携载盐酸吉西他滨聚乳酸纤维膜可抑制骨肿瘤的生长

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0756

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (14): 2221-2226.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0756

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携载盐酸吉西他滨聚乳酸纤维膜可抑制骨肿瘤的生长

刘星志^1，2，3，相宜^1，2，3，鞠晓晶^1，2，3，崔文国^1，2，3，施勤^1，2，3

¹苏州大学医学部，江苏省苏州市 215006；²苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006；³苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2017-12-11 出版日期:2018-05-18 发布日期:2018-05-18
通讯作者: 施勤，副教授，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006
作者简介:刘星志，男，1991年生，江苏省徐州市人，汉族，硕士。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(51373112)

Poly(lactic acid) electrospun fiber membranes carrying gemcitabine hydrochloride inhibit the growth of bone tumor

Liu Xing-zhi^{1, 2, 3}, Xiang Yi^{1, 2, 3}, Ju Xiao-jing^{1, 2, 3}, Cui Wen-guo^{1, 2, 3}, Shi Qin^{1, 2, 3}

¹Medical School of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; ²Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Jiangsu 215006, Jiangsu Province, China; ³Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2017-12-11 Online:2018-05-18 Published:2018-05-18
Contact: Shi Qin, Associate professor, Medical School of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Jiangsu 215006, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Liu Xing-zhi, Master, Medical School of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Jiangsu 215006, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 51373112

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

载药聚乳酸纤维膜：能有效增大药剂的表面积，使水溶性药物随着纤维的降解及自身的扩散而缓慢被人体吸收，药物释放时间延长，释放浓度较慢，药物能充分地被人体吸收，能够更加有效发挥药效。

盐酸吉西他滨：是一种人工合成的胞嘧啶核苷酸类抗代谢物抗癌药，具有光谱抗肿瘤活性高、不良反应小等优点，因此在治疗恶性肿瘤中应用较广泛。临床研究发现，盐酸吉西他滨能抑制骨肉瘤细胞生长，诱导细胞凋亡，并且可与多西紫杉醇、卡铂等多种化疗药联合使用产生协同效应，增强抗肿瘤作用，但因为盐酸吉西他滨水溶性好，释放速度过快，导致临床效果不理想。

背景：盐酸吉西他滨是一种水溶性抗癌药，可诱导肿瘤细胞凋亡，但其在体内存在释放过快等缺点。

目的：观察载携盐酸吉西他滨聚乳酸静电纺丝纤维膜对人骨肉瘤细胞株MG-63生长的影响。

方法：分别制备聚乳酸静电纺丝纤维膜(对照组)与携载盐酸吉西他滨的聚乳酸静电纺丝纤维膜(实验组)，并进行表征。将两组纤维膜分别浸泡于DMEM低糖培养基中，3，5，7 d取释放上清液。将第5代骨肉瘤细胞株MG-63接种于96孔板，每孔均加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM低糖培养基，分7组培养，其中3组分别加入实验组3，5，7 d的释放上清液，另3组分别加入对照组3，5，7 d的释放上清液，以不加入释放上清液的为阴性对照组，培养3 d后，CCK-8法检测细胞增殖，RT-PCR检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达。

结果与结论：①实验组与对照组纤维膜纤维丝平滑均一，表面没有明显的颗粒，两种纤维膜的纤维直径、接触角、拉伸强度比较差异无显著性意义；②CCK-8结果显示，与阴性对照组比较，对照组不同时间点的释放上清液对骨肉瘤细胞株MG-63的增殖无影响；与阴性对照组比较，实验组不同时间点的释放上清液可抑制骨肉瘤细胞株MG-63的增殖(P < 0.05)，并且随着释放上清液时间的延长，抑制作用越来越明显；③RT-PCR结果表明，与相同时间点对照组释放上清液比较，实验组释放上清液可增加细胞Bax mRNA表达，降低Bcl-2 mRNA表达；④结果表明携载盐酸吉西他滨的聚乳酸静电纺丝纤维膜，可持续抑制人骨肉瘤细胞MG-63的增殖，促进其凋亡。

ORCID: 0000-0001-8134-4267(刘星志)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 微溶胶静电纺丝, 水溶性药物, 抗肿瘤支架, 组织工程, 生物材料, 盐酸吉西他滨, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Gemcitabine hydrochloride is a water-soluble anticancer drug that induces apoptosis in tumor cells, but it has an excessive release in vivo.

OBJECTIVE: To evaluate the effect of poly(lactic acid) (PLA) electrospun fiber membranes carrying gemcitabine hydrochloride on the growth of human osteosarcoma cell lines MG-63.

METHODS: PLA electrospun fiber members with (experimental) or without (control) gemcitabine hydrochloride were fabricated and characterized. Two kinds of fiber membranes were immersed in low-glucose DMEM medium, and the supernatants were collected in the two groups at 3, 5, 7 days, respectively. Passage 5 human osteosarcoma cell lines MG-63 were inoculated into 96-well plates containing low-glucose DEME with 15% fetal bovine serum, and divided into seven groups. Groups 1-3 were cultured in the experimental supernatants of 3, 5, 7 culture days, and groups 4-6 were cultured in the control supernatants of 3, 5, 7 culture days, respectively. The remaining group acted as the negative control with no supernatant. Thereafter, cell counting kit-8 was used to detect cell proliferation, and RT-PCR was used to measure expression of Bcl-2 and Bax at 3 days of culture.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) No obvious particle was found on the smooth and even surface of the fiber members in the experimental and control groups. There was no significant difference in fiber diameter, contact angle and tensile strength between the two kinds of fiber membranes. (2) The results of cell counting kit-8 showed that compared with the negative control group, the supernatant released from the control group had no effect on the MG-63 proliferation at different time points, while the supernatant released from the experimental group could inhibit the MG-63 proliferation at different time points (P < 0.05), and the inhibitory effect became more and more obvious with the prolongation of release time. (3) RT-PCR findings showed that compared with the control group, the supernatant released from the experimental group could increase Bax mRNA expression and decrease Bcl-2 mRNA expression at the same time point. To conclude, the PLA electrospun fiber membranes carrying gemcitabine hydrochloride can sustainably inhibit MG-63 proliferation and promote cell apoptosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Osteosarcoma, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘星志，相宜，鞠晓晶，崔文国，施勤. 携载盐酸吉西他滨聚乳酸纤维膜可抑制骨肿瘤的生长[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(14): 2221-2226.

Liu Xing-zhi, Xiang Yi, Ju Xiao-jing, Cui Wen-guo, Shi Qin. Poly(lactic acid) electrospun fiber membranes carrying gemcitabine hydrochloride inhibit the growth of bone tumor[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(14): 2221-2226.

图/表（结果） 5

2.1 静电纺丝纤维膜的形貌分析图1显示两种静电纺丝纤维膜的表面形态，可看出纤维丝平滑均一，表面没有明显的颗粒，表明药物全部进入到纤维中间，而不是表面；对照组、实验组纤维膜的直径分别为(0.83±0.18)，(0.89±0.31) μm。从图2中可看出微溶胶技术制备的实验组纤维膜核壳结构明显，非微溶胶技术制备的聚乳酸纤维膜没有核壳结构。

2.2 静电纺丝纤维膜理化性能分析图3A，B显示的是电纺丝纤维膜的亲水性，从图中看出，对照组和实验组静电纺丝纤维膜的接触角基本无差异，说明表面微溶胶静电纺丝的方式并不影响静电纺丝纤维膜本身的亲水性。并且因为透明质酸和盐酸吉西他滨是水溶性的，而纤维膜仍然疏水，这表明所有的透明质酸和药物都被包裹在了纤维膜中，而不是其表面。

图3C显示的是静电纺丝纤维膜在拉伸测试中的应力-应变曲线图，从图中可看出，对照组、实验组纤维膜的拉伸强度分别为(4.08±0.25)，(4.04±0.16) MPa，微溶胶静电纺丝纤维膜和非微溶胶静电纺丝纤维膜之间的拉伸强度无显著差异。

2.3 静电纺丝纤维膜的体外抑瘤作用图4显示人骨肉粒细胞MG63在实验组和对照组静电纺丝膜释放上清液中的增殖情况，结果显示对照组纤维膜释放上清液不影响肿瘤细胞的增殖；实验组不同时间点的释放上清液可抑制MG-63细胞的增殖，且随着释放时间的增加，对肿瘤细胞的杀伤作用越来越强，表明药物在持续缓慢的释放。

图5显示人骨肉瘤细胞MG63在实验组和对照组静电纺丝膜释放上清液中的凋亡相关基因表达情况，可看出，与对照组相同时间点释放上清液相比，实验组纤维膜释放上清液中的细胞Bax mRNA表达增高，Bcl-2 mRNA表达降低，表明盐酸吉西他滨有诱导MG-63凋亡的作用，且随着释放时间的延长，Bcl-2 mRNA表达率逐渐降低。

参考文献

[1] 胡晓晖,施鑫,吴苏稼.骨肉瘤误诊为动脉瘤样骨囊肿二例分析并文献复习[J].中国骨与关节杂志,2011,10(5):525-527.

