海藻酸钠-羟基磷灰石-氧化石墨烯水凝胶的制备及细胞相容性

doi:10.12307/2026.420

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (32): 8420-8426.doi: 10.12307/2026.420

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海藻酸钠-羟基磷灰石-氧化石墨烯水凝胶的制备及细胞相容性

李轩泽1，2，方汉洪3，徐哲4

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院，1急诊创伤外科，2分子诊断湖北省重点实验室，湖北省武汉市 430014；3华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，湖北省武汉市 430022；4贵航贵阳医院骨科，贵州省贵阳市 550009

接受日期:2025-12-30 出版日期:2026-11-18 发布日期:2026-04-27
通讯作者: 徐哲，硕士，主治医师，贵航贵阳医院骨科，贵州省贵阳市 550009
作者简介:李轩泽，男，1994年生，湖北省咸宁市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事骨组织工程、生物材料方面的研究。
基金资助:
贵州省科技厅计划项目(黔科合基础-ZK[2023]一般532)，项目负责人：徐哲；贵阳市科技计划项目(筑科合同[2024]2-33号)，项目负责人：徐哲；通用医疗科学技术基金(TYYLKYJJ-2023-036)，项目负责人：徐哲

Preparation and cytocompatibility of sodium alginate-hydroxyapatite-graphene oxide hydrogels

Li Xuanze1, 2, Fang Hanhong3, Xu Zhe4

1Department of Emergency and Trauma Surgery, 2Key Laboratory for Molecular Diagnosis of Hubei Province, Central Hospital of Wuhan, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430014, Hubei Province, China; 3Department of Orthopedics, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China; 4Department of Orthopedics, Guihang Guiyang Hospital, Guiyang 550009, Guizhou Province, China

Accepted:2025-12-30 Online:2026-11-18 Published:2026-04-27
Contact: Xu Zhe, MS, Attending physician, Department of Orthopedics, Guihang Guiyang Hospital, Guiyang 550009, Guizhou Province, China
About author:Li Xuanze, MS, Attending physician, Department of Emergency and Trauma Surgery, and Key Laboratory for Molecular Diagnosis of Hubei Province, Central Hospital of Wuhan, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430014, Hubei Province, China
Supported by:
Guizhou Provincial Department of Science and Technology Plan Project, No. ZK[2023]532 (to XZ); Guiyang Municipal Science and Technology Plan Project, No. [2024]2-33 (to XZ); General Medical Science and Technology Fund, No. TYYLKYJJ-2023-036 (to XZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生物材料：指用于与生物系统接触或相互作用，以诊断、治疗、修复或替换身体组织/器官或增进其功能的天然或人造材料。理想的生物材料需要在生物相容性这一根本前提下，根据具体应用领域平衡和优化其物理力学性能、化学稳定性/降解性、生物功能性/活性，同时满足灭菌要求并具备良好的可加工性。
复合水凝胶：是一种通过将2种或多种不同成分(通常包括聚合物网络与其他功能性材料)结合而制成的高级水凝胶。复合水凝胶的核心目标是克服传统单一组分水凝胶的局限性(如机械强度弱、功能单一、稳定性差等)，赋予材料新的、优异的或协同增强的性能。

背景：氧化石墨烯复合水凝胶表现出多种优异性能，如力学性能、生物相容性、可控的降解性等，因此，氧化石墨烯复合水凝胶具有极大的研究和应用价值。
目的：分析海藻酸钠-羟基磷灰石-氧化石墨烯水凝胶的理化性能与细胞相容性。
方法：分别制备海藻酸钠-羟基磷灰石、海藻酸钠-羟基磷灰石-8 g/L氧化石墨烯、海藻酸钠-羟基磷灰石-10 g/L氧化石墨烯、海藻酸钠-羟基磷灰石-12 g/L氧化石墨烯溶液，检测4组溶液的黏度；将4组溶液分别置入CaCl2溶液中交联，得到的水凝胶分别记为SA-HA、SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO。表征4组水凝胶的压缩弹性模量、压缩应力、体外降解率、平衡溶胀比与微观形貌。将4组水凝胶分别与大鼠骨髓间充质干细胞共培养，CCK-8检测细胞增殖，Live/Dead荧光染色观察细胞活性，扫描电镜观察细胞黏附。
结果与结论：①加入氧化石墨烯显著提高了水凝胶溶液的黏度，其中SA-HA-10 g/L GO组溶液的黏度值最佳，可满足水凝胶塑形效果。随着氧化石墨烯的加入以及质量浓度的增加，水凝胶的压缩弹性模量与压缩应力升高，体外降解率降低，孔隙率呈先升高后降低的变化，其中SA-HA-10 g/L GO组孔隙率最高；氧化石墨烯的加入降低了水凝胶的平衡溶胀比。扫描电镜显示4组水凝胶内部存在孔隙结构，随着氧化石墨烯的加入以及质量浓度的增加，水凝胶的孔径减小。②扫描电镜显示，SA-HA组材料表面细胞黏附最少，SA-HA-10 g/L GO组材料表面细胞黏附最多。CCK-8检测显示，培养3，5，7 d，SA-HA-8 g/L GO组、SA-HA-10 g/L GO组、SA-HA-12 g/L GO组细胞吸光度值高于SA-HA组(P < 0.05)。Live/Dead荧光染色显示，SA-HA-8 g/L GO组、SA-HA-10 g/L GO组、SA-HA-12 g/L GO组细胞存活率高于SA-HA组(P < 0.05)，SA-HA-10 g/L
GO组细胞存活率高于SA-HA-8 g/L GO组、SA-HA-12 g/L GO组(P < 0.05)。③结果表明，SA-HA-10 g/L GO水凝胶具有更出色的细胞相容性、适宜的降解速率和足够的机械性能。
https://orcid.org/0000-0002-4493-4046 (李轩泽)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 氧化石墨烯, 羟基磷灰石, 藻酸盐, 复合水凝胶, 组织工程支架, 骨组织工程

Abstract: BACKGROUND: Graphene oxide composite hydrogels exhibit various excellent properties, such as mechanical properties, biocompatibility, and controllable degradation, making them of great research and application value.
OBJECTIVE:To analyze the physicochemical properties and cytocompatibility of sodium alginate-hydroxyapatite-graphene oxide hydrogels.
METHODS: Sodium alginate-hydroxyapatite, sodium alginate-hydroxyapatite-8 g/L graphene oxide, sodium alginate-hydroxyapatite-10 g/L graphene oxide, and sodium alginate-hydroxyapatite-12 g/L graphene oxide solutions were prepared. The viscosity of the four groups of solutions was measured. The four groups of solutions were cross-linked in CaCl2 solution to obtain hydrogels, which were denoted as SA-HA, SA-HA-8 g/L GO, SA-HA-10 g/L GO, and SA-HA-12 g/L GO, respectively. The compressive elastic modulus, compressive stress, in vitro degradation rate, equilibrium swelling ratio, and microstructure of the four groups of hydrogels were characterized. The four groups of hydrogels were co-cultured with rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. Cell viability was observed by Live/Dead fluorescence staining. Cell adhesion was observed by scanning electron microscopy.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The addition of graphene oxide significantly increased the viscosity of the hydrogel solution, with the SA-HA-10 g/L GO group showing the best viscosity, which met the requirements for hydrogel shaping. With the addition of graphene oxide and the increase in its concentration, the compressive elastic modulus and compressive stress of the hydrogels increased, the in vitro degradation rate decreased, and the porosity initially increased and then decreased, with the SA-HA-10 g/L GO group having the highest porosity. The addition of graphene oxide reduced the equilibrium swelling ratio of the hydrogels. Scanning electron microscopy showed that all four groups of hydrogels had porous structures, and the pore size decreased with the addition of graphene oxide and the increase in its concentration. (2) Scanning electron microscopy showed that the SA-HA group material had the least cell adhesion on its surface, while the SA-HA-10 g/L GO group material had the most cell adhesion. CCK-8 assay showed that after 3, 5, and 7 days of culture, the cell absorbance values of the SA-HA-8 g/L GO group, SA-HA-10 g/L GO group, and SA-HA-12 g/L GO group were higher than that of the SA-HA group (P < 0.05). Live/Dead fluorescence staining showed that the cell viability of the SA-HA-8 g/L GO group, SA-HA-10 g/L GO group, and SA-HA-12 g/L GO group was higher than that of the SA-HA group (P < 0.05), and the cell viability of the SA-HA-10 g/L GO group was higher than that of the SA-HA-8 g/L GO group and SA-HA-12 g/L GO group (P < 0.05). (3) The results exhibit that the SA-HA-10 g/L GO hydrogel has superior cytocompatibility, a suitable degradation rate, and sufficient mechanical properties.

Key words: biomaterials, graphