不同频率电针对前交叉韧带损伤兔股四头肌线粒体功能及氧化应激损伤的影响

doi:10.12307/2026.877

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (34): 8914-8920.doi: 10.12307/2026.877

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

不同频率电针对前交叉韧带损伤兔股四头肌线粒体功能及氧化应激损伤的影响

张鹏翼1，黄永原2，3，苏虹2，3，徐照琳3，王晨玺2，李嘉英2，杨雪捷2

1广西壮族自治区第三人民医院(广西江滨医院)物理治疗科，广西壮族自治区南宁市 530001；广西中医药大学，2针灸推拿学院，3研究生院，广西壮族自治区南宁市 530000

收稿日期:2025-09-28 修回日期:2026-02-14 出版日期:2026-12-08 发布日期:2026-04-13
通讯作者: 杨雪捷，博士，副教授，硕士生导师，广西中医药大学针灸推拿学院，广西壮族自治区南宁市 530000
作者简介:张鹏翼，男，1998年生，河北省保定市人，汉族，2024年广西中医药大学毕业，硕士，医师，主要从事中西医结合康复与运动康复物理治疗的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81960895)(针刺改善前交叉韧带损伤后膝关节本体觉功能障碍的脑网络调节机制研究)，项目负责人：杨雪捷

Effects of different frequency electroacupuncture on mitochondrial function and oxidative stress injury in quadriceps femoris muscle of rabbits with anterior cruciate ligament injury

Zhang Pengyi1, Huang Yongyuan2, 3, Su Hong2, 3, Xu Zhaolin3, Wang Chenxi2, Li Jiaying2, Yang Xuejie2

1Department of Physiotherapy, The Third People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region (Guangxi Jiangbin Hospital), Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2School of Acupuncture and Moxibustion and Massage, 3Graduate School, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2025-09-28 Revised:2026-02-14 Online:2026-12-08 Published:2026-04-13
Contact: Yang Xuejie, PhD, Associate professor, Master’s supervisor, School of Acupuncture and Moxibustion and Massage, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhang Pengyi, MS, Physician, Department of Physiotherapy, The Third People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region (Guangxi Jiangbin Hospital), Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81960895 (to YXJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
线粒体转录因子A(TFAM)：是调控线粒体DNA复制和转录的关键因子，直接影响线粒体能量代谢和基因表达，其功能与多种生物学过程密切相关。 ‌
核呼吸因子1(NRF1)：是调控线粒体生物合成及氧化应激的关键转录因子，过表达核呼吸因子1可显著抑制细胞凋亡。

背景：氧化应激是造成前交叉韧带损伤后肌萎缩的潜在因素之一。改善骨骼肌疲劳则有利于本体感觉的恢复，从而加速前交叉韧带损伤后的康复进程，而改善线粒体功能有利于缓解骨骼肌疲劳损伤。
目的：验证不同频率电针通过干预骨骼肌氧化应激损伤及线粒体功能改善兔骨骼肌疲劳，恢复本体觉功能，从而加速前交叉韧带损伤后康复。
方法：24只健康新西兰兔随机分为空白组、模型组、低频电针组、高频电针组4组，每组6只。模型组、低频电针组、高频电针组兔构建膝关节前交叉韧带损伤模型，低频电针组、高频电针组兔造模后7 d于造模侧膝关节血海、梁丘穴进行电针治疗，空白组及模型组兔仅抓取、固定，不进行电针干预，每天治疗1次，连续治疗21 d。干预结束后用ELISA检测股四头肌中的超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶、丙二醛水平；蛋白印迹法检测兔骨骼肌组织中沉默信息调节因子2相关酶1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活物1α、线粒体转录因子A蛋白的表达水平，以及沉默信息调节因子2相关酶1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活物1α、核呼吸因子1和线粒体转录因子A的mRNA表达情况。
结果与结论：前交叉韧带损伤后兔股四头肌超氧化物歧化酶水平上升，琥珀酸脱氢酶水平下降、丙二醛浓度上升；沉默信息调节因子2相关酶1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活物1α、线粒体转录因子A蛋白表达下降；沉默信息调节因子2相关酶1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活物1α、核呼吸因子1和线粒体转录因子A的mRNA表达均显著下调；电针干预后，兔患侧股四头肌中的丙二醛浓度减少，超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶活性上升，沉默信息调节因子2相关酶1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活物1α、线粒体转录因子A蛋白表达上升；沉默信息调节因子2相关酶1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活物1α、核呼吸因子1和线粒体转录因子A等线粒体生物发生相关基因的mRNA表达上升，且低频电针组优于高频电针组。结果说明，电针可通过调高超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶含量，并降低丙二醛含量，减轻前交叉韧带损伤后骨骼肌氧化应激损害；并通过调控沉默信息调节因子2相关酶1/过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活物1α信号通路相关蛋白及线粒体生物发生相关基因的表达改善线粒体功能，加速前交叉韧带损伤后康复。
https://orcid.org/0009-0008-9806-7401(张鹏翼)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 前交叉韧带, 电针, 高频, 低频, 沉默信息调节因子2相关酶1