[2] 汪新媛,田京.骨肉瘤化疗研究进展[J].国际骨科学杂志, 2010, 31(3):159-161.

[3] 王翌庆,丁克峰.大剂量甲氨蝶呤多药联合治疗骨肉瘤不良反应的处理和分析[J].实用肿瘤杂志, 2009,24(4):407-410.

[4] 许建波,杨祚璋,肖砚斌.全股骨人工假体置换治疗右股骨骨肉瘤一例[J].中华肿瘤防治杂志,2007,14(3):239-240.

[5] 王浩,陈学思,邓英杰.吉西他滨聚L-乳酸中空微球的制备及其酶解释放行为研究[J].中国药剂学杂志:网络版,2011,9(2): 21-29.

[6] 张振兴,杜鸿达,李佳,等.静电纺丝制备定向排列聚酰亚胺基炭纳米纤维[J].新型炭材料,2015, 30(4):289-294.

[7] 刘俊,常梦洁,杜慧玲.静电纺丝制备SU-8光刻胶纳米纤维及图案阵列[J].高分子材料科学与工程,2016, 32(4):121-125.

[8] 单晓茜,刘昌胜,欧阳春发,等.可降解聚合物抗菌纤维膜的原位制备及性能表征[J].科学技术与工程,2015, 15(4):180-185.

[9] 钱宇娜,李林昊,蒋超,等.静电纺丝天然-人工合成聚合物复合纳米纤维及其对细胞黏附、增殖和迁移的影响[J].功能材料, 2012, 43(18):2473-2477.

[10] 马利婵,王娇娜,李丽,等.静电纺空气过滤用PET/CTS抗菌复合纳米纤维膜的制备[J].高分子学报,2015,59(2):221-227.

[11] Hasan A,Yildirimer L,Hobson D,et al.Tissue‐Engineered Human Skin Equivalents and Their Applications in Wound Healing.Tissue Engineering for Artificial Organs.Wiley‐VCH Verlag GmbH & Co.KGaA,2017:215-241.

[12] 杨春宇,陈思浩,楼建中,等.静电纺纳米复合纤维在气体传感器中的应用研究进展[J].化工新型材料,2016,44(6):13-15.

[13] 徐衍,包崇云.静电纺丝技术在牙周组织再生中的应用[J].口腔医学研究,2015,31(11):1159-1163.

[14] 李丽,关小倩,李静,等.吉西他滨对晚期癌症的治疗效果[J].中国癌症杂志,2000,10(6):575-576.

[15] Ciccolini J,Serdjebi C,Peters GJ,et al.Pharmacokinetics and pharmacogenetics of Gemcitabine as a mainstay in adult and pediatric oncology: an EORTC-PAMM perspective.Cancer Chemother Pharmacol. 2016;78(1):1-12.

[16] 韩志超,许杉杉,佴刚.一种负载有靶向抗癌药物的PLGA微米颗粒的制备方法:CN103599073A[P].2014.

[17] 胡旭昌,王栓科,康学文,等.吉西他滨对人骨肉瘤细胞增殖及肿瘤转移相关基因1mRNA表达的影响[J].中国全科医学, 2013, 16(29):3450-3452.

[18] 颜慧琼,陈秀琼,李嘉诚,等.海藻酸盐水凝胶作为组织工程支架材料改性与应用研究进展[J].化工新型材料, 2017,45(3):28-30.

[19] 范洁,李岩,周苏波,等.用静电纺丝制备PCL/明胶新型组织工程支架用于人鼻中隔软骨修复研究[J].浙江临床医学, 2016,18(10): 1831-1833.

[20] 尹合勇,孙振,李盼,等.Cytodext-3微载体/藻酸钠水凝胶作为可注射性支架构建组织工程软骨的可行性[J].中国组织工程研究, 2016,20(34):5104-5109.

