牛膝总皂苷干预兔膝骨关节炎滑膜液来源细胞因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1842

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (33): 5317-5321.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1842

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

牛膝总皂苷干预兔膝骨关节炎滑膜液来源细胞因子的表达

高坤¹，张勇¹，陈大宇¹，余伟吉¹，孙淑芬¹，吴益宏²，林展鹏²，曹亚飞¹

¹深圳市中医院骨伤科，广东省深圳市 518033；²广州中医药大学第四临床医学院，广东省深圳市 518033

修回日期:2019-06-12 出版日期:2019-11-28 发布日期:2019-11-28
通讯作者: 曹亚飞，博士，主任医师，深圳市中医院骨伤科，广东省深圳市 518033
作者简介:高坤，男，1987年生，山东省济南市人，汉族，2016年南方医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨科疾病的中医药防治研究。
基金资助:
深圳市医疗“三名工程”(SZSM201812066)，项目负责人：曹亚飞

Effects of total saponins of Achyranthes bidentata on cytokine profiles of synovial fluid in experimental rabbits with knee osteoarthritis

Gao Kun¹, Zhang Yong¹, Chen Dayu¹, Yu Weiji¹, Sun Shufen¹, Wu Yihong², Lin Zhanpeng², Cao Yafei¹

¹Department of Orthopedics, Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China; ²Fourth Clinical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China

Revised:2019-06-12 Online:2019-11-28 Published:2019-11-28
Contact: Cao Yafei, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China
About author:Gao Kun, MD, Attending physician, Department of Orthopedics, Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China
Supported by:
the Top 3 Medical Engineering Project of Shenzhen, No. SZSM201812066 (to CYF)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Luminex技术：应用微球和流式细胞仪的原理，通过高特异性的双抗体选择，在一次实验中完成对多种目标分子分析的技术，具有高通量、操作简便、测量准确的优点。
基质金属蛋白酶：是一类活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶，主要的生理作用是降解细胞外基质。

摘要
背景：既往研究表明，滑膜液中细胞因子是引起膝关节疼痛的重要因素。牛膝能够促进膝关节软骨细胞修复，降低膝关节炎症水平，减轻膝关节疼痛。牛膝能否调控膝关节炎滑膜液内细胞因子水平，目前尚不清楚。
目的：探讨牛膝总皂苷对实验兔膝骨关节炎滑膜液来源细胞因子谱的影响。
方法：8只新西兰兔随机分为实验组和对照组，每组4只，均采用石膏外固定的方法构建右膝关节炎模型，造模后第2天开始给予牛膝总皂苷及蒸馏水灌服，灌服2周后测定关节活动度，抽取膝关节滑膜液，采用Luminex法测定炎性细胞因子和趋化因子水平，采用ELISA法检测基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶3水平。实验经广州中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号：2018-31)。
结果与结论：①治疗后，实验组膝关节活动度明显大于对照组(P < 0.05)；②与对照组相比，实验组治疗后炎性因子白细胞介素1α、白细胞介素1β、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α，趋化因子CCL3、CXCL8、CXCL9，基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶3的表达水平均降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果表明，牛膝总皂苷能够缓解骨关节炎兔膝关节活动障碍，降低膝关节滑膜液中细胞因子水平，从而起到减轻炎症和保护软骨的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1400-286X(高坤)

关键词: 骨性关节炎, 牛膝, 牛膝总皂苷, 滑膜液, 基质金属蛋白酶, 细胞因子, 趋化因子

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that synovial fluid cytokines are important factors responsible for knee pain. Achyranthes bidentata can promote the repair of knee chondrocytes, relieve inflammation of the knee joint, and ease knee pain. Whether Achyranthes bidentata can regulate the level of cytokines in the synovial fluid of knee osteoarthritis is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of total saponins of Achyranthes bidentata on cytokine profiles of synovial fluid in experimental rabbits with knee osteoarthritis.
METHODS: Eight New Zealand rabbits were randomized into experimental and control groups (n=4/group). A rabbit model of knee osteoarthritis was established. At 2 days after modeling, the total saponins of Achyranthes bidentata and distilled water were administered in the experimental and control group, respectively. Range of motion of the knee joint was measured after 2 weeks of administration. The synovial fluid of the knee joint was extracted from each rabbit. The levels of inflammatory cytokines and chemokines were measured by Luminex. The levels of matrix metalloproteinases 1, 2, 3 mRNA were measured by ELISA. The study protocol was approved by the Animal Ethics Committee of Guangzhou University of Chinese Medicine (approval No. 2018-31).
RESULTS AND CONCLUSION: The range of motion of the knee joint in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). Compared with the control group, the expression levels of inflammatory factors interleukin 1α, interleukin 1β, interleukin 10, tumor necrosis factor α, chemokines CCL3, CXCL8, CXCL9, matrix metalloproteinases 1, 2, 3 decreased significantly after treatment (P < 0.05). These findings indicate that Achyranthes bidentata total saponins can alleviate knee dysfunction in knee osteoarthritis rabbits, and reduce the level of cytokines in the synovial fluid of the knee joint, thus reducing inflammation and protecting the cartilage.

