱神经保护作用的分子机制，研究了PI3K-Akt信号通路在脑缺血/再灌注损伤中的变化，见图5。与对照组相比，缺血/再灌注组PI3K和p-Akt表达下调(P < 0.05)。与缺血/再灌注组比，缺血/再灌注+小檗碱组PI3K和p-Akt的表达水平明显上调(P < 0.05)。这些结果表明小檗碱可通过激活PI3-Akt信号通路减轻2型糖尿病大鼠的脑缺血/再灌注损伤。

缺血性脑病是全世界导致患者死亡和残疾的主要原  因^[1]。及时的再灌注治疗是治疗缺血性脑病的主要方法，但脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)仍会对梗死区产生严重的损害^[2]。糖尿病在大多数发达国家的成年人群中已较为流行^[3]。与非糖尿病者相比，糖尿病患者患缺血性脑病的风险更高，并且脑梗死的程度更严重^[4]。因此，需要新的治疗策略来预防及保护2型糖尿病患者的脑组织免受脑缺血再灌注的影响。

在缺血再灌注级联反应过程中，氧化应激损伤是脑缺血大脑皮质神经元损伤的最关键的因素^[5]。氧化应激损伤过程中产生的活性氧直接或间接的损伤神经元的生理功 能^[6]。而内源性抗氧化系统的活性对缺血再灌注后神经元的保护起到了至关重要的作用^[7]。脑缺血再灌注损伤是以脑部初始的血液供应受限和随后的复灌注复氧为主要特征的病理过程^[8]。脑缺血/再灌注可引起广泛的微血管功能障碍和组织屏障功能的改变，是脑缺血继发性损伤的重要发病机制^[9]。研究发现PI3K-AKT信号转导通路在糖尿病相关缺血性脑病中发生了明显的改变，但是具体作用机制和分子变化有待进一步研究^[10]。因此深入挖掘PI3K-AKT信号在糖尿病相关脑缺血再灌注损伤中的作用，寻找关键调控分子作为临床糖尿病相关脑功能损伤的诊治干预靶点，具有广阔的应用前景和创新价值。

小檗碱(berberine，BBR)是从黄连中提取的一种异喹啉类生物碱，具有多种生化和药理作用，在临床上得到广泛应用^[11]。已有文献证明，小檗碱具有降低高血糖、减轻胰岛素抵抗和抑制脂质合成的作用^[12]。研究表明，小檗碱通过抑制2型糖尿病患者心肌细胞的自噬、凋亡和炎症反应来减轻心肌缺血/再灌注损伤^[13]，通过下调腺苷-5’单磷酸激酶活性来减轻脑缺血/再灌注损伤^[14]。小檗碱对脑缺血的潜在保护作用促使研究其在2型糖尿病大鼠模型脑缺血/再灌注损伤中是否具有相似的作用，并探讨其作用的潜在机制。        该研究在2型糖尿病大鼠模型中构建了大脑中动脉闭塞2 h后再灌注12 h的模型，以评估小檗碱对脑缺血/再灌注损伤的潜在作用和分子机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年6月至2019年3月在海南医学院第一附属医院实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  选取SPF级6周龄雄性SD大鼠120只，体质量250-300 g，所有大鼠均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2017-0005。饲养条件为22-24 ℃和12 h昼夜循环。该研究符合NIH实验动物饲养管理与使用指南，并经海南省中医院伦理委员会批准。

1.3.2  实验用主要药品和试剂  小檗碱购买自碧云天生物技术有限公司(上海，中国)；TUNEL试剂盒(KHO1001)购自Invitrogen(加利福尼亚，美国)；DAPI购自Sigma-Aldrich(密苏里，美国)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和超氧化物酶联免疫吸附测定试剂盒购自迈新生物科技有限公司(福建，中国)；一抗购自Abcam(剑桥，英国)，货号分别为PI3K(ab86714)、Akt(ab8805)、p-Akt(ab38449)、Caspase-3(ab86714)、Bcl-2(ab32124)、Bax(ab32503)、Gapdh(ab8245)；山羊抗兔(sc-2774)和山羊抗鼠(sc-2060)二抗购自圣克鲁斯生物技术公司(加利福尼亚，美国)；40 g/L多聚甲醛、二甲苯溶液、1.5%-2%戊二醛(生工，上海，中国)；原位细胞死亡检测试剂盒(Invitrogen，加利福尼亚，美国)。