[21] 王小毅,张诚.丝素蛋白—壳聚糖支架在组织工程中的应用新进展[J].中国美容整形外科杂志,2017, 28(4):244-245.

[22] 王鹏燕,叶雅静,何进,等.制备大孔径静电纺丝组织工程支架的研究进展[J].现代生物医学进展,2015, 15(1):155-159.

[23] 王玉姣,田明伟,曲丽君.静电纺丝纳米纤维的应用与发展[J].成都纺织高等专科学校学报,2016, 33(4):1-16.

[24] 虞希高,陈正坚,蒋宏亮,等.静电纺丝小直径人造血管机械力学性质[J].中国生物医学工程学报,2010,29(5):770-776.

[25] 王浩,温梦,康卫民,等. W/O乳液静电纺丝法制备盐酸环丙沙星聚L-乳酸纤维膜及表征[J].沈阳药科大学学报, 2016,33(6): 426-433.

[26] Zhao X, Yuan Z, Yildirimer L,et al. Tumor-Triggered Controlled Drug Release from Electrospun Fibers Using Inorganic Caps for Inhibiting Cancer Relapse. Small. 2015; 11:4284-4291.

[27] Cheng L, Sun X, Hu C, et al. In vivo inhibition of hypertrophic scars by implantable ginsenoside-Rg3-loaded electrospun fibrous membranes. Acta Biomaterialia. 2013;9:9461.

[28] Yoshimoto H, Shin YM, Terai H,et al. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 2003;24:2077-2082.

[29] Shin M, Ishii O, Sueda T, et al. Contractile cardiac grafts using a novel nanofibrous mesh. Biomaterials. 2004;25:3717-3723.

[30] Kim K, Yu M, Zong X, et al. Control of degradation rate and hydrophilicity in electrospun non-woven poly( d , l -lactide) nanofiber scaffolds for biomedical applications. Biomaterials. 2003;24:4977-4985.

[31] Mo XM, Xu CY, Kotaki M, et al. Electrospun P(LLA-CL) nanofiber: a biomimetic extracellular matrix for smooth muscle cell and endothelial cell proliferation. Biomaterials. 2004;25:1883.

[32] Xu CY, Inai R, Kotaki M,et al. Aligned biodegradable nanofibrous structure: a potential scaffold for blood vessel engineering. Biomaterials. 2004;25(5):877-886.

[33] Xu C, Inai R, Kotaki M, et al.Electrospun nanofiber fabrication as synthetic extracellular matrix and its potential for vascular tissue engineering. Tissue Eng. 2004;10(7-8):1160-1168

[34] Katti DS, Robinson KW, Ko FK, et al. Bioresorbable nanofiber-based systems for wound healing and drug delivery: optimization of fabrication parameters. J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2004;70(2):286-296.

[35] 罗永慧,赵宁宁,刘漪沦,等.聚乳酸支架材料与角膜上皮样细胞的体外生物相容性[J].四川解剖学杂志, 2015,23(1):1-5.

[36] 王延松,范文源.一种新型药物缓释载体——聚乳酸(PLA)生物可降解纤维[J].中华实用医药杂志,2009,9(4):250-253.

[37] 蔡沈阳,胡广,任杰.乳丝的加工、性能及其应用[J].生物工程学报, 2016,32(6):786-977.

[38] 卢杭诣,崔静,王清清,等.载药同轴静电纺玉米醇溶蛋白/聚乙烯醇-苯乙烯基吡啶盐缩合物复合纳米纤维的制备及性能[J].高分子材料科学与工程, 2016,32(8):131-136.

[39] Zhou P, Zhou L, Zhu C, et al. Nanogel-electrospinning for controlling the release of water-soluble drugs. J Mater Chem B.2016;4(12):2171-2178.

[40] 顾珊珊,张寒莹,朱嗣文,等.静电纺丝纳米纤维的制备及其蛋白药物缓释体系[J].中国医药工业杂志,2017,48(9):1325-1331.

[41] 于锐,徐哲伟,穆容超,等.基于不同载药方式的同轴电纺纤维膜的制备与性能[J].合成纤维,2016, 45(5):23-27.

[42] 谢红,卢华,黄华,等.载药聚乙烯醇/海藻酸钠静电纺丝纤维的改性及其药物体外释放研究[J].第三军医大学学报, 2011,33(23): 2485-2489.

