猪髓核基质成分诱导骨髓间充质干细胞分化为脊索样细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1833

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (33): 5366-5371.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1833

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猪髓核基质成分诱导骨髓间充质干细胞分化为脊索样细胞

李德芳，江增鑫，曾庆敏，吴靖平，谢晓诚

复旦大学附属金山医院，上海市 201508

修回日期:2019-05-22 出版日期:2019-11-28 发布日期:2019-11-28
通讯作者: 谢晓诚，技师，复旦大学附属金山医院，上海市 201508
作者简介:李德芳，男，1986年生，湖北省黄冈市人，汉族，2013年复旦大学毕业，硕士，主治医师，主要从事椎间盘退变方面的研究。
基金资助:
上海市金山区科委课题(2015-3-6)，项目负责人：李德芳

Porcine nucleus pulposus matrix induces differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into notochord-like cells

Li Defang, Jiang Zengxin, Zeng Qingmin, Wu Jingping, Xie Xiaocheng

Fudan University Jinshan Hospital, Shanghai 201508, China

Revised:2019-05-22 Online:2019-11-28 Published:2019-11-28
Contact: Xie Xiaocheng, Technician, Fudan University Jinshan Hospital, Shanghai 201508, China
About author:Li Defang, Master, Attending physician, Fudan University Jinshan Hospital, Shanghai 201508, China
Supported by:
the Science and Technology Committee of Jinshan District, Shanghai, No. 2015-3-6 (to LDF)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
猪髓核组织：猪的椎间盘髓核内终生都含有大量脊索细胞，在8月龄以内的猪椎间盘髓核中90%都是脊索细胞，仅10%为髓核细胞，这表明髓核细胞外基质中含有很多调控因子，适宜保持脊索细胞的表型。
鼠短尾突变体基因T：T基因编码的蛋白为胚胎核转录因子，定位于脊索来源细胞，结合细胞角蛋白8、细胞角蛋白18等基因，可用于脊索细胞的鉴定与分离。

摘要
背景：脊索细胞对椎间盘内严酷的内环境有良好的抵抗性，或许是治疗椎间盘退变性疾病合适的种子细胞来源。猪髓核终生含有大量脊索细胞，其基质内含有多种细胞因子可以促进骨髓间充质干细胞向脊索样细胞分化。
目的：观察猪髓核基质对骨髓间充质干细胞分化的影响。
方法：体外分离、培养、鉴定猪骨髓间充质干细胞；制备猪髓核粉末，并用配置好的DMEM完全培养基重悬粉末制备成含猪髓核组织的DMEM培养基，对骨髓间充质干细胞进行诱导3周，RT-PCR检测脊索细胞标记性基因鼠短尾突变体表型(T)、细胞角蛋白8及细胞角蛋白18的表达。该实验经复旦大学附属金山医院动物实验伦理委员会批准。
结果与结论：①原代培养的骨髓间充质干细胞具有贴壁生长能力，在特定诱导条件下具有成骨、成脂分化能力，且能表达间充质干细胞表面标记物CD90、CD105；②在猪髓核基质成分诱导下骨髓间充质干细胞形态发生变化，表达鼠短尾突变体表型、细胞角蛋白8、细胞角蛋白18；③结果显示，猪髓核基质成分能诱导骨髓间充质干细胞分化为具有脊索细胞表型的脊索样细胞，为椎间盘退行性疾病治疗提供可靠的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: orcid.org/0000-0003-4655-3359(李德芳)

关键词: 椎间盘退变, 骨髓间充质干细胞, 猪, 髓核, 脊索细胞, 全骨髓培养法, 鼠短尾突变体表型基因

Abstract:

BACKGROUND: As notochord cells can develop resistance to a harsh microenvironment in the intervertebral disc, it may be a suitable cell source for the treatment of degenerative diseases of the intervertebral disc. Porcine nucleus pulposus contains a large number of notochord cells throughout the life, and various cytokines in the cell matrix can induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into notochord-like cells.
OBJECTIVE: To explore the effect of porcine nucleus pulposus matrix on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Porcine bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, cultured and identified in vitro. Porcine nucleus pulposus powder was prepared, and suspended in the DMEM complete medium to prepare the DMEM medium containing porcine nucleus pulposus matrix. Then, the bone marrow mesenchymal stem cells were induced in the prepared medium. After 3 weeks of induction, Notochord cell marker genes, including brachyury, cytokeratin 8, and cytokeratin 18, were evaluated by RT-PCR. The study protocol was approved by the Animal Ethics Committee of Jinshan Hospital affiliated to Fudan University.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Primary cultured bone marrow mesenchymal stem cells exhibited adherent growth. These cells had the ability of osteogenic and adipogenic differentiation under special conditions, and expressed CD90 and CD105. (2) Under the induction of porcine nucleus pulposus matrix, the cell morphology was changed, and the expression of brachyury, cytokeratin 8, and cytokeratin 18 was enhanced. To conclude, porcine nucleus pulposus matrix can induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into notochord-like cells with notochord cell phenotype, which may provide a reliable cell source for the cell therapy of degenerative diseases of the intervertebral disc.

Key words: intervertebral disc degeneration, bone marrow mesenchymal stem cells, pig, nucleus pulposus, notochord cells, whole bone marrow culture, brachyury

中图分类号:

李德芳，江增鑫，曾庆敏，吴靖平，谢晓诚. 猪髓核基质成分诱导骨髓间充质干细胞分化为脊索样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(33): 5366-5371.

Li Defang, Jiang Zengxin, Zeng Qingmin, Wu Jingping, Xie Xiaocheng. Porcine nucleus pulposus matrix induces differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into notochord-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(33): 5366-5371.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞的形态 最初分离的细胞呈圆形，核大，胞浆少，透明，细胞大小较为一致，呈悬浮状态；1 d后细胞开始贴壁，3 d后基本全部贴壁，且开始增殖，细胞伸展，体积增大，呈短梭形、多角形及不规则形等，但有较多杂质细胞；当细胞传代至第3代时细胞形态比较均匀，呈梭形成纤维样，彼此联系，细胞排列成漩涡状、网状或鱼群状，见图1。细胞增殖速度亦较快。

2.2 骨髓间充质干细胞分化能力鉴定结果 对获得的骨髓间充质干细胞进行成骨、成脂分化诱导，以确定其是否具有干细胞多向分化潜能。成骨诱导分化3周后，细胞形态发生改变，由梭形转化为三角形、多角形等，培养基中出现黑色细小颗粒，换液时可触及培养板底磨砂感。茜素红染色显示骨髓间充质干细胞着色程度不一，细胞密集处着色较深，呈阳性反应，见图2A，B。

成脂诱导分化后细胞周围分泌出许多微小油滴，随着诱导时间的延长，油滴逐渐增加并融合，且在培养基表面可见一层油滴，细胞由梭形变为类圆形，细胞内出现透亮脂滴。成脂诱导3周后进行油红O染色，显示脂滴呈红色，见图2C，D。

2.3 骨髓间充质干细胞表面标志物检测结果 见图3。猪骨髓间充质干细胞表面标记物CD90、CD105免疫细胞化学染色呈阳性，DAPI染核，随机选取5个视野计数总细胞数及阳性细胞数，得出CD90阳性率为(98.0±2.1)%，CD105阳性率为(96.0±1.6)%。

2.4 猪髓核组织制备及其对骨髓间充质干细胞分化的影响 2周龄猪髓核组织呈胶冻状，黏性较强，经液氮冷冻后组织变脆，易于碾磨。为保证培养板中加入的髓核组织均衡，用DMEM完全培养基重悬，充分混匀，等量加入。3周后提取诱导分化组及未诱导组RNA，行RT-PCR检测脊索细胞标记性基因鼠短尾突变体表型(T)、细胞角蛋白8及细胞角蛋白18表达，结果显示：在β-actin作为内参情况下，诱导组3种基因的表达分别提高5.75倍(P < 0.01)，4.11倍(P < 0.01)和3.89倍(P < 0.01)，其中T基因表达水平上调尤为明显，差异有显著性意义，见图4和表2。