Abstract: BACKGROUND: Oxidative stress is one of the potential factors contributing to muscle atrophy following anterior cruciate ligament injury. Alleviating skeletal muscle fatigue facilitates proprioceptive recovery, thereby accelerating rehabilitation after anterior cruciate ligament injury. Improving mitochondrial function helps mitigate skeletal muscle fatigue-related damage.
OBJECTIVE: To verify that electroacupuncture at different frequencies alleviates skeletal muscle oxidative stress damage and improves mitochondrial function in rabbits, thereby reducing skeletal muscle fatigue, restoring proprioceptive function, and accelerating rehabilitation following anterior cruciate ligament injury.
METHODS: Twenty-four healthy New Zealand rabbits were randomly divided into blank group, model group, low-frequency electroacupuncture group and high-frequency electroacupuncture group, with six rabbits in each group. The model group, low-frequency electroacupuncture group and high-frequency electroacupuncture group were used to establish the anterior cruciate ligament injury model of the knee joint. The low-frequency electroacupuncture group and high-frequency electroacupuncture group were treated with electroacupuncture at the Xuehai and Liangqiu acupoints on the injured side of the knee joint 7 days after modeling, while the blank and model groups were only grasped and fixed without electroacupuncture intervention. The treatment was continued for 21 days. After the intervention, the contents of superoxide dismutase, succinate dehydrogenase, malondialdehyde in the quadriceps femoris were detected by ELISA; the expression levels of silent information regulator 2-related enzyme 1, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α, and mitochondrial transcription factor A proteins in the skeletal muscle tissue of rabbits and the mRNA expression levels of silent information regulator 2-related enzyme 1, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α, nuclear respiratory factor 1, and mitochondrial transcription factor A were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: After anterior cruciate ligament injury, the expression level of superoxide dismutase in the quadriceps femoris of rabbits increased, the expression level of succinate dehydrogenase decreased, and the expression level of malondialdehyde increased; the expression levels of silent information regulator 2-related enzyme 1, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α, and mitochondrial transcription factor A proteins decreased; the mRNA expression levels of silent information regulator 2-related enzyme 1, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α, nuclear respiratory factor 1, and mitochondrial transcription factor A were significantly down-regulated. After electroacupuncture intervention, the expression of malondialdehyde in the quadriceps femoris on the injured side decreased, the activities of superoxide dismutase and succinate dehydrogenase increased, the expression levels of silent information regulator 2-related enzyme 1, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α, and mitochondrial transcription factor A proteins increased; the mRNA expression levels of silent information regulator 2-related enzyme 1, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α, nuclear respiratory factor 1, and mitochondrial transcription factor A, which are related to mitochondrial biogenesis, increased, and the low-frequency electroacupuncture group was superior to the high-frequency electroacupuncture group. To conclude, electroacupuncture can reduce oxidative stress damage in skeletal muscle after anterior cruciate ligament injury by increasing the levels of superoxide dismutase and succinate dehydrogenase and reducing the content of malondialdehyde; and improve mitochondrial function by regulating the expression of silent information regulator 2-related enzyme 1/peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α signaling pathway-related proteins and regulating the mRNA expression levels of genes related to mitochondrial biogenesis, thereby accelerating the recovery after anterior cruciate ligament injury.