[43] 周丽佳,徐召南,毕也,等.载顺铂联合氯喹聚乳酸静电纺丝膜对口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖的抑制作用[J].吉林大学学报(医学版),2016,42(5):892-896.

[44] 何创龙,黄争鸣,韩晓建,等.同轴射流技术制备纳米复合材料研究进展[J].复合材料学报,2005,22(6):1-8.

[45] Qiu K,He C,Feng W,et al.Doxorubicin-loaded electrospun poly(L-lactic acid)/mesoporous silica nanoparticles composite nanofibers for potential postsurgical cancer treatment.J Mater Chem B. 2013;1(36):4601-4611.

[46] Zeng J,Yang L,Liang Q,et al.Influence of the drug compatibility with polymer solution on the release kinetics of electrospun fiber formulation.J Control Release. 2005;105 (1-2):43-51.

[47] Maretschek S,Greiner A,Kissel T.Electrospun biodegradable nanofiber nonwovens for controlled release of proteins.J Control Release.2008;127(2):180-187.

[48] Siddiqui WA,Ahad A,Ahsan H.The mystery of BCL2 family: Bcl-2 proteins and apoptosis: an update. Arch Toxicol. 2015; 89(3):289.

[49] Xu G,Kuang G,Jiang W,et al.Polydatin promotes apoptosis through upregulation the ratio of Bax/Bcl-2 and inhibits proliferation by attenuating the β-catenin signaling in human osteosarcoma cells.Am J Transl Res.2016;8(2):922.

引言

材料方法

1.1 设计生物材料观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年5月至2017年1月在苏州大学骨科研究所完成。

1.3 材料

细胞株：骨肉瘤细胞株MG-63，购自中国科学院细胞库。将MG-63细胞培养在含体积分数10%胎牛血清、 100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM低糖培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂温箱培养。每 3 d更换新的培养基。当细胞生长至铺满培养皿的80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶4的比例传代细胞。

实验主要试剂和药品：聚乳酸(M_w=100 ku，江苏强盛功能化学股份有限公司)；二氯甲烷(分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司)；N，N-二甲基甲酰胺(分析纯，上海强顺化学试剂有限公司)；司班80(国药集团化学试剂有限公司)；透明质酸(M_w=0.5 Mu，武汉远城科技发展有限公司)；盐酸吉西他滨(南京正大天晴制药有限公司)；CCK-8(同仁化学研究所，日本)；DMEM低糖培养基(Hyclone)；胎牛血清(Biowest)；胰蛋白酶(Gibco)；青霉素，链霉素(碧云天生物技术研究所)。

实验主要仪器：静电纺丝高压电源(天津市东文高压电源厂)；精确微量注射泵(LSP01-1A，保定市兰格恒流泵有限公司)；电动搅拌机(D2010W，上海司乐仪器有限公司)；扫面电子显微镜(FESEM，Hitachi 4800)；透射电子显微镜(Hitachi，HT7700)；接触角仪(WCA，DSA25S)；PCR仪(Bio-rad)；全波长酶标仪(BioTek)；流式细胞仪(Guava easyCyte HT)。

1.4 实验方法

1.4.1 静电纺丝纤维膜溶液的制备

聚乳酸静电纺丝溶液的制备：将1 g聚乳酸加入8 g二氯甲烷中，在室温条件下高速搅拌30 min，搅拌均匀后，再加入4 g N，N-二甲基甲酰胺，继续高速搅拌20 min，最后得到均一稳定的聚乳酸静电纺丝溶液。

携载盐酸吉西他滨聚乳酸静电纺丝溶液的制备：将透明质酸加到水中，搅拌使其溶解。然后将1 mg盐酸吉西他滨加入到150 μL透明质酸溶液中，室温，高速搅拌20 min。将0.02 g司班80加入8 g二氯甲烷中，混匀后，加入含有盐酸吉西他滨的透明质酸溶液，高速搅拌形成乳浊液。再加入1 g聚乳酸，最后再加入4 g N，N-二甲基甲酰胺，搅拌30 min，最后得到均一稳定的携载盐酸吉西他滨聚乳酸的静电纺丝溶液。

1.4.2 静电纺丝纤维膜的制备在室温下，将聚乳酸静电纺丝溶液和携载载盐酸吉西他滨的聚乳酸静电纺丝溶液分别加入10 mL注射器中，注射器针头与接收器的距离为 12 cm，电场强度为12 kV，以0.2 mL/min的流速进行静电纺丝，分别得到聚乳酸静电纺丝纤维膜膜(对照组)和携载盐酸吉西他滨的聚乳酸静电纺丝纤维膜(实验组)。