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引言

椎间盘退行性变是引起腰部疼痛的重要病因，通常伴有神经压迫症状，使成年人丧失工作能力。在保守治疗无效情况下，目前临床针对该种疾病最常用的治疗方法为椎间盘髓核摘除、植骨内固定，虽然短期内能有效缓解症状，但长期随访结果显示颈前路髓核摘除融合术中临椎病发生率可高达54.7%，其中临近节段需要再次手术的病例占到11.6%。最新的Meta分析结果也显示临椎病的发生不容忽视^[1]。这促使学者们去探索以细胞治疗为核心的再生疗法在椎间盘退行性疾病中的应用，因为它不但能补充椎间盘内日益减少的髓核细胞，也可以增加细胞外基质成分的合成，从而延缓椎间盘退变的进程^[2]。目前常用的有2种再生疗法：其一是向椎间盘内注射细胞，注射的细胞为干细胞或成熟的自体细胞；其二是细胞外基质成分或生物支架。干细胞在适当诱导条件下可以分化为髓核样细胞，具有合成细胞外基质的功能^[3-7]，注射到椎间盘内，其能够促进椎间盘内特异性基因蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达，改善椎间盘内环境^[8]。也有动物实验证实成熟自体软骨细胞或髓核细胞移植能延缓椎间盘退变^[6]。髓核外基质成分因其富含椎间盘细胞适宜生存的细胞因子，近来被越来越多的学者关注，实验证实其可在椎间盘内发挥再生作用^[9-12]。然而面对椎间盘内低氧、低营养、高压力的严酷微环境，很多移植的种子细胞难以生存。近期有学者研究发现在体外模拟的高压力、低糖培养体系中，脊索细胞比成熟髓核细胞具有更强的生存能力及耐受力，并且其合成细胞外基质的能力并不受影响^[13]。据此作者推测脊索细胞可能是理想的种子细胞。在人类椎间盘内，脊索细胞大概10岁时逐渐消失，因此无法在成人椎间盘内分离得到大量用于组织再生的脊索细胞。该研究将具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞在适当条件下诱导分化为脊索样细胞，并对其进行表型鉴定，从而为脊索样细胞作为椎间盘退变治疗种子细胞提供理论和实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2018-09-03在复旦大学附属金山医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 2周龄雄性上海白猪2只，约7 kg，购买于上海妙迪生物技术有限公司。

1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM低糖型培养基、胎牛血清(Hyclone)；抗生素(青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L)、CO₂培养箱(美国Termo Electron Corporation)；CD90抗体、CD105抗体、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原抗体及Alexa Fluor标记的二抗等(Cell Signaling Technology)；骨髓间充质干细胞成脂分化、成骨分化试剂盒(上海麒盟生物)；DAPI染色试剂盒(凯基生物科技发展有限公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；PCR仪(Appied Biosystems公司)；倒置相差显微镜、荧光显微镜(Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞分离与培养 戊巴比妥钠腹腔麻醉(150 mg/kg)后，静脉注射氯化钾(2 mmol/kg)处死2周龄上海白猪，常规备皮、消毒铺巾，无菌条件下解剖分离股骨、胫骨，放入含有PBS的无菌器皿中，用含双抗的PBS冲洗骨标本3次。用咬骨钳咬除骨标本两侧干骺端，注射器针头抽取低糖型DMEM培养基冲洗骨髓腔，200目滤网过滤冲洗液，将过滤液收集至15 mL无菌离心管，1 500 r/min离心10 min，弃上清；加入3 mL PBS清洗离心(1 500 r/min离心5 min)去上清液，重复3次；加入适量含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗(青-链霉素)的DMEM培养液，移入培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂细胞培养箱中培养，24 h后换液，去除没有贴壁的细胞，以后每3 d换液1次，倒置显微镜观察细胞贴壁及生长情况。细胞融合为单层时，进行传代，用0.25%胰蛋白酶消化，收获细胞制成细胞悬液，按2×10⁸ L^-1接种于新的6孔培养板中。