Key words: osteoarthritis, Achyranthes bidentata, total saponins of Achyranthes bidentata, synovial fluid, matrix metalloproteinase, cytokine, chemokine

中图分类号:

高坤，张勇，陈大宇，余伟，孙淑芬，吴益宏，林展鹏，曹亚飞. 牛膝总皂苷干预兔膝骨关节炎滑膜液来源细胞因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(33): 5317-5321.

Gao Kun, Zhang Yong, Chen Dayu, Yu Weiji, Sun Shufen, Wu Yihong, Lin Zhanpeng, Cao Yafei. Effects of total saponins of Achyranthes bidentata on cytokine profiles of synovial fluid in experimental rabbits with knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(33): 5317-5321.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年3月至2019年1月在北京大学深圳医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及分组 8只成年健康雄性新西兰兔，体质量(1.70±0.32) kg，由广东省医学动物实验中心提供，合格证号：SCXK(粤) 2014-0035，该研究遵循了单位、地区以及国家所制订的有关实验动物保护和使用的指南，并经广州中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号：2018-31)。

1.3.2 实验药材和试剂 牛膝总皂苷(陕西森弗生物技术有限公司，批号HQZZG130911)，含量为60.3%，用时以蒸馏水溶解配制成质量浓度为6.7 g/L的混悬液，按15 mL/kg灌胃。酶联免疫吸附测定(ELISA)Kit试剂盒由AMEKO公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组及骨关节炎模型的构建 8只新西兰兔随机分为实验组和对照组，每组4只，均采用石膏外固定的方法构建右膝关节炎模型^[10]，简略步骤如下：实验兔膝关节于伸直位，石膏绷带固定，范围为膝关节上下4 cm，外用纱布包裹，防止撕咬，固定5周，拆除石膏后检测膝关节活动度，活动度小于10°，模型构建成功。造模成功后第2天开始给药。实验组接受牛膝总皂苷15 mL/kg灌胃，1次/d，连续灌胃2周；对照组接受蒸馏水灌胃，1次/d，连续灌胃2周。

1.4.2 关节功能评价 灌胃前、灌胃2周后，通过测定膝关节的被动活动角度对关节功能进行评估，简略步骤如下：固定实验兔右股骨，被动屈曲小腿，用度数测量器测量与股骨的夹角大小，伸直位为0°。

1.4.3 滑膜液的提取 灌胃2周后，用1 mL注射器抽取膝关节滑膜液，简略步骤如下：首先吸取500 μL DPBS于注射器中，沿关节间隙注射入膝关节，再回抽出DPBS与滑膜液的混合液，如此反复抽吸3次，收集抽取的液体，-80 ℃保存。

1.4.4 细胞因子检测 采用Luminex技术检测炎症因子(白细胞介素1α、白细胞介素1β、白细胞介素10、白细胞介素15、白细胞介素17、肿瘤坏死因子α)、趋化因子(CCL2、CCL3、CXCL8、CXCL9)水平，简略步骤如下：标本融化后保持2-8 ℃的温度，加入一定量的含有蛋白酶抑制剂的缓冲液，16 000×g离心5 min，收集上清送检。

采用ELISA方法检测基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶3水平，简略步骤如下：包被液稀释抗体，次日洗涤液洗涤，加入200-250 μL封闭液，加入标准液及样品，室温孵育30-60 min，洗板后加酶标抗体孵育30 min，加100-150 μL底物液显色，终止反应后测吸光度值。

1.5 主要观察指标 ①膝关节的被动活动角度；②膝关节滑膜液中细胞因子水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件分析。计量资料数据用x(_)±s表示，首先进行正态性及方差齐性检验，然后用方差分析或非参数检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