1.4  实验方法

1.4.1  2型糖尿病模型建立  将链脲佐菌素加入0.1 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 4.4)配成浓度1%的溶液，每隔1 d用低剂量链脲佐菌素(STZ，Sigma，圣路易斯，美国)30 mg/kg腹腔注射处理大鼠2次。大鼠注射链脲佐菌素1周后，用血糖仪(Accu Chek，Roche，新泽西，美国)测量大鼠的空腹血糖水平，共注射链脲佐菌素8周，第8周空腹血糖水平≥11.1 mmol/L的大鼠被认为糖尿病模型构建成功。

1.4.2  大脑中动脉缺血再灌注模型建立  90只成年雄性糖尿病大鼠随机分为3组(n=30)：对照组、缺血/再灌注组和缺血/再灌注+小檗碱组。对照组和缺血/再灌注组大鼠用生理盐水灌胃，200 mL/(kg·d)，持续4周；缺血/再灌注+小檗碱组大鼠用小檗碱治疗，小檗碱溶于生理盐水配成质量浓度为1 g/L的溶液，按小檗碱200 mg/(kg·d)灌胃处理，连续7 d。采用闭塞大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立局灶性脑缺血模型。缺血/再灌注组和缺血/再灌注+小檗碱组大鼠行MCAO缺血2 h，拆线后再灌注12 h。具体过程如下：首先用体积分数10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠。左颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)在分叉附近结扎。仔细分离周围血管和神经组织后，在左颈总动脉上做一个小切口，通过左颈总动脉将0.3 mm尼龙缝合线引入颈内动脉。缺血2 h后，摘除尼龙缝线，再灌注   12 h，使血流恢复正常，对照组大鼠采用相同的手术方法，无需插入尼龙缝线。

1.5  主要观察指标

1.5.1  脑缺血面积的确定  麻醉下缺血再灌注12 h后，处死动物，迅速收集每组30只大鼠脑组织，并用2，3，5-三苯基四唑氯化物(TTC，Sigma，密苏里，美国)染色。每一个大鼠大脑切出5个冠状切片，每张切片厚4 mm，用40 g/L多聚甲醛固定，然后在室温下用1%的TTC磷酸盐缓冲液(pH 7.4)染色15 min。正常脑组织呈深红色，而梗死脑区呈浅灰色。采用Image Pro Plus 6.0系统对染色组织进行处理和分析，以计算脑梗死体积。

1.5.2  ELISA检测梗死区超氧化物歧化酶、丙二醛和一氧化氮水平  于培养板每孔分别加样本或标准品，加入标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素。洗涤、显色、终止。用酶标仪量取A值，波长为450 nm。

1.5.3  苏木精-伊红染色观察脑梗死区组织形态变化  脑组织用40 g/L多聚甲醛固定。然后用超薄半自动切片机切片，切片厚度为3-5 μm，进行脱水石蜡包埋切片，而后用二甲苯溶液脱蜡，按照标准流程行苏木精-伊红染色。使用带有Dialux20模型的显微镜(莱卡，本舍姆，德国)观察结果，并使用FireCam软件进行分析。

1.5.4  透射电镜观察脑梗死区的细胞超微结构  脑组织用1.5%-2%戊二醛固定。然后将组织切成小块，脱水，并嵌入树脂中。之后，用醋酸铀酰/柠檬酸铅水溶液直接对喷注部分进行后染色。使用日立AMT xr-40 CCD相机(日立，日本)观察结果。

1.5.5  采用TUNEL法分析脑细胞凋亡情况  使用原位细胞死亡检测试剂盒进行末端脱氧核苷酸转移酶UTP缺口末端标记。在每个样品上添加100 μL TUNEL反应混合物，并将载玻片在37 ℃下培养60 min，用PBS冲洗3次，每次5 min，并用Axio Observer Z1荧光显微镜(蔡司，德国)观察。

1.5.6  Western blot检测脑梗死区Bcl-2、Caspase-3和Bax表达和PI3K、Akt和p-AktBcl-2、Caspase-3和Bax表达   使用RIPA缓冲液冰上孵育30 min分离大脑样本，并在4 ℃下以13 000 r/min的速度离心30 min。定量蛋白质浓度后，用8%-12% SDS-PAGE分离总蛋白约40 μg，然后转移到PVDF膜。在37 ℃条件下，用5%脱脂牛奶将细胞膜封闭60 min，而后一抗4 ℃孵育过夜，包括PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶2 000)、P-Akt(1∶1 000)、Caspase-3(1∶2 000)、Bcl-2(1∶2 000)、Bax(1∶1 000)和Gapdh(1:5 000)，用TBST洗涤10 min3次后，将膜与相应的二级抗体(1∶2 000)在37 ℃的TBST中孵育60 min。化学发光系统（Amersham Bioscences，小查尔本德，英国）检测阳性蛋白条带，使用图像分析仪Quantity One系统(Bio Rad，加利福尼亚，美国)进行条带扫描和定量分析。