1.4.2 骨髓间充质干细胞分化能力鉴定 为鉴定分离的细胞是否具有干细胞特性，对其进行分化能力鉴定。将第3代骨髓间充质干细胞按4×10⁴/cm²密度接种于6孔培养板中，待融合至70%左右用成骨、成脂分化试剂盒进行诱导分化。成骨分化试剂盒主要成分有猪骨髓间充质干细胞成骨分化培养基、猪骨髓间充质干细胞成骨分化血清、双抗、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松等。成脂分化试剂盒主要有猪骨髓间充质干细胞成脂分化基础培养基A、猪骨髓间充质干细胞成脂分化血清、双抗、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、罗格列酮、地塞米松、猪骨髓间充质干细胞成脂分化基础培养基B等。按照说明书介绍的方法进行成骨、成脂分化诱导，3周后用试剂盒自带的茜素红染液、油红O染色液对细胞进行染色，显微镜下观察染色结果。

1.4.3 骨髓间充质干细胞表型鉴定 将第3代骨髓间充质干细胞按1×10⁵/cm²密度接种于6孔培养板中，待融合至70%左右，弃上清液，PBS漂洗3次，用预冷的40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗，0.1%Tritonx-100处理15 min，2%BSA-PBS 37 ℃封闭60 min，滴加CD90、CD105一抗(1∶200，兔抗猪单克隆抗体)37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，加入Alexa Fluor标记的二抗(1∶200，山羊抗兔)37 ℃避光孵育60 min，PBS洗3次，用DAPI对核进行染色1 min，PBS冲洗，在荧光显微镜下观察染色情况。

1.4.4 猪髓核组织制备及骨髓间充质干细胞分化诱导 按上述1.4.1方法处死上海白猪后，常规消毒铺巾，无菌条件下取下颈椎至腰椎节段，仔细剥离周围筋膜和肌肉，显露椎间盘，无菌尖刀切开纤维环，取出髓核组织，用含双抗的PBS清洗。将髓核组织放入2 mL无菌冻存管内并用反复冻融法处理组织，即液氮中处理5 min，然后迅速转移至37 ℃水浴直至结晶溶解，如此反复5次，使髓核内活细胞死亡、裂解。经冷冻后髓核组织变得较脆，用无菌研钵将髓核研磨成粉末，并用配置好的DMEM完全培养基重悬粉末制备成含猪髓核组织的DMEM培养基(DMEM-P)，用于后续骨髓间充质干细胞的诱导实验。

将第3代骨髓间充质干细胞按4×10⁴/cm²密度接种于6孔培养板中，并用DMEM完全培养基培养，待融合至60%左右，细胞分为2组：诱导分化组及未诱导组，前者改为含猪髓核组织的DMEM培养基培养，后者则继续以DMEM完全培养基培养，每两三天换液1次，在显微镜下观察细胞形态变化。3周后收集细胞，对相关指标进行检测。

1.4.5 RT-PCR检测脊索细胞标志性基因鼠短尾突变体表型(T)、细胞角蛋白8(KRT-8)及细胞角蛋白18(KRT-18)的表达 采用Trizol提取上述两组细胞总RNA，定量后反转录为cDNA，进行RT-PCR上机检测。引物由Takara公司提供，见表1。反应参数：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s；不同退火温度(按表1与不同基因相对应)，45 s；72 ℃，1 min；72 ℃，6 min；36个循环。以β-actin为内参，用2^-^??Ct法计算基因相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞原代培养、传代培养过程中形态变化；②骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化能力鉴定结果；③骨髓间充质干细胞表面标记物的表达；④RT-PCR检测脊索细胞标记基因表达。

1.6 统计学分析 所有数据均通过SPSS 20.0软件进行处理，以x(_)±s表示，采用配对t 检验进行统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

椎间盘退行性疾病的细胞治疗越来越受到学者们的关注，因为它不仅能补充椎间盘内不断减少的椎间盘细胞，也能增加细胞外基质的合成，进而维持椎间盘的生物力学功能。细胞治疗的关键在于寻找合适的种子细胞，其中骨髓间充质干细胞因具有易于大量获取、多向分化潜能及分泌促进再生的生长因子等优势而被广泛研究^[14-1⁹^]。目前关于间充质干细胞用于椎间盘退变性疾病的再生治疗研究大概可以概括为2个方面：其一，在某些特定的培养体系中，间充质干细胞可以诱导分化为髓核样细胞，然后进行细胞移植^[^20-21^]；其二，间充质干细胞行椎间盘内注射，由于其具有抗炎、抗凋亡、促进合成代谢及分泌营养因子等特性而发挥作用^[5^，^8]。虽然在体内外实验中都有不错的效果，但随着近期越来越多的受关注，有不少研究也证明间充质干细胞存在不足，具体表现为：①受椎间盘内严酷内环境的影响，外源性植入细胞很难存活；②动物实验显示，间充质干细胞经椎间盘内注射后未能发现再生迹象，而间充质干细胞可能会从髓核内迁移出来，从而在椎间盘周围软组织形成骨赘^[2²^]；③在狗椎间盘自发退变模型中，椎间盘内注射自体间充质干细胞并未发现再生信号^[1⁷^]。综上，尽管间充质干细胞治疗椎间盘退变前景可观，但距离临床应用还有待进一步研究。

