3D打印三维多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽支架材料的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1936

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文题释义：

鹿瓜多肽：作为中国拥有自主知识产权的复方制剂，其主要来源于梅花鹿和甜瓜种子的提取物，含有多种骨诱导因子及生长因子，能促进成骨细胞增殖，增加骨钙沉积，促进骨质生长，增强骨骼强度，但鹿瓜多肽药物扩散快、半衰期短、利用率低，不利于骨的重建与修复。

骨传导：是指在骨折愈合或骨缺损修复过程中，需要有一个媒介为在新骨形成及血管长入提供一个支架，如异体骨、瑞特人工骨等。

背景：人工骨的研制已成为骨组织工程的热点，临床实践证明单一性质的骨材料不能很好地满足临床需要，这使得复合支架材料的研制及应用受到了关注。

目的：3D打印制备三维多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽生物支架材料，表征其生物相容性。

方法：利用3D打印技术制备多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽复合支架材料，表征材料的组成成分、微观结构、力学强度。利用倒置显微镜与CCK-8实验检测多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽生物支架材料对成骨细胞的毒性；利用扫描电镜观察成骨细胞在多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽生物支架材料上的生长及黏附情况；利用急性毒性实验、肌肉植入实验与骨缺损植入实验检验多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽生物支架材料的生物相容性。实验方案经解放军第二军医大学伦理委员会批准。

结果与结论：①多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽生物支架材料主要由碳酸钙、生物多肽组成，抗压强度达到10 MP以上，孔隙率达85%以上，孔径为50-100 µm；②成骨细胞在多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽生物支架材料浸提液中生长良好，细胞活性强，多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽生物支架材料浸提液的细胞毒性为1级；③成骨细胞可在多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽生物支架材料表面黏附、增殖；④多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽生物支架材料可在体内降解，未引发动物全身毒性反应，无肌肉刺激反应，可促进骨缺损的修复；⑤结果表明，多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽生物支架材料具有良好的力学性能、三维空间结构、细胞相容性与组织相容性。

ORCID: 0000-0002-1536-5315(楼毅)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 3D打印, 海洋贝壳, 鹿瓜多肽, 骨修复材料, 生物相容性, 骨缺损, 成骨细胞, 骨诱导

Abstract:

BACKGROUND: The development of artificial bone has become a hot spot in bone tissue engineering. Clinical practice has proved that single component bone materials can not meet the clinical needs very well. Therefore, the development and application of composite scaffold materials have been paid more concern.

OBJECTIVE: To prepare three-dimensional porous marine shell/cervus and cucumis polypeptide composite scaffold material by 3D printing technology and investigate its biocompatibility.

METHODS: The porous marine shell/ cervus and cucumis polypeptide composite scaffold material was prepared by 3D printing technology. Its composition, microstructure and mechanical strength of the material were investigated. The toxicity of porous marine shell/lugua polypeptide bioscaffold materials to osteoblasts was detected by inverted microscopy and CCK-8 assay. The growth and adhesion of osteoblasts on the porous marine shell/ cervus and cucumis polypeptide composite scaffold material was determined by scanning electron microscopy. The biocompatibility of porous marine shell/cervus and cucumis polypeptide composite scaffold material was determined by acute toxicity test, muscle implantation test and bone defect implantation experiment. The study protocol was approved by the Ethics Committee of the Second Military Medical University, China.

RESULTS AND CONCLUSION: The porous marine shell/cervus and cucumis polypeptide composite scaffold material was mainly composed of calcium carbonate and biological polypeptide, with 10 MP or more compressive strength, more than 85%porosity, and 50-100 μm pore diameter. Osteoblasts grew well in the porous marine shell/cervus and cucumis polypeptide composite scaffold material, and cell viability was strong. The cytotoxicity of the scaffold material was grade 1. Osteoblasts could adhere and proliferate on the surface of the scaffold material. The scaffold material could be degraded in vivo, did not cause systemic toxicity in animals, had no muscle stimulation reaction, and could promote the repair of bone defects. These results suggest that porous marine shell/cervus and cucumis polypeptide composite scaffold material has excellent mechanical properties, three-dimensional spatial structure, good cytocompatibility and histocompatibility.

