新型可塑形同种骨修复材料修复运动性关节软骨损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.003

摘要/Abstract

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文题释义：
新型可塑形同种骨修复材料：新型可塑形同种骨修复材料由成骨基质颗粒、黏性载体组成，能为机体提供一定的力学性能。此外，新型可塑形同种骨修复材料以液态、泥膏状或含有颗粒状材料运用于凝胶剂，置入时切口相对较小，具备良好的组织相容性和骨传导能力。黏性载体则是将松散的成骨基质颗粒黏合在一起，使材料整体具备可塑性，提高材料的整体性能，发挥良好的骨修复作用。
新型可塑形同种骨修复材料的骨修复能力：与脱钙骨基质在材料中的比例关系密切。通常而言，脱钙骨基质含量较高的材料骨修复能力优于含量较低者。目前，临床上应用的可塑形同种骨修复材料主要以硫酸钙、甘油、高分子量水凝胶等为黏性载体，该材料在制备过程中使用的所有的组分均来自同种骨组织，能够有效提高材料中的脱钙骨基质颗粒含量，保证其含量在90%以上。

背景：目前临床上对于可塑形骨修复材料的基本组成及制备方法存在较大争议，且对于其在运动性关节软骨损伤中的修复效果尚缺乏报道。
目的：分析新型可塑形同种骨修复材料修复运动性关节软骨损伤的效果。
方法：取36只新西兰大白兔，建立关节软骨损伤模型后，随机分为2组，实验组采用新型可塑形同种骨修复材料(为脱钙骨基质与骨胶原复合物)修复，对照组采用透明质酸钠凝胶修复，修复后3周，采用动物实验跑台模拟运动员受伤后的运动训练，30 min/次，连续运动5次。修复后16，18，20周，进行缺损部位组织学观察。
结果与结论：①修复后16周，实验组缺损部位修复良好，周围未见明显炎症反应，且与周围组织出现融合；对照组修复部位存在一裂隙，材料与间质部位相互融合，修复部位周围未见炎症反应；②修复后18周，实验组损伤部位可见排列紧密的脱细胞骨基质颗粒，纤维结缔组织相对较少，宿主骨边缘存在新骨；对照组损伤部位愈合，但新骨相对较少；③修复后20周，实验组损伤部位被纤维结缔组织填充，纤维结缔组织内存在大量的血管长入，周围宿主骨边缘可见少量新生组织；对照组损伤部位得到改善，但未见新生血管；④结果表明，新型可塑形同种骨修复材料可促进运动性关节软骨损伤的修复且排斥反应小。

ORCID: 0000-0002-1154-2126(丁晨光)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 新型可塑性同种骨修复材料, 运动性关节软骨损伤, 修复效果, 透明质酸钠凝胶, Wakitani评分, 炎症反应

Abstract:

BACKGROUND: Currently, the components and preparation methods of plastic bone repair materials remain controversial, and rare studies focus on their repair effects on sport-related articular cartilage injury.
OBJECTIVE: To analyze the effect of a novel plastic homogeneous bone repair material to repair sport-related articular cartilage injury.
METHODS: Thirty-six New Zealand rabbits were selected to prepare articular cartilage injury models, and were randomized into two groups. Model rabbits were repaired with the novel plastic homogeneous bone material (a composite of demineralized bone matrix and collagen) as experimental group, while the others repaired with sodium hyaluronate gel as control group. At 3 weeks after repair, treadmill system was utilized to stimulate sports training after athlete injury, for five consecutive sessions of 30 minutes each. At 16, 18 and 20 weeks after repair, the defect region was observed histologically.
RESULTS AND CONCLUSION: At 16 weeks after repair, the defect region healed well and integrated with the surrounding tissues, and no significant inflammatory reaction appeared around the material in the experimental group; in the control group, a fissure appeared at the defect region but with no inflammatory reaction, and the material integrated with the interstitial site. At 18 weeks after repair, closely arranged acellular bone matrix could be found in the defect region, fibrous connective tissues were fewer, and there was a new bone formation around the edge of host bone in the experimental group; the defect region healed, but new bones were fewer in the control group. At 20 weeks after repair, the defect region in the experimental group was filled with fibrous connective tissues, in which there were numerous new blood vessels, and a few of new tissues appeared around the edge of host bone; the defect region in the control group was improved and no neovascularization occurred. These findings suggest that the novel plastic homogeneous bone material can promote the repair of sport-related articular cartilage injury with less rejection reactions.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Collagen, Hyaluronic Acid, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

丁晨光，付平. 新型可塑形同种骨修复材料修复运动性关节软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(34): 5033-5038.

Ding Chen-guang, Fu Ping. A novel plastic homogeneous bone repair material for sport-related articular cartilage injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(34): 5033-5038.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] Vo N,Niedernhofer LJ,Nasto LA,et al.An overview of underlying causes and animal models for the study of age-related degenerative disorders of the spine and synovial joints.J Orthop Res. 2013;31(6):831-837.
[2] Capeci CM,Turchiano M,Strauss EJ,et al.Osteochondral allografts: applications in treating articular cartilage defects in the knee.Bull Hosp Jt Dis. 2013;71(1):60-67.
[3] 张仲文,侯世科,杨造成,等.基质诱导的自体软骨细胞移植术修复膝关节软骨缺损10例术后2年的随访[J].中华关节外科杂志(电子版),2010,4(6):17-21.
[4] 张永涛,金丹.组织工程骨软骨复合体构建的研究进展[J].中国修复重建外科杂志,2011,25(9):1120-1124.
[5] Komárek J,Vali P,Repko M,et al.Treatment of deep cartilage defects of the knee with autologous chondrocyte transplantation: long-term results.Acta Chir Orthop Traumatol Cech. 2010;77(4):291-295.
[6] Lim HC,Bae JH,Song SH,et al.Current treatments of isolated articular cartilage lesions of the knee achieve similar outcomes.Clin Orthop Relat Res. 2012;470(8): 2261-2267.
[7] 李元城,张卫国,秦建华,等.微流控芯片上胰岛素样生长因子1和碱性成纤维细胞生长因子对兔关节软骨细胞增殖的影响[J].解放军医学杂志,2013,38(6):476-480.
[8] Schwarz S,Koerber L,Elsaesser AF,et al.Decellularized cartilage matrix as a novel biomatrix for cartilage tissue-engineering applications.Tissue Eng Part A. 2012;18(21-22):2195-2209.
[9] Cheng H,Byrska-Bishop M,Zhang CT,et al.Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics.Biomaterials.2012;33(20):5004-5012.
[10] 刘清宇,王富友,杨柳.关节软骨组织工程支架的研究进展[J].中国修复重建外科杂志,2012,26(10):1247-1250.
[11] 贵浩然,李澎,张卫国.制备软骨组织工程支架的材料和方法[J].中国组织工程研究,2013,17(3):509-516.
[12] 梁卫东,王宏伟,王志强.不同骨组织工程支架材料的生物安全性及性能[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(34):6385-6388.
[13] Salzmann GM,Sah BR,Schmal H,et al.Microfracture for treatment of knee cartilage defects in children and adolescents.Pediatr Rep.2012;4(2):e21．
[14] Ebert JR,Robertson WB,Woodhouse J,et al.Clinical and magnetic resonance imaging-based outcomes to 5 years after matrix-induced autologous chondrocyte implantation to address articular cartilage defects in the knee.Am Sports Med.2011;9(4):753-763.
[15] Hirschmuller A,Baur H,Braun S,et al.Rehabilitation after autolo- gous chondrocyte implantation for isolated cartilage defects of the knee.Am J Sports Med. 2011; 39(12): 2686-2696．
[16] Wondrasch B,Zak L,Welsch GH,et al.Effect of accelerated weight bearing after matrix-associated autologous chondrocyte implantation on the femoral condyleon radiographic and clinical outcome after 2 years: a prospective,randomized controlled pilot study.Am Sports Med.2009;37(Supp1):88S-96S．