该研究通过构建糖尿病大鼠的脑缺血再损伤动物模型并以小檗碱进行干预，创新性地发现小檗碱预处理可以通过激活PI3K-AKT信号通路明显改善2型糖尿病大鼠脑缺血模型的脑功能，减少脑细胞凋亡，发挥对糖尿病脑缺血损伤的保护作用，为糖尿病患者相关脑功能损伤的临床诊治工作提供了新的思路和理论基础。

PI3K(磷脂酰肌醇3激酶)-Akt，即PI3K/Akt信号通路，是广泛存在于细胞的一条重要的信号通路，参与了细胞生长、增殖、分化与血管新生等多种生命过程^[16-17]。PI3K是脂质激酶家族成员，属原癌基因^[18]。Akt是PI3K重要的下游分子，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶^[19]。脑细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤的主要发病机制之一^[20]，阻断神经细胞凋亡过程可减轻缺血再灌注所致的脑损伤^[21]。PI3K-Akt通路也是存在于细胞中的一条抗凋亡信号通路，Akt经PI3K的磷酸化作用形成pAkt后被激活，进一步磷酸化下游蛋白，从而发挥生物保护作用^[22]。因此PI3K-Akt依赖的信号通路在脑缺血再灌注损伤的致病过程中发挥核心的抗凋亡保护作用^[23]。此次研究结果与既往报道一致，TUNEL染色结果显示：缺血/再灌注组梗死区神经细胞凋亡较对照组明显增加；与缺血/再灌注组相比，小檗碱预处理不仅能促进PI3K和磷酸化Akt的表达，激活PI3K-Akt信号后能显著增加促进细胞生存相关的Bcl-2蛋白的表达，降低凋亡相关蛋白：活性Caspase-3和Bax的表达，证实小檗碱通过PI3-Akt信号介导的抗凋亡作用减轻2型糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤导致的脑细胞凋亡^[24-25]。

小檗碱是黄连属植物中提取的一种异喹啉类生物碱，作为中药黄连的有效成分之一，在中药治疗腹泻方面有着悠久的历史^[11]。越来越多的研究表明：小檗碱具有心血管保护作用、抗肿瘤、降低胰岛素抵抗等生物学效应^[26-27]。此外有研究提示小檗碱可以促进Akt的磷酸化降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖水平，并且可以改善严重充血性心力衰竭患者的心功能，抑制阿霉素激活的心肌细胞凋亡^[28]。但是小檗碱对糖尿病条件下脑缺血再灌注损伤的作用及机制仍然不清楚。此次研究结果表明：小檗碱治疗4周可明显改善脑缺血再灌注损伤，具体表现为脑梗死面积的减少、梗死区脑组织中丙二醛、一氧化氮水平和超氧化物歧化酶活性的改善，证实小檗碱可以通过激活PI3K-Akt信号通路发挥抗糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤的抗凋亡作用^[29]。        

综上所述，研究创新性地证明了PI3K-Akt信号通路参与了小檗碱通过抗凋亡信号通路减轻糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤，为小檗碱在临床糖尿病相关缺血再灌注脑损伤防治中的实际应用提供了实验和理论支持，但此次研究仅通过动物实验层面验证了小檗碱对糖尿病脑功能的凋亡保护性作用，对于其在糖尿病相关器官保护方面潜在的其他生物学功能和可能涉及到的信号通路需要更加全面的探索。
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文题释义：

缺血再灌注损伤：遭受一定时间缺血的组织细胞恢复血流(再灌注)后，组织损伤程度迅速增剧的情况。再灌注后有大量钙内流，并生成大量氧自由基，是广泛组织细胞损伤的主要发病机制。临床上多种疾病如迟发性神经元坏死、不可逆性休克、心肌梗死、脑梗死及器官移植排斥反应等的发生、发展都与缺血、再灌注有关。

PI3K-Akt通路也是存在于细胞中的一条抗凋亡信号通路，Akt经PI3K的磷酸化作用形成pAkt后被激活，进一步磷酸化下游蛋白，从而发挥生物保护作用。因此PI3K-Akt依赖的信号通路在脑缺血再灌注损伤的致病过程中发挥核心的抗凋亡保护作用。

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