骨关节炎是最常见的关节疾病，也是致残的主要原因。65岁以上人群中，60%受此疾病困扰^[11]。该病的主要病理变化是关节软骨的成分、结构和功能明显改变。目前的研究已经将重点放在了软骨的生物学功能上^[12]。软骨受膝关节内环境的影响，即滑膜液的生化成分、因子水平、细胞水平均能对软骨造成病理学改变。软骨的增生、分化、凋亡、降解等均与膝关节内环境相关^[13]。细胞因子能够结合软骨细胞表面靶分子，激活软骨细胞内信号分子通路，对软骨细胞的生理功能进行调节。已知炎性因子是导致关节内炎症的重要因素，白细胞介素、趋化因子、肿瘤坏死因子均能调节骨性关节炎的发病进程。例如，白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α能够诱导基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13的表达，促进软骨细胞内Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的分解^[14]。抑制炎性白细胞介素的表达，能够明显缓解膝关节的严重程度。有报道证实抑制白细胞介素10能够刺激Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达，抑制基质金属蛋白酶和一氧化氮的表达，阻止软骨细胞凋亡，从而起到保护关节软骨功能的作用^[15-16]。基质金属蛋白酶能反映骨关节软骨代谢变化，它对关节软骨细胞外基质具有降解作用，与加重软骨退变破坏有着十分重要的关系^[17]。

骨关节炎的治疗以补肝肾、活血通络为主。牛膝属《本草经》上品，“主寒湿痿痹，四肢拘挛，膝痛不可屈伸，逐血气，伤热火烂”专主祛邪攻逐，是中医补肾活血法的代表药物。通过对古方和专业期刊的统计，牛膝的使用频率在治疗关节炎的内服方剂中最高，达64%^[18-19]。经过仪器分析，牛膝包含有多种类型化合物，包括多糖类、皂苷类、缁酮类、黄酮类、多肽类、有机酸及各种微量元素。牛膝皂苷类能够减少和抑制炎症因子的释放，使环氧化酶2或诱导型一氧化氮合酶基因/蛋白水平下调，还能抑制软骨细胞凋亡通路PI3K/AKT，提高抗细胞凋亡因子，减少软骨细胞凋亡，改善骨关节炎病理。牛膝多糖能够抑制黏附因子与趋化因子的表达，抑制炎症发展过程中关键酶的活性，调节细胞因子生成，进而影响白细胞向炎症部位的趋化、黏附以及渗出而发挥作用^[20-21]。肖伟等^[⁷^]纳入了70例骨性关节炎患者，采用牛膝透入疗法能够减轻膝关节疼痛程度，降低功能障碍，减少关节积液。牛膝含药血清能够促进软骨细胞的增殖和糖胺聚糖的形成。陈达等^[⁸^]比较了牛膝醇提物与硫酸氨基葡萄糖和双醋瑞因对骨关节炎的疗效，发现牛膝醇提物能够促进软骨修复，功效与硫酸氨基葡萄糖和双醋瑞因相当。牛膝对于滑膜液内细胞因子谱的影响，目前尚未见明显报道。滑膜液内的细胞因子对基质金属蛋白酶水平有明显的影响^[22-2⁵^]。据报道，肿瘤坏死因子α处理后的单核细胞和T细胞能够引起滑膜成纤维细胞释放大量代谢产物，包括基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13和ADAMTS-5等，尤其是基质金属蛋白酶13，能够分解多聚蛋白糖和胶原蛋白，是关节炎重要的软骨破坏机制^[2⁶^-³⁰^]。内皮细胞携带基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶14，能引起毛细血管破坏，与关节腔液体积聚、肿胀有关^[³¹^-³³^]。此研究探讨牛膝总皂苷对炎症因子、趋化因子、基质金属蛋白酶的影响。首先牛膝总皂苷能够明显改善膝关节的活动度。在炎症因子方面，除白细胞介素15、白细胞介素17之外，其余炎症因子水平均明显降低。在趋化因子方面，除CCL2外之外，其余趋化因子水平均明显降低。基质金属蛋白酶能分解细胞外基质，是软骨细胞退化的标志蛋白^[15，³⁴^]。研究显示，与对照组相比，牛膝总皂苷能够降低滑膜液内基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶3的表达水平，说明牛膝总皂苷能够降低软骨细胞的老化。

综上所述，牛膝总皂苷能够缓解骨关节炎兔膝关节活动度，降低膝关节滑膜液中炎症因子、趋化因子、基质金属蛋白酶等细胞因子水平，从而起到减轻炎症和软骨损伤的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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