Key words: anterior cruciate ligament, electroacupuncture, high-frequency, low-frequency, silent information regulator 2-related enzyme 1

中图分类号:

张鹏翼, 黄永原, 苏虹, 徐照琳, 王晨玺, 李嘉英, 杨雪捷. 不同频率电针对前交叉韧带损伤兔股四头肌线粒体功能及氧化应激损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(34): 8914-8920.

Zhang Pengyi, Huang Yongyuan, Su Hong, Xu Zhaolin, Wang Chenxi, Li Jiaying, Yang Xuejie. Effects of different frequency electroacupuncture on mitochondrial function and oxidative stress injury in quadriceps femoris muscle of rabbits with anterior cruciate ligament injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(34): 8914-8920.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验选用24只兔分为4组，实验过程均无脱失，全部进入结果分析。
2.2 各组兔干预前后一般情况及行为学变化造模前，各组兔健康状况良好，进食、饮水正常，毛色有光泽，步态正常，反应灵敏，活动度可。造模后1周，模型组、低频电针组、高频电针组兔左侧后肢轻度外翻，收缩减少，爬行时间增长，伴有跛行、拖步，膝关节肿胀，活动度较前明显受限；空白组兔无明显活动受限及步态异常。干预治疗后，低频电针组、高频电针组兔膝关节肿胀、活动度、步态等明显改善；模型组兔膝关节附着肌肉萎缩伴僵硬，多蜷缩于笼子角落，爬行时右后足受力，跛行、拖步加重，活动减少，精神欠佳；空白组兔未见明显异常。
2.3 股四头肌琥珀酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、丙二醛水平与空白组比较，模型组兔股四头肌中超氧化物歧化酶、丙二醛含量上升，琥珀酸脱氢酶活性下降；与模型组比较，电针组兔超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶活性上升，丙二醛含量下降；与高频电针组比较，低频电针组兔超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶活性上升，丙二醛含量进一步下降(P < 0.05)，提示电针能够有效缓解兔股四头肌氧化应激损伤，其中低频电针效果优于高频电针组，见表3，见图2。

2.4 股四头肌SIRT1、PGC-1α、TFAM蛋白表达水平干预后与空白组相比，模型组股四头肌SIRT1、PGC-1α、TFAM蛋白表达水平下降(P < 0.01)；电针组SIRT1、PGC-1α、TFAM蛋白表达水平高于模型组；低频电针组SIRT1、PGC-1α、TFAM蛋白的表达水平高于高频电针组(P < 0.05)，提示电针能够促进线粒体的生物发生从而实现对兔股四头肌肌疲劳的有效干预，其中低频电针优于高频电针组，见表4，见图3。

2.5 股四头肌线粒体生物发生相关基因SIRT1、PGC-1α、TFAM和核呼吸因子1的mRNA表达与空白组相比，模型组兔股四头肌组织中SIRT1、PGC-1α、TFAM和核呼吸因子1等线粒体生物发生相关基因的mRNA水平均显著下调(P < 0.01)；与模型组相比，电针组可以显著上调上述基因的mRNA表达；与高频电针组相比，低频电针组的效果更显著，提示电针能够有效通过调节线粒体生物发生相关mRNA的表达间接干预兔股四头肌肌疲劳，其中低频电针组优于高频电针组。见表5，见图4。