Key words: 3D printing, marine shell, cervus and cucumis polypeptide, bone repair material, biocompatibility, bone defect, osteoblast, osteoinduction

中图分类号:

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R459.9

R-331

R318.08

引用本文

楼毅，张志文. 3D打印三维多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽支架材料的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(34): 5497-5502.

Lou Yi, Zhang Zhiwen. Biocompatibility of 3D printed three-dimensional porous marine shell/cervus and cucumis polypeptide composite scaffold material[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(34): 5497-5502.

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图/表（结果） 9

2.1 材料生物力学强度测试结果  如图1所见，初期当骨材料受纵向压力小于1 MPa时，材料的形变不明显，但随压力递增，材料的形态变化逐渐加快，当片剂压缩至原高度25%时，纵向压力已超过10 MPa。

2.2 材料物相检测结果  多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽复合材料的X射线衍射波形可知，碳酸钙波峰明显且规则，说明其为晶体结构；鹿瓜多肽波峰杂乱，非晶体结构，见图2；从图中3种材料波形对比，证明人工骨材料由碳酸钙、鹿瓜多肽两组物质组成，且鹿瓜多肽不能改变碳酸钙的晶体结构。

2.3 材料扫描电镜观察结果  材料的微观结构如图3所示, 为三维多孔网状结构，表面粗糙、多孔，各孔之间相互贯穿，形状规则，大小一致，孔隙大小为50-100 µm，孔隙率超过85%，完全满足细胞贴壁、迁移、增殖及新陈代谢的空间需求^[11-12]。

2.4 材料浸提液中的细胞生长情况显微镜下观察发现成骨细胞在浸提液中生长良好，细胞活性强，虽见少量细胞凋亡，但大部分细胞贴壁生长，形态结构完好，细胞核饱满，细胞呈多角形，见图4A；3 d后细胞已成簇分布于培养皿底部，增殖旺盛，见图4B；5 d后细胞已融合成片，铺满培养皿底部，平行排列或呈漩涡状，见图4C。

2.5 CCK-8细胞毒性实验结果  培养的第2，4，6，8天，实验组和对照组吸光度值均随着时间的推移而升高，且两组吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2，表明两组细胞在各自培养基中均能良好生长、增殖，且生物毒性趋于一致。

2.6 材料表面的细胞黏附观察  扫描电镜观察显示种植在复合材料片剂上的成骨细胞，24 h后即散在分布并贴附于材料表面，细胞形态饱满，呈多角形，伸出伪足牢牢吸附于材料表面；随时间增长，细胞在材料的三维空间中不断增殖分化，数量明显增多，见图5。

2.7 毒性实验结果注射复合材料混悬液后1个月，实验动物生命体征平稳，未出现体质量减轻、食欲不振、活动度下降等情况，血常规检测见表3，生化指标检测见表4，实验组大鼠指标均在正常范围，与对照组大鼠对比无显著差异(P > 0.05)。

将实验组大鼠处死后解剖其腹部，未见水肿、腹水及

腹部脏器粘连；将心肝脾肺肾做病理切片，未见组织细胞充血、变性、凋亡等现象，组织内未见材料沉积，未见炎性细胞聚集。

2.8 肌肉植入实验结果术后1个月，实验动物生命体征平稳，无波动，材料植入部位可见陈旧手术瘢痕，愈合良好，伤口处干洁，无红肿，局部皮温无升高，病理切片见图6，可见材料存留于肌肉组织中，部分降解，周围肌肉组织生长良好，结构正常，未见组织坏死及溶解，未见炎性细胞在材料与肌肉组织聚集。