1.4.3 静电纺丝纤维膜的表征

微观结构观察：对两组静电纺丝纤维膜表面喷金，在10 kV电压下，使用扫描电子显微镜观察纤维膜的形态结构；使用透射电子显微镜观察静电纺丝纤维膜的核壳结构。随机选取不同纤维，使用粒径分布软件测量纤维直径。

接触角检测：在室温下，使用接触角测量仪测量两组纤维膜的水接触角，评价纤维膜的表面亲水性。

力学性能测试：首先利用模具将两组干燥的纤维膜膜裁剪成固定的形状，尺寸为15.0 mm×3.0 mm×0.13 mm，再用力学测试仪对其进行拉伸力学测试，以5 mm/min的速度进行。

1.4.4 CCK-8法检测细胞增殖情况

释放上清液的制备：将两组纤维膜分别浸泡于DMEM低糖培养基中，3，5，7 d取释放上清液。

MTT检测：取消化好的第5代细胞株MG-63，以1× 10⁸ L^-1的细胞浓度接种于96孔板(孔内均含有体积分数10%胎牛血清DMEM低糖培养基)，置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱，分7组培养，其中3组分别加入实验组3，5，7 d的释放上清液，另3组分别加入对照组3，5，7 d的释放上清液，以不加释放液的含体积分数10%胎牛血清DMEM 低糖培养基培养为阴性对照组。培养细胞3 d后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，使用酶标仪测定450 nm处的吸收度。

1.4.5 RT-PCR检测释放上清液的制备同上。取消化好的第5代细胞株MG-63，以2×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于6孔板(孔内均含有10%胎牛血清DMEM 低糖培养基)，置于 37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱，分7组培养，其中3组分别加入实验组3，5，7 d的释放上清液，另3组分别加入对照组3，5，7 d的释放上清液，以不加释放液的含体积分数10%胎牛血清DMEM 低糖培养基培养为阴性对照组。培养3 d后，各孔加入1 mL Trizol，提取RNA，反转录成cDNA，进一步进行RT-PCR。反应条件为：40个循环，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，以GAPDH作为内参。

1.5 主要观察指标两组纤维膜的表征结果；两组纤维膜释放上清液对人骨肉瘤细胞MG63增殖及凋亡的影响。

1.6 统计学分析所有实验数据应用SPSS 19.0软件进行统计学处理，实验结果以x(_)±s表示，对数据进行单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

盐酸吉西他滨是一种人工合成的胞嘧啶核苷酸类抗代谢物抗癌药^[14-15]，具有光谱抗肿瘤活性高、不良反应小等优点^[16]，因此在治疗恶性肿瘤中应用较较广泛。临床研究发现，盐酸吉西他滨能抑制骨肉瘤细胞生长，诱导细胞凋亡，并且可与多西紫杉醇、卡铂等多种化疗药联合使用产生协同效应，增强抗肿瘤作用^[17]，但因为盐酸吉西他滨水溶性好，释放速度过快，导致临床效果不理想。

目前，各种各样的支架已被成功应用到了组织工程实验上^[18-20]，一种理想的组织工程支架应具有模拟细胞外基质结构、毒性小等特点^[21]。静电纺丝是从天然或人工合成的可降解聚合物制备而成的纤维支架。纤维膜具有独特的多孔性，能够从结构和功能两个方面模仿天然细胞外基质，使用静电纺丝技术制备的纤维膜被认为是理想的组织工程材料^[22-23]，可用于人造血管、药物输送等^[24-27]。静电纺丝支架的原材料，经常使用生物材料、复合材料甚至陶瓷材料的复合物，目前主要包括聚己内酯^[28-29]，右旋聚乳酸^[30]，左旋聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物等^[31-34]。以聚乳酸为原料的静电纺丝膜，是一种具有良好生物降解性，降解产物无毒，细胞毒性小，透气和良好力学性能的医用高分子材料，在生物医用中有着广泛应用^[35-37]。基于静电纺丝技术制备的载药聚乳酸纤维膜，能有效增大药剂的表面积，可以避免药物突释^[38-39]，还可以有效地防止药物在人体内的降解或者失活^[40]，使水溶性药物随着纤维的降解及自身的扩散而缓慢被人体吸收，药物释放时间延长，释放浓度较慢，药物能充分地被人体吸收，能够更加有效发挥药效^[41]。