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引言

前交叉韧带起自胫骨髁隆起的前内侧，与外侧半月板的前角附着，斜向后上方外侧，纤维呈扇形附着于股骨外侧髁的内侧[1]，主要参与控制膝关节前向和旋转稳定[2]，抵抗胫骨相对于股骨的前向平移，与后交叉韧带共同平衡胫、股骨前后向移动的张力来发挥稳定膝关节的作用。前交叉韧带损伤中运动性损伤占70%，主要由膝外翻、外旋和过伸造成[3]。前交叉韧带损伤往往合并内侧副韧带、半月板损伤，造成膝关节力学承载失衡，并导致膝关节本体觉感受器破坏，引起双侧膝关节本体感觉下降[4]，进一步影响膝关节稳定性，极大地降低患者的运动功能与生活质量[5-8]。前交叉韧带重建术是恢复膝关节稳定性的临床首选方案，然而，术后本体感受器减少影响位置感知和运动信号传递，导致膝关节不稳、反应迟缓和动态平衡下降，并且术后机械感受器损伤抑制股四头肌激活[9]。因此，本体感觉的恢复是前交叉韧带损伤重建后膝关节功能康复的关键[10]。
骨骼肌是人体进行运动的核心，它的功能状态与运动表现直接关联，而良好的神经肌肉功能是维持运动中关节动态稳定、减少运动损伤的基本保障[11]。有研究者通过等速肌力测试系统诱导伸膝疲劳[12]，当最大伸膝力矩下降至30%时，落地膝关节屈曲角度显著降低，而在屈膝角度较小时，较大的伸膝力矩会导致前交叉韧带所承受张力相对增加，增加断裂的风险[13]。
氧化应激是造成前交叉韧带损伤后肌萎缩的潜在因素之一，可通过增加骨骼肌自噬、钙蛋白酶、泛素-蛋白酶体表达，增强对蛋白质水解的敏感性，进一步导致骨骼肌萎缩。因此，降低骨骼肌氧化应激水平对改善肌萎缩至关重要[14]。既往研究表明，骨骼肌疲劳引起缓激肽、乳酸、前列腺素E2等代谢物质堆积，影响肌纤维收缩和神经传导功能，抑制机械性本体感受器兴奋，造成本体感觉障碍[15-17]。骨骼肌疲劳的改善则有利于本体感觉的恢复，从而加速前交叉韧带损伤后康复进程，而改善线粒体功能有利于缓解骨骼肌疲劳损伤[18]。
针刺可通过沉默信息调节因子2相关酶1(silencing in-formation regulator 2 related enzyme 1，SIRT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活物1α(peroxisome proliferator activated receptorγcoactivator-1α，PGC-1α)及自噬的关键蛋白如PTEN基因诱导的PTEN诱导激酶1(PTEN-induced putative kinase protein 1，PINK1)、泛素连接酶调控线粒体稳态和自噬，并且可能通过SIRT1/PGC-1α/核呼吸因子1、线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)途径促进骨骼肌线粒体生物发生而介导[19-21]；此外，TFAM/核呼吸因子1基因从骨骼肌线粒体相关因子的调节作用及改变线粒体生物合成方面亦与肌疲劳的发生密切相关[22]。
基于上述，此次研究以线粒体功能与氧化应激角度对骨骼肌疲劳的影响为切入点，探讨不同频率电针干预对前交叉韧带损伤兔的骨骼肌氧化应激与线粒体功能及本体觉恢复的影响，验证电针对前交叉韧带损伤后康复的疗效，并对于其造成骨骼肌肌疲劳并导致膝关节本体感觉障碍的可能机制进行探讨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。实验设计示意图见图1。