2.9 骨植入实验结果  所有兔手术伤口干洁，愈合良好，患肢主被动活动良好。术后6周，材料周围组织未见大量炎

性细胞聚集，人工骨材料部分降解，材料与骨组织交界处骨缺损区有大量骨盐沉积，并见髓腔区域粗大的骨小梁散在分布，但骨缺损仍明显，成骨细胞活动活跃，见图7A；术后12周，骨材料完全降解，大量新生骨组织填充原骨缺损处，人工骨材料被新骨完全替代，见图7B。

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引言

骨损伤及骨缺损修复一直是临床治疗的难点及热点^[1]，美国每年因骨缺损移植手术量仅次于输血^[2]，中国目前肢体伤残者超过800万，因交通、工伤、肿瘤等引起的骨破坏以每年8.1%的速度递增，临床的大量需求驱动骨材料研究的高速发展^[3-4]。在医学界，“自体骨”因无排异反应、骨缺损修复力强被认为是最佳骨移植材料^[5]，但其可用骨量稀少，且取骨时会造成医源性损伤，故不能广泛用于临床。异体骨来源丰富，但机械强度低下，具有一定的抗原性，并且自身携带抗原或病原体无法完全灭活^[6-7]，以及社会伦理问题也难以解决，故应用较少。天然及合成高分子材料骨传导性能不良，亲水性能较差；而无机材料硬度过高，脆性过大，骨诱导活性差^[8]。因此，研制出理想的骨生物材料已成为医学材料科学的热点^[9]。天然海洋生物扇贝壳主要成分为Ca²⁺、CO₃^2-，为人体自身含有元素，而且扇贝壳的同心圆结构与人体成骨过程中骨盐沉积的方向一致。鹿瓜多肽因含有多种骨肽、生长因子、钙磷等无机因子，故具有调节钙磷代谢、促进成骨、消炎镇痛、抗骨质疏松等作用。作者通过特殊工艺将两者进行复合，并予以3D打印^[10]，制备出内部结构完整、材料性质优异的复合骨材料，并进一步进行材料表征及生物相容性评价，旨在探究材料促成骨的可行性，为后期临床试验奠定基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料学及生物学实验。

1.2 时间及地点  实验于2017年1月至2018年12月在海军军医大学及苏州大学材料生物实验室完成。

1.3 材料  扇贝来自舟山群岛海域；成骨细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；鹿瓜多肽粉体介绍，见表1。

实验动物：2月龄SD大鼠，体质量250 g，雌雄各半，由海军军医大学实验动物中心提供；日本大耳白4只，体质量2.0-3.0 kg，由凯学生物科技(上海)有限公司提供。动物实验由解放军第二军医大学伦理委员会批准。

实验用主要试剂与仪器：DMEM高糖培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；倒置相差显微镜(北京欧波同光学技术有限公司)；细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK-8试剂盒)(AMEKO公司)；烘箱(苏州昇远烘箱设备有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 复合材料的制备取来自东海海域大小相近的扇贝数只，取其壳，置于5%NaOH溶液中浸泡1 h，去离子水反复清理，在超声分散器中进一步清洗后，置入烘箱(60 ℃)中24 h，烘干；将贝壳放入高压反应器中，采用直通方式通入高压蒸汽，温度100 ℃，压力0.3 MPa，反应12 h，冷却、干燥、研磨，过300目筛得到扇贝壳粉体。取一定量鹿瓜多肽粉体及乙基纤维素，溶于体积分数75%乙醇中，注入打印墨盒中，作为打印液备用；将贝壳粉末平铺于3D打印机(型号：Discovery系列，瑞士RegenHU公司)的工作台上；由模型设计软件生成CAD模型数据转化为STL数据文件，经过数据处理，将其导入打印机控制软件中，设定打印参数；打印喷头按照参数进行指定区域内工作，黏结贝壳粉，形成二维片剂，通过逐层打印，层层叠加的方式，完成多孔海洋贝    壳/鹿瓜多肽复合支架的制备(大小5 mm×5 mm×5 mm)。将材料放入40 ℃烘箱中12 h，烘干，成品备用。