[17] Pestka JM,Schma H,Salzmann G,et al.In vitro cell quality of articular chondrocytes assigned for autologous implantation in dependence of specific patient characteristics.Arch Orthop Trauma Surg. 2011;131(6):779-789.
[18] 钟进聪,王震.大众体育与竞技体育运动损伤的成因及对策[J].广州体育学院学报,2014,34(1)109-111.
[19] 张卉,董学君,邵健忠,等.改良人骨髓间充质干细胞分离方法提高细胞定向分化能力[J].医学研究杂志, 2010, 39(9): 57-62．
[20] Alves da Silva ML,Martins A,Costa-Pinto AR,et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor.J Tissue Eng Regen Med.2010;12:29．
[21] 朱雷,吕丹.不同环境刺激对骨髓间充质干细胞成软骨分化作用的研究进展[J].中国矫形外科杂志, 2010,18(19): 1618-1621．
[22] 杨波,胡蕴玉.胶原/羟基磷灰石骨软骨一体化支架的生物学特性研究[J].中国矫形外科杂志, 2010,18(4):304-307．
[23] 张文元,杨亚冬,房国坚,等.壳聚糖-丝素复合支架材料与骨髓间充质干细胞相容性的研究[J].中国卫生检验杂志, 2010,20(12):3084-3086．
[24] 梅晰凡,袁亚江,吕刚,等.BMP-2诱导肌源性干细胞转化为软骨样细胞的体外实验研究[J].中国医科大学学报, 2009, 38(2):92-95．
[25] 李丽艳,黄金中,杜江,等.转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(1):38-41.
[26] Saris D,Vanlauwe J,Victor J,et al.Characterized chondrocyte implantation results in better structural repair when treatingsymptomatic cartilage defects of the knee in a randomized controlled trial versus microfracture.Am J Sports Med.2008;36(2):235-246.
[27] 谭洪波,杨柳.局部关节软骨和骨软骨损伤修复策略的研究进展[J].中华关节外科杂志:电子版,2010,4(6):795-803．
[28] Adkisson HD,Milliman C,Zhang X,et al.Immune evasion by neocartilage derived chondrocytes: Implications for biologic repair of joint articular cartilage. Stem Cell Res.2010;4(1):57-68.
[29] Tompkins M,Hamann JC,Diduch DR,et al.Preliminary Results of a Novel Single-Stage Cartilage Restoration Technique: Particulated Juvenile Articular Cartilage Allograft for Chondral Defects of the Patella. Arthroscopy. 2013;29(10):1661-1670.
[30] Haleem AM,Singergy AA,Sabry D,et al.The Clinical Use of Human Culture-Expanded Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplanted on Platelet-Rich Fibrin Glue in the Treatment of Articular Cartilage Defects:A Pilot Study and Preliminary Results. Cartilage.2010;1(4):253-261.
[31] Kim K,Lam J,Lu S,et al.Osteochondral tissue regeneration using a bilayered composite hydrogel with modulating dual growth factor release kinetics in a rabbit model. J Control Release.2013;168(2):166-178.
[32] 刘利兵,王成伟,高健,等.微骨折技术与骨软骨移植治疗关节软骨缺损[J].中国组织工程研究, 2013,17(31):5735- 5740.
[33] 孟晔,林治琳,柳硕柱,等.关节镜下自体骨软骨移植治疗股骨软骨损伤：1-4年随访结果[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(31):6055-6058.
[34] 左镇华,杨柳,段小军,等.关节镜下微骨折技术治疗膝关节软骨缺损的近期临床疗效评价[J].重庆医学, 2006, 35(20): 1834-1836.
[35] Toh W,Lee EH,Guo XM,et al.Cartilage repair using hyaluronan hydrogel-encapsulated human embryonic stem cell-derived cells.Iornaterials. 2010;31(27): 6968-6980.
[36] 伏治国,瞿玉兴.关节镜下自体镶嵌式骨软骨移植修复膝关节股骨髁软骨缺损[J].实用医学杂志, 2011,27(22): 4094-4095.
[37] Hangody L,Fules P.Autologous osteochondral mosaicplasty for the treatment of full-thickness defects of weight bearing joints：ten years of experimental and clinical experience.J Bone Joint Surg Am. 2003;85(s2): 25-32.

引言

运动性关节软骨损伤属于发生率较高的骨关节损伤，在运动员中常见，对运动员运动能力、运动时间等影响较大，且患者发病后如果不采取积极有效的方法治疗，将会引起机械性磨损、进行性骨关节病^[1]。相关学者进行了一次试验，试验中对2004年参加雅典奥运会的国家运动员伤病情况进行调查，结果显示268例存在运动性关节软骨损伤，而膝关节、踝关节、肩关节损伤占患病人数的54.5%^[2-3]。由于机体关节血供相对较少，修复能力较差，自我修复难以达到效果。同时，关节损伤修复速度较慢，如果得不到正规治疗，将会引起关节性功能障碍，影响运动员正常训练、比赛，增加了运动员痛苦^[4-5]。

当关节磨损体积超过一定的大小，超过机体的自我修复能力，则需要置入骨修复材料促进其愈合。新鲜的自体骨是最为理想的植入骨，植入骨中含有较多的成骨细胞和骨再生需要的各种生长因子，具有良好的骨传导能力、骨诱导能力及骨生成能力，被视为骨修复材料中的“金标准”。但自体骨组织填充骨缺损时手术操作时间相对较长，自体骨有限，严重者甚至造成供骨区并发症。近年来，随着医疗技术的飞速发展，异体骨在临床上得到应用。以异种骨组织为原料制备煅烧骨也被证实具备良好的骨传导能力，如羟基磷灰石、生物陶瓷等材料。由于大部分骨缺损深浅不一、形状不规则，采用预备的成形填充材料修复存在填充材料与缺损不匹配，难以达到预期的填充效果。新型可塑形同种骨修复材料由成骨基质颗粒、黏性载体组成，能为机体提供一定的力学性能^[6-7]。此外，新型可塑形同种骨修复材料以液态、泥膏状或含有颗粒状材料运用于凝胶剂，置入时切口相对较小，具备良好的组织相容性和骨传导能力。黏性载体则是将松散的成骨基质颗粒黏合在一起，使材料整体具备可塑性，提高材料的整体性能，发挥良好的骨修复作用^[8-9]。理想的黏性载体本身应该具备一定的黏度，具备良好的生物相相容性，如硫酸钙、甘油等^[10-11]。目前临床上对于可塑形材料的基本组成及制备方法尚存在较大争议，且对于其在运动性关节软骨损伤中的修复效果尚缺乏报道^[12]。

实验研究新型可塑形同种骨修复材料的制备方法，探讨新型可塑形同种骨修复材料在运动性关节软骨损伤中的修复效果。

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材料方法

1.1 设计动物对照观察实验。

1.2 时间及地点于2013年10月至2015年10月河北中医学院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：纳入新西兰大白兔40只，体质量1.80-2.51 kg，平均(1.67±0.15) kg，雌雄随机，由解放军第三军医大学西南医院动物实验中心提供，严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为：SYXK(冀)2001-0004号。对新西兰大白兔进行等条件喂养，对新西兰大白兔的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则^[13-14]。将36只新西兰大白兔采用随机对照方法分为对照组和实验组，每组18只。

1.4 实验方法

新型可塑形同种骨修复材料的制备：①脱钙骨基质颗粒的制备：取新鲜猪股骨(市售)，无菌塑料袋包装，将其放置在-30 ℃低温冰箱中冻存2周，去除软组织，将其锯成大小为20 mm×5 mm×5 mm大小骨块，超声条件下纯化，48 h洗涤，每小时换水1次。在40 ℃下pH=10、浓度为1%的脂肪酶溶液种浸泡4 h，利用NaHCO₃利用调节pH值，放置在恒温(40 ℃)振荡器中120 r/min进行振荡，洗涤完后，冷冻干燥，包装，备用。②胶原的制备：取新西兰大白兔4只，颈椎脱臼法处死，无菌条件下取四肢长骨，两层辐照米庆军隔菌塑料袋包装，封口。在无菌条件下去除肌肉、骨膜等软组织，剪成1 cm左右的骨小段。纯化水冲洗后超声清洗48 h，每小时换液1次。碱性条件下脱脂4 h，再次超声清洗24 h，每小时换液1次。真空冷冻干燥剂中冻干，放入高速组织粉碎机中，保证粒径小于1 mm，采用蒸馏水进行3次洗涤，包装、备用。在超净工作台上，于每毫升骨胶原溶液种加入450 mg脱钙骨基质颗粒，无菌玻璃棒混合均匀，捏制成球形，获得新型可塑形同种骨修复材料，见图1^[15-16]。

新西兰大白兔建模及分组处理方法：将36只新西兰大白兔均采用3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾^[17]。将兔膝关节处于最大屈曲状态，充分暴露关节腔，在靠近内侧切开皮肤及关节腔，剪断一侧后交叉韧带。术后采用线缝合关节囊及皮肤，采用碘酒擦拭伤口。止血完成后对缺损部位进行冲洗、清理，对照组采用透明质酸钠凝胶材料进行修复，实验组采用新型可塑形同种骨修复材料进行修复^[18-19]。术后将新西兰大兔送回笼中，自由饮食、活动，且对每只兔从手术起每天肌肉注射80×10⁴ U青霉素钠，1次/d，连续注射 3 d，预防损伤部位发生感染。术后3周，待新西兰大白兔伤口愈合后，采用动物实验跑台模拟运动员受伤后的运动训练，30 min/次，连续运动5次^[20-21]。

1.5 主要观察指标

大体情况：观察两组兔的精神状态、步态、饮食、切口愈合情况，切口是否存在破溃、肿胀、感染等。修复后16周(2组各6只)，沿着原手术切口切开皮肤，对手术关节面进行照相，观察两组兔关节囊情况、修复组织与周围关节组织的差异性^[22-23]。

组织学观察：修复后16，18，20周，大体观察后取标本，在体积分数10%甲醛固定48 h，甲酸脱钙，高分辨率CT下扫描并三维重建，扫描完毕后继续组织学观察标本，进行组织学切片，苏木精-伊红染色，在光学显微镜下进行观察^[24]。

Wakitani评分：修复后16，18，20周，两组各选择6只兔，参照软骨缺损修复Wankin评分标准对两组兔进行评分，得分越高修复效果越好^[25-26]。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较。P < 0.05提示经比较两组数据间存在统计学差异。

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讨论

运动性关节软骨损伤从大的角度来说属于是一个复杂的病理过程^[27-28]。临床上，导致运动性关节软骨损伤发生的原因相对较多：①负荷传导紊乱：运动员在日常训练、比赛中充满了竞争，当运动幅度过大将会导致关节出现不同程度的损伤或撕裂伤，导致软骨细胞丧失保护作用，从而进一步造成运动性关节软骨损伤^[29-30]。②机械磨损撞击：运动员在训练过程中由于技术等完成部位相对固定，关节长期受到磨损及表面受到反复撞击，容易造成运动性关节软骨出现机械性损伤等。常规方法虽然能够改善患者症状，但这些治疗方法均不能达到预期的治疗效果，影响运动员训练和比赛^[31-32]。

近年来，软骨组织工程在运动性关节软骨损伤中得到应用，其原理是从机体内获得少量活体组织，将组织中的细胞分离出来，并在体外进行相应的培养、扩增，然后与可降解吸收的支架根据一定的比例进行混合，并将其植入缺损部位，从而能够在机体内增殖和分泌细胞外基质，最终可形成所需要的组织和器官，达到修复的目的^[33-34]。新型可塑形同种骨修复材料是近年来研究较多的一种新型材料，该材料具备良好的生物相容性且成骨能力较强，具有良好的可塑形能力及在植入部位保持能力，能够得到安全、有效的骨缺损修复效果。新型可塑形同种骨修复材料的骨修复能力与脱钙骨基质在材料中的比例关系密切^[35-36]。通常而言，脱钙骨基质含量较高材料的骨修复能力优于含量较低者^[37]。目前，临床上应用的可塑形同种骨修复材料主要以硫酸钙、甘油、高分子量水凝胶等为黏性载体，该材料在制备过程中使用的所有组分均来自同种骨组织，能够有效提高材料中的脱钙骨基质颗粒含量，保证其含量在90%以上。临床上，运动性关节软骨损伤修复中采用新型可塑形同种骨修复材料进行修复效果理想，该材料生物相容性较好，置入机体后，具备良好的抗离散能力，保证置入机体后不被体液冲走，从而能够发挥其骨缺损修复作用。研究显示：新型可塑形同种骨修复材料在制备过程中脱钙骨基质颗粒与骨胶原根据10∶1比例进行制备时，能够获得理想的可塑形能力，保证其在临床上使用时能够满足任意塑形的要求。

综上所述，新型可塑形同种骨修复材料制备方法相对简单，更容易获得，运用于运动性关节软骨损伤修复中效果理想，能够提高修复效果且排斥反应小，具有较高的临床应用价值。

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