1.2 时间及地点实验于2023年9-11月在广西中医药大学仙葫校区完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选用3月龄同批次普通级健康新西兰兔24只，雄性，体质量为(2.5±0.5) kg，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0015。
随机选取其中6只作为空白组，剩余18只兔造模成功后进行随机分配，分为模型组、低频电针组和高频电针组，每组6只。所有动物均采用单笼饲养，在普通CV级实验室相同条件[温度(22±2) ℃，相对湿度(50±10)%，明暗时间为12 h/12 h]下适应性饲养1周。
该研究方案是根据赫尔辛基宣言协议和广西中医药大学实验动物中心实验动物护理和使用委员会的指导方针进行的。该研究经广西中医药大学动物伦理与福利委员会批准(伦理审批号：DW20230830-148)。
1.3.2 主要试剂与仪器
主要试剂：BCA 蛋白浓度测定试剂盒(Biosharp，BL521A)；兔丙二醛酶联免疫分析试剂盒(基因美，JYM0026Rb)；琥珀酸脱氢酶活性检测试剂盒(Solarbio，BC0955)；超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(Solarbio，BC0175)；PGC-1α Polyclonal Antibody (bioswamp，PAB37605)；SIRT1 抗体(Affinity，AF4784)；TFAM 抗体(Affinity，AF0531)；2×S6 Universal SYBR qPCR Mix[新贝(上海)生物科技有限公司，Q204-01]；HyperScript III RT SuperMix for qPCR with gDNA Remover[新贝(上海)生物科技有限公司，R202-02]；TriQuick Reagent(Solarbio，R1100)；氯仿替代物(核酸抽提辅助试剂)(赛维尔，G3014-01)；异丙醇(国药集团化学试剂有限公司，80109218)；DEPC水(Biosharp，BL510A)；无水乙醇(天津奥普升化工，20210625)。
主要仪器：酶标分析仪(德铁，HBS-1096A)；低温离心机(Eppendorf 5418R，5810R)；高速低温组织研磨仪(Servicebio，KZ-III-F)；高速低温组织研磨仪(Servicebio，KZ-III-F)；荧光定量 PCR 仪(Roche，LightCycler®96)；多功能酶标仪(TECAN，
INFINITE 200PRO)；电泳仪(Bio-Rad，PowerPac Basic)；凝胶成像系统(上海天能，Tanon 5200)。
1.4 实验方法

1.4.1 模型制备建立兔膝关节前交叉韧带损伤模型[23]：于兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)深度麻醉，将兔固定于手术台上，剔去膝关节区毛发，消毒后铺上无菌单。沿着左髌骨内侧做纵行切口，长2.0-3.0 cm。切开皮肤后仔细分离筋膜、肌肉，充分暴露关节腔。将前交叉韧带实质部完全横断并做2 mm缺损，冲洗关节腔后逐层缝合，关闭切口，加压包扎。手术后单笼饲养，予术侧股四头肌注射青霉素钠(4万U/kg)以防感染，每日1次，连续1周。韧带损伤模型由同一位外科医生完成，以保证各组实验组动物造模的规范化和一致性。