1.4.2 复合材料浸提液的制备取一定量多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽复合支架材料粉体，经环氧乙烷消毒后，置入无菌容器中，加入适量DMEM液充分溶解，浸提比例为0.725 g/L，放置于37 ℃环境中，3 d后取上层溶液，置入无菌长管中，放入离心机，4 500 r/min离心5 min，取其上清液。

1.4.3 复合材料的表征

生物力学测试：随机取复合材料5片，分次放置于电子万能试验机加载台上，启动后，试验机予以片剂施加一个垂直压力，速度为1 mm/min，观察其应力-应变情况，检测其最大抗压强度。

X射线衍射扫描分析：取一定量的复合材料粉体，在玛瑙研钵中均匀研磨后，过300目筛，将所得粉体均匀平铺于X射线衍射仪样品台上，扫描角度10°-90°，扫描速度 4 (°)/min进行检测。

扫描电镜检测：取复合材料片剂，截取其横断面，置于电镜样品台的导电胶上，予以样品表面喷金后放入电镜样品仓中，真空条件下放大不同倍数予以观察，了解其微观形态结构、孔隙率、孔径大小。

1.4.4 复合材料的细胞相容性

倒置显微镜观察：将第3代SD大鼠成骨细胞接种于9孔板中，细胞浓度为5×10⁸ L^-1，放置于恒温恒湿培养箱中。24 h后在每孔中加入2 mL复合材料浸提液，每2 d换液1次并加入相同量浸提液，于第1，3，5天将培养板放置于倒置显微镜下进行观察，了解成骨细胞的形态结构、活性及增殖情况。

CCK-8细胞毒性实验：将第3代SD大鼠成骨细胞悬液添加至64孔培养板中，细胞浓度为5×10⁸ L^-1，每孔100 µL，置于CO₂恒温恒湿细胞培养箱中。24 h后待细胞完全贴壁，在1-4列的孔中各添加100 µL复合材料浸提液，作为实验组；5-8列孔中各添加100 µL DMEM液，作为对照组；将培养板放入箱中继续培养，于第2，4，6，8天取出培养板，将10 µL CCK-8试剂添加至实验组和对照组的各一列孔中，检测吸光度，取得相应数据，各组间进行细胞相对增殖率换算(实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%)，当细胞相对增殖率≥75%，细胞毒性等级为0或1级，合格；细胞相对增殖率为50%-74%，细胞毒性等级为2级，应结合细胞形态综合评价；细胞相对增殖率≤49%，细胞毒性等级为3-5级，不合格。

扫描电镜观察：将第3代成骨细胞接种于复合材料上，放置于CO₂恒温恒湿细胞培养箱中，培养24，72 h后取出复合材料，PBS清洗，予以2%戊二醛固定、锇酸染色、依次采用体积分数70%，80%，90%，100%的乙醇进行脱水，真空干燥后喷金，电镜下观察，了解成骨细胞在复合材料上的黏附、增殖及形态。

1.4.5 复合材料的组织相容性

毒性实验：将10只SD大鼠随机分成实验组和对照组，每组5只，实验组大鼠腹腔中注射250 g/L复合材料混悬液 2 mL；对照组注射等量生理盐水；实验后1个月检测体质量、血常规、生化指标，并于给药后1个月处死大鼠，取其心、肝、脾、肺、肾，做病理切片，观察材料蓄积情况。

肌肉植入实验：选取大小一致的SD大鼠10只，腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠失去知觉后，在其脊柱正中向右旁开0.5 cm处切开，分离椎旁肌肉，植入消毒后的多孔扇贝壳/鹿瓜多肽复合材料片剂0.5 g。1个月后取植入材料周围处肌肉，予以苏木精-伊红染色，观察肌肉组织炎性情况。