脊索细胞在人类生命早期存在于椎间盘内，但10岁左右开始消失，逐渐分化为其终末状态髓核细胞。研究发现，有软骨营养障碍犬椎间盘内的脊索细胞消失，椎间盘退变信号在青年犬中就可观察到，而非骨营养障碍犬椎间盘内的脊索细胞保存良好，因此退变极少发生或者发生在年老犬中；尽管退变发生，组织病理学研究发现细胞外基质基本保持健康，仅组织形态中度改变^[2³^-2⁴^]，这提示髓核细胞消失与椎间盘退变启动密切相关。作者推测脊索细胞及其终末分化的髓核细胞应该是椎间盘退变细胞治疗的理想种子细胞。近期的研究更是进一步证明，在高压力、高糖环境中脊索细胞活性、脊索标记物以及细胞外基质等指标均未受明显影响，这提示脊索细胞比髓核细胞更能耐受椎间盘内严酷的内环境^[13]。而实际上也无法获得大量可供再生医学研究及治疗的脊索细胞。结合骨髓间充质干细胞的多向分化潜能，此研究拟通过特定诱导因素，使其分化为具有脊索细胞特性的细胞，以解决细胞来源问题。

分离骨髓间充质干细胞的方法有密度梯度离心法、全骨髓培养法等，密度梯度分离法所得细胞活性较差，所以实验采用全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞。分离获得的细胞满足国际细胞治疗学会(ISCT)标准：细胞能够贴壁生长；细胞具有成骨、成脂分化等分化潜能；表达CD90、CD105等细胞表面标记物^[2⁵^]，结果提示通过原代分离培养获得了猪骨髓间充质干细胞。

用于诱导干细胞分化的刺激因素也在不断探索中，常见的方法包括添加生长因子(转化生长因子、碱性成纤维生长因子)、共培养、脊索细胞来源的条件培养基等。该研究目的旨在获得脊索样细胞，但目前并没有现成的细胞因子或化学诱导剂能定向诱导骨髓间充质干细胞分化为脊索样细胞；该研究以猪髓核组织作为诱导剂诱导骨髓间充质干细胞分化，是因为猪的椎间盘内终生都含有大量脊索细胞，在8月龄以内的猪椎间盘髓核中90%都是脊索细胞，仅10%为髓核细胞，这表明髓核基质适宜保持脊索细胞的表型^[2⁶^-2⁷^]。据此作者推测猪髓核基质中包含很多调控因子，能够诱导骨髓间充质干细胞向脊索细胞定向分化。实验结果证实分离的骨髓间充质干细胞经猪髓核基质成分诱导后，能够表达脊索细胞标记性基因鼠短尾突变体表型、细胞角蛋白8及细胞角蛋白18。鼠短尾突变体表型基因编码的蛋白为胚胎核转录因子，定位于脊索来源细胞，结合细胞角蛋白8、细胞角蛋白18等基因，可用于脊索细胞的鉴定与分离^[2⁸^]，说明经猪髓核基质成分诱导后骨髓间充质干细胞具备脊索细胞表型。

实验通过原代分离培养的方法建立了可以稳定传代的骨髓间充质干细胞系，并用猪髓核基质成分对该细胞进行诱导，获得了具有脊索细胞表型的脊索样细胞，为椎间盘退行性变治疗提供可靠的种子细胞，但对于脊索样细胞的分化潜能及生物学功能需要进一步验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

猪髓核基质成分诱导骨髓间充质干细胞分化为脊索样细胞

Porcine nucleus pulposus matrix induces differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into notochord-like cells

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