1.4.2 干预方法造模成功后1周开始治疗。选取兔患侧血海及梁丘穴，腧穴定位参照《实验针灸学》中兔常用针灸穴位定位标准[24]，并结合比较解剖学组织定位为依据。针刺时取俯卧位将兔头部及四肢固定在解剖台上，穴位皮肤以碘伏常规消毒后，选用华佗牌28号1寸一次性无菌针灸针直刺进针，针刺深度为5-8 mm。
低频电针组：进针后，在针柄处连接 G-6805型电针治疗仪，设定为连续波、频率2 Hz，留针20 min。每天治疗1次，连续治疗21 d。
高频电针组：针刺操作同上述，进针后于针柄处连接G-6805型电针治疗仪，连续波、频率为100 Hz，留针20 min。每天治疗1次，连续治疗21 d。
空白组、模型组：与其他组兔同时抓取、固定，但不进行电针干预。
1.4.3 组织取材干预结束后，耳缘静脉注射过量3%戊巴比妥钠处死全部兔。快速暴露，并取出左侧后腿股四头肌，用0.9%氯化钠溶液洗涤后置入5 mL冻存管，放入-80 ℃冰箱中保存，用于ELISA和Western blot、qPCR检测。
1.4.4 一般情况观察观察每组6只兔的精神状态、身体毛发及膝关节肿胀、膝关节活动度、步态等情况变化。
1.4.5 苏木精-伊红染色将股四头肌用40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精染色10 min，经梯度乙醇脱水、盐酸乙醇分化、伊红染色，封固后在光学显微镜下观察股四头肌组织形态，拍片保存。
1.4.6 ELISA检测取兔冻存股四头肌组织，切割标本后称质量，加入一定量的 PBS(pH 7.4)，用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8 ℃的温度，加入一定量的 PBS(pH 7.4)，用匀浆器将标本匀浆充分。离心20 min左右(2 000-3 000 r/min)，
仔细收集上清，常规制备组织匀浆取上清液，根据ELISA试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪(波长为450 nm)读取吸光度值，绘制标准曲线并计算检测超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量及琥珀酸脱氢酶活性变化，评价股四头肌组织的氧化应激状态。
1.4.7 Western blot检测称取50 mg股四头肌组织剪碎，加入RIPA裂解液后混匀，4 ℃冰箱过夜裂解，离心后收取上清液测定蛋白浓度。制备SDS-PAGE凝胶，加入相应体积的总蛋白样品与4×蛋白质上样缓冲液，95 ℃变性10 min，电泳后转膜至PVDF膜，室温封闭2 h；用PBS稀释一抗(SIRT1抗体、PGC-1α抗体、TFAM抗体，GAPDH抗体，稀释比例为1∶1 300)，将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4 ℃反应过夜。PBST洗膜3次，每次10 min。PBST稀释二抗(稀释比例1∶3 000)，将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中，作用90 min，PBST洗膜3次，曝光及洗片，将胶片扫描后，用Image J软件测定SIRT1/PGC-1α信号通路相关蛋白SIRT1、PGC-1α、TFAM的条带灰度值。
1.4.8 荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测
(1)组织总RNA的提取：方法采用Solarbio公司TriQuick Reagent总RNA提取试剂进行，操作如下：剪取约20 mg的组织样本，PBS清洗1次，放入2 mL EP管剪碎，加入1 mL TriQuick Reagent，加入2颗3 mm无RNA酶的小钢珠，用高速低温组织研磨仪低温研磨充分；加入0.1 mL氯仿替代物，振荡15 s，室温静置2 min；离心：4 ℃，12 000×g/min，15 min，取0.5 mL上清放入新的1.5 mL EP管；往上清中加入0.5 mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10 min；重复多次离心操作；加入0.05 mL DEPC水溶解沉淀。
(2)RNA定量：取1 μL RNA样本，用多功能酶标仪进行RNA浓度测定并直接测定A260/280，A260/280代表RNA的纯度(1.8-2.0)。RNA定量工作完成后进行反转录合成cDNA：以组织总RNA为模板，反转录cDNA，然后进行qPCR反应，引物设计见表1；配制好反应体系(单样本单基因)，反应体系配比用量见表2，最后加入DNA模板。

扩增条件：①预变性95 ℃，30 s；②PCR循环(40循环)：变性95 ℃，10 s；退火和延伸：60 ℃，30 s；③熔解曲线：仪器默认采集程序；结束后记录每个样本所对应基因的Ct值，计

算每个样本的线粒体生物发生信号分子SIRT1、PGC-1α、核呼吸因子1、TFAM的mRNA相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①兔干预前后一般情况及行为学变化；②股四头肌中的超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶、丙二醛水平；③骨骼肌组织中SIRT1、PGC-1α、TFAM的蛋白和mRNA表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示，符合方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经过广西中医药大学生物统计学专家及伦理委员会审核。

讨论

此研究旨在探究不同频率电针对前交叉韧带损伤兔股四头肌线粒体功能及氧化应激的影响，以明确电针干预机制。
活性氧的主动清除是骨骼肌纤维内在网络内源性抗氧化的主要防御机制，有助于达到并保持细胞最佳氧化还原平衡[25]。在生理状态下，少量的活性氧能够维持细胞间信号转录、转导与程序性细胞死亡信号传递的作用[26]，骨骼肌损伤后，肌纤维生成自由基及活性氧速率大于内源性系统缓冲能力，导致活性氧大量累积进而和机体细胞膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链等大分子物质发生脂质过氧化反应[27]，从而产生脂质过氧化产物丙二醛。
丙二醛能够改变细胞膜的通透性和流动性，加快钙离子内流，使细胞膜脆性增加的方式损害蛋白质及细胞的结构功能[28]。因此，测定脂质过氧化的产物丙二醛可以反映机体脂质过氧化水平。超氧化物歧化酶能够反映机体对自由基与活性氧的清除能力，通过催化超氧阴离子自由基(O2-)歧化为H2O2和O2。琥珀酸脱氢酶是位于线粒体内膜的结合酶，为有氧呼吸提供电子，琥珀酸脱氢酶活性与组织的氧利用能力呈正相关，是线粒体氧化代谢功能的重要指标之一[19]。既往研究表明，针刺可以通过增加超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶活性，降低丙二醛浓度，从而抑制SD大鼠氧化应激和骨骼肌细胞凋亡来实现干预超负荷运动致骨骼肌损伤[29-30]，与此次研究结果表现出一致性。
骨骼肌可通过线粒体生物发生调节线粒体数量和功能，进而适应组织能量代谢的变化[31]，线粒体转录因子A为线粒体DNA的上游调节基因[32]，与DNA相结合形成类核复合体结构，从而保护线粒体DNA免受活性氧簇的损伤。线粒体转录因子A基因的启动子上具有多种调节因子的识别位点，与DNA结合后可增高其mRNA的表达，加快线粒体转录因子A蛋白质合成，从而增加线粒体进行生物合成[33]。SIRT1和PGC-1α是参与骨骼肌细胞氧化应激过程的重要基因[34]。SIRT1参与细胞的生长、分化、凋亡等多个过程，可通过去酰化PGC-1α增加活性氧表达[35]。PGC-1α是糖脂和能量代谢、线粒体生物合成过程中广泛存在的转录因子[36]，PGC-1α与下游基因核呼吸因子1结合可调节线粒体自噬过程[37]。
既往研究证实调控大鼠PGC-1α/线粒体转录因子A通路激活，能够导致线粒体和蛋白质的合成，促进线粒体的生物发生从而有效干预骨骼肌肌疲劳[38]。此次研究在参考既往基于SIRT1/PGC-1α/TFAM通路机制干预调节线粒体功能及线粒体产生研究的基础上，以不同频率电针为干预方法，阐释电针通过上述通路机制调节线粒体功能及抗氧化应激的作用机制，符合此次研究的预期结果。
回顾此次研究，前交叉韧带损伤后兔股四头肌超氧化物歧化酶、丙二醛含量上升，提示损伤后股四头肌大量活性氧累积产生丙二醛，超氧化物歧化酶作为清除活性氧的歧化酶能够反映损伤后机体对组织过氧化损伤的内平衡调节状态，琥珀酸脱氢酶水平下降则提示线粒体氧化代谢功能受到影响。SIRT1作为上游基因表达水平下降影响PGC-1α表达水平，TFAM蛋白表达水平下降，从而对线粒体生物合成造成影响。结合SIRT1、PGC-1α、核呼吸因子1和TFAM等线粒体生物发生相关基因的mRNA水平均显著下调，表明线粒体的生物发生受到抑制。结合行为学观测：兔左侧后肢轻度外翻，收缩减少，爬行时间增长，伴有跛行、拖步，膝关节肿胀，活动度明显受限，提示前交叉韧带损伤后兔出现明显的股四头肌氧化应激损伤及线粒体功能障碍。
电针干预后患侧股四头肌中的丙二醛含量减少，超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶活性上升，表明受损组织活性氧清除防御机制得到恢复，组织的氧利用能力增加。SIRT1、PGC-1α、TFAM蛋白表达水平上升，SIRT1、PGC-1α、核呼吸因子1和TFAM等线粒体生物发生相关基因的mRNA表达水平上升，表明受损组织内线粒体生物发生调节线粒体数量和功能得到改善，且从结果指标评价疗效来看，低频电针组优于高频电针组。
针刺具有调和气血、疏通经络的功效，在多项前交叉韧带术后康复的相关研究中已得到明确证实，电针疗法是将传统中医针刺疗法与现代电学相结合的一种新型疗法[39-40]，因其刺激量可调节，故而在具体操作时可以比普通针刺刺激强、可量化、作用更持久，是临床治疗膝关节疾病的常用疗法[41]。回顾目前针刺干预前交叉韧带重建术后康复相关的研究中，以电针刺激频率作为变量进行干预的研究仍存在较大的空白，因此课题组研究通过结合电针低频、高频变量干预旨在为电针干预前交叉韧带重建术后康复提供更多的理论支撑。
从理论方面探讨低频电针组结果优于高频电针组的原因，根据针灸学电针理论[42]，连续波型中低于30 Hz为疏波，其中10 Hz以下为常用的疏波频率。疏波具有较强的刺激作用，能够引起肌肉收缩，产生较强的震颤感，从而提高肌肉韧带的张力，并促进神经肌肉功能的恢复，符合此次研究结果预期；高于30 Hz的连续波形称为密波，具有降低神经应激功能、抑制脊髓兴奋性等作用；现有多项临床研究可证实，电针能够减轻膝关节炎症浸润，缓解疼痛和肿胀[43]。电针可促进受损神经修复再生，调节神经肌肉功能，改善膝关节功能[44-45]。中医理论将其归于痿证的范畴，主要病机为筋脉受损，气血运行受阻。此次研究取穴血海、梁丘位于膝关节周围，以近治之法而言，具有通利关节之功，血海梁秋两血分属脾、胃两经，脾胃为中医理论中气血生化之源，可补养气血以濡养筋骨。此外，《素问·痿论篇》中提出“治痿独取阳明”的观点：阳明经气血充沛，濡养筋脉，则筋脉柔软，关节滑利[46]。疏波在电针补泻理论中属于补法，密波属于泻法，亦可为低频电针优于高频电针的结果提供充分的理论依据。
回顾课题组内其他已有研究基础，不同频率下电针干预可延缓前交叉韧带损伤兔股四头肌萎缩程度[47]，其机制与减少股四头肌氧化代谢产物和内质网应激相关蛋白PERK、ATF6、IRE1表达、抑制肌萎缩因子MuRF1、MAFbx表达，延缓股四头肌蛋白降解有关；并且电针对于前交叉韧带损伤后兔具有良好的镇痛效应[48]，通过下调突触素、突触后致密物95等突触相关蛋白表达，调节脊髓突触可塑性，从而缓解脊髓节段中枢敏化，减少疼痛递质及兴奋性神经递质表达，上调抑制性神经递质表达。且两项研究结果均提示低频电针效果优于高频电针，与此次研究结果具有一致性。
既往研究证实，低频疏波电针在神经肌肉电生理层面能够改善复合肌肉动作电位波幅、增大感觉神经动作电位波幅，感觉神经传导速度均明显增快，复合肌肉动作电位潜伏期明显缩短，促进神经功能的恢复，增强神经冲动的传导效率[49]。通过促进神经再生，提高肌力，恢复感觉功能，从而为损伤组织修复提供有利条件。然而目前研究大多围绕电针与非电针临床干预对比，不同频率电针干预下神经肌肉电生理对照研究仍然存在进一步深入研究的价值，或许也将是未来课题的进一步延伸方向之一。
回顾此次研究，证实了低频电针干预前交叉韧带损伤后兔股四头肌氧化应激损伤及线粒体功能优于高频电针组的基础，认为前交叉韧带损伤后氧化应激损伤及线粒体功能障碍可能是造成兔骨骼肌疲劳的原因之一，为低频疏波电针治疗中医痿证补充了基础研究理论依据。
此次研究在前期低频电针降低兔股四头肌活性氧变化的基础上进一步补充了超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶、丙二醛等氧化应激指标作为完善[47]，并阐述了氧化应激的相关联机制；干预方式上，课题组在基于前期临床观察的选穴基础上增加了不同频率电针作为此次基础研究的干预手段[7]。同时此次研究存在以下不足：一方面，通过探究琥珀酸脱氢酶、膜蛋白表达情况证实线粒体改善，同时因技术条件等限制，缺少验证线粒体膜电位、ATP生成率或超微结构电镜观察等指标作为直观数据体现；另一方面，在前期基础上进行进一步研究，实验共使用24只兔样本存在样本量较小的问题，可能对结果稳定性造成一定影响，未来或许可在扩大样本验证的基础上进一步完善线粒体膜电位等直接功能指标。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

不同频率电针对前交叉韧带损伤兔股四头肌线粒体功能及氧化应激损伤的影响

Effects of different frequency electroacupuncture on mitochondrial function and oxidative stress injury in quadriceps femoris muscle of rabbits with anterior cruciate ligament injury

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