骨植入实验：取4只日本大耳白兔，麻醉后予以左前肢备皮，切开皮肤、皮下组织，分离肌肉，保护神经及血管，暴露桡骨中段，剥离骨膜，在左侧桡骨远端3 cm处将线锯由一侧穿过桡骨骨间膜至对侧形成1 cm长度骨缺损，植入复合骨材料，术后6，12周各处死兔2只，取其前肢桡骨中段骨缺损处做病理，观察骨缺损重建情况。

1.5 主要观察指标  多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽复合材料的细胞相容性与组织相容性。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行独立样本t 检验。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨修复材料需要兼具以下特点^[13]：稳定的降解率，优良的生物相容性；一定的生物力学强度和结构的可塑性及良好的骨传导、骨诱导性。目前临床上使用的单一骨支架材料主要采用水热浇筑、原位成形、低温冻干等方法制备^[14-16]，多关注于材料的“爬行替代”作用，而忽视“诱导成骨”及病损部位的解剖结构，于是越来越多的医学研究人员将目光投向生命科学、工程学及相关学科的综合运用^[17]，研制符合上述所有要求的复合材料。目前复合材料的研究主要分为以下几类^[18]：①钙磷陶瓷同类材料的相互复合，其特点为成骨活性较好、降解速度稳定；②天然高分子材复合钙磷陶瓷材料，其特点为天然高分子材料可模拟细胞外基质成分，钙磷与骨质成分相似；③人工合成高分子材料复合钙磷陶瓷材料，其特点为生物相容性好和骨结合力高；④人工合成高分子材料的相互复合，其特点为塑形能力强。目前，虽然骨支架材料的研究取得了一些进展，但将其广泛运用于临床还有待提高。所以，临床上的骨材料研究正逐步转向骨组织工程^[19]，其基本思路是：体内成骨细胞能够吸附于可稳定降解的支架材料上形成细胞-材料复合体，细胞不断在材料三维空间上增殖并促使骨盐沉积，最终形成具有与原功能和形态相同的骨组织。所以良好的骨修复材料需要满足3个要素^[20]，即种子细胞、支架材料、生物活性因子，其分别与成骨过程中的骨生成、骨传导及骨诱导相关。

3D打印三维多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽支架材料是一款兼具诱导成骨和高精度孔隙率及个性化的骨移植材料^[21-22]。众所周知，扇贝是一种常见的天然海洋贝类，其贝壳主要成分为碳酸钙^[23]，大量实验及临床证明Ca²⁺、CO₃^2-为构成人体的必要元素，其在体内可被彻底降解吸收，不产生炎症反应和异物刺激作用。研究表明碳酸钙作为骨修复材料时，降解速度与新骨生长速度基本一致(平均8-12周)。成骨过程中骨盐沿碳酸钙支架沉积并替代，完成新骨的结构重建，但其在骨缺损修复过程中主要提供Ca²⁺和支架结构，缺乏诱导成骨活性。鹿瓜多肽作为中国拥有自主知识产权的复方制剂^[24]，其主要来源于梅花鹿和甜瓜种子的提取物，含有多种骨诱导因子及生长因子^[25-26]，能促进成骨细胞增殖、增加骨钙沉积、促进骨质生长、增强骨骼强度，但其扩散快、半衰期短、利用率低，不利于骨的重建与修复。将两者结合可实现优势互补，但仍缺乏良好的空间结构。3D打印技术的个性化定制、高精度、成品快等优点可弥补上述不足。此次实验通过3D打印技术制备出了多孔海洋贝壳复合鹿瓜多肽生物支架材料，验证其是否具有良好的力学性能^[27]、空间结构^[28]、降解性^[29]、生物相容性及骨诱导活性^[30]，以确保临床使用的安全及有效。实验力学性能检测显示材料强度超过10 MPa，证明其生物力学性能良好；扫描电镜下发现该人工骨存在三维空间结构，多孔隙率，具有良好的比表面积，能够最大限度地满足成骨细胞的爬行与增殖，具有良好的支架结构^[31]，有利于毛细血管的长入，使成骨细胞能够充分吸取营养及进行相关新陈代谢；具有良好的稳定降解性，使骨盐的沉积与材料的降解速度相一致。X射线衍射扫描证实材料的组成为碳酸钙及鹿瓜多肽，且鹿瓜多肽的加入并未改变碳酸钙晶体结构。

目前常用于评价材料的安全性方法为细胞培养及材料植入实验，细胞培养实验具有良好的灵敏度及可重复性，并能直接获得材料细胞毒性的结果；体内植入实验可以观察材料与活体组织的相互作用。此次实验将成骨细胞在海洋贝壳/鹿瓜多肽材料浸提液中培养，观察到细胞形态饱满，增殖数量上升明显，通过电镜扫描进一步发现随着时间的延长，黏附在材料表面的细胞不断增殖、爬行、分化，在三维空间结构中铺展并向材料内部贯穿与延申，材料良好的比表面积为细胞生长提供了优良环境。毒性实验证实材料在体内可降解，未对动物各器官功能造成损害，且不会在各器官组织内沉积。肌肉组织切片发现，早期在材料周围有少量炎症细胞，但随时间增长未发现大量炎症细胞聚集，且炎症指数逐渐下降，为一过性变化，完全符合正常应激反应规律，说明材料与机体组织具有亲和性。骨植入实验苏木精-伊红染色证实，此人工骨材料能够促进骨缺损的修复，且完全遵从正常的骨再生规律，当材料植入骨缺损处后，鹿瓜多肽释放稳定的骨形态发生蛋白^[32]、转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子^[33]、胰岛素样生长因子Ⅰ、胰岛素样生长因子Ⅱ等因子，诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞及软骨^[34-40]；成骨细胞聚集在材料周围，同时降低骨折处毛细血管通透性，缓解血液黏稠度，减少异物巨细胞、肉芽肿或其他炎症细胞反应，增加骨缺损处血供，改善骨痂处血循环^[41]；碳酸钙提供的良好支架结构及钙离子促进骨缺损处不断骨盐沉积、骨岛和骨小梁形成，材料与新生骨组织相互融合并逐渐降解，新生骨组织与正常骨质相一致。

综上所述，3D打印三维多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽复合支架材料具有骨传导及诱导性能好、生物力学强度高、生物相容性佳等优点，但材料的最佳配比仍需进一步探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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文题释义：

鹿瓜多肽：作为中国拥有自主知识产权的复方制剂，其主要来源于梅花鹿和甜瓜种子的提取物，含有多种骨诱导因子及生长因子，能促进成骨细胞增殖，增加骨钙沉积，促进骨质生长，增强骨骼强度，但鹿瓜多肽药物扩散快、半衰期短、利用率低，不利于骨的重建与修复。

骨传导：是指在骨折愈合或骨缺损修复过程中，需要有一个媒介为在新骨形成及血管长入提供一个支架，如异体骨、瑞特人工骨等。
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延伸阅读

骨缺损与骨损伤的治疗过程中极易出现骨不连，原因为植入的支架材料不能很好的促进骨质再生。自体骨是治疗骨缺损的金标准，但来源有限及二次创伤，故临床应用受到限制。扇贝壳来源广，生物机械性能及生物相容性佳，能为骨的重建提供丰富稳定的Ca²⁺及良好的支架结构；而鹿瓜多肽作为中药提取物，含有丰富的生物活性因子能有效诱导成骨；两者结合相得益彰；此复合材料将来有可能成为患者的福音，也可能成为一项节能，环保及促进祖国中医药发展的事业。
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3D打印三维多孔海洋贝壳/鹿瓜多肽支架材料的生物相容性

Biocompatibility of 3D printed three-dimensional porous marine shell/cervus and cucumis polypeptide composite scaffold material

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