根据负载药物方式的不同，静电纺丝可释放多种药物，包括脂溶性药物如顺铂、紫杉醇等，亲水性药物盐酸莫西沙星^[42-43]，对于亲水性药物如硫酸庆大霉素、5-氟尿嘧啶等，人们通过共混、乳液电纺、同轴静电纺丝等技术来实现控制药物释放。例如何创龙等^[44]利用同轴静电纺丝技术制备以聚己内酯为壳、白藜芦醇和硫酸庆大霉素为芯的纳米纤维，证明该技术制备的复合纳米纤维有较好的药物缓释作用。Qiu等^[45]以介孔二氧化硅负载阿霉素，再将其溶于高分子电纺溶液中，成功制备出负载阿霉素的复合纳米纤维。实验结果显示，纳米纤维可通过调节药物的浓度进行控制释放。但同轴静电纺丝需要的喷丝设备复杂，纺丝过程不稳定。Zeng等^[46]通过共混电纺制备负载盐酸阿霉素的纳米纤维，结果发现药物在力的作用下迁移到纤维表面，使得药物产生很大的突释现象，缩短了药物作用时间。Maretschek等^[47]采用乳液电纺法制备负载蛋白质的聚乳酸纤维，以细胞色素C作为亲水药物模型，药物释放实验显示纤维膜具有很低的突释效应，并且可实现较长时间的药物释放，但这种方式制备的纤维膜装载效率低。此次研究针对以上问题，通过改进，开发出简单高效、释放行为可调控的微溶胶静电纺丝，首先利用透明质酸溶作为载体，携载水溶性药物盐酸吉西他滨，然后将其与静电纺丝溶液混合，利用静电纺丝技术将药物装载进纤维中，接着对载药的静电纺丝纤维膜从扫描电镜、透射电镜、接触角、直径、力学性能等多个方面进行检测，结果发现与聚乳酸纤维膜相比，负载盐酸吉西他滨的聚乳酸静电纺丝纤维膜结构和性能无改变。疏水性没有改变，说明盐酸吉西他滨和透明质酸都在芯中而不是壳上，有利于药物的缓释。

此次研究结果显示，盐酸吉西他滨对人骨肉瘤MG-63细胞增殖有明显抑制作用，并且随着盐酸吉西他滨释放时间的增加，药物抑制效果越明显，实验组7 d释放上清液的细胞A值为阴性对照组的50%左右。Bcl-2和Bax均属于Bcl-2家族，是反映细胞凋亡的2个重要生物标志物，肿瘤的Bcl-2/Bax表达比例与其发生和发展密切相关，他们的比例对于发育、组织稳态和对病原体的保护至关重要^[48]。细胞凋亡与Bax和Bcl-2的相互作用密切相关^[49]，此次实验中通过RT-PCR检测人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA的相对表达量，与对照组相同时间点释放上清液比较相比，实验组释放上清液中细胞促凋亡基因Bax表达上调，抑制凋亡基因Bcl-2表达下降，表明盐酸吉西他滨具有明显促进MG-63细胞凋亡的作用。CCK-8实验结果显示，聚乳酸静电纺丝纤维可持续、缓慢的释放盐酸吉西他滨，其作用于MG-63细胞可抑制其增殖并诱导细胞凋亡。

实验制备了载有盐酸吉西他滨的聚乳酸静电纺丝膜，可持续稳定地作用于人骨肉瘤MG-63细胞，为骨肉瘤的治疗提供一种新方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

携载盐酸吉西他滨聚乳酸纤维膜可抑制骨肿瘤的生长

Poly(lactic acid) electrospun fiber membranes carrying gemcitabine hydrochloride inhibit the growth of bone tumor

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[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[3]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[4]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[5]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[6]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[7]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[8]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[9]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[10]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[11]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[12]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[13]	王皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李获, 黄波, 田广招, 刘舒云, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.
[14]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.
[15]	刘畅, 李大同, 刘元, 孔令擘, 郭瑞, 杨利学, 郝定均, 贺宝荣. 急性症状性骨质疏松性胸腰椎压缩骨折椎体强化手术后疗效欠佳：与骨水泥、骨密度、邻近骨折的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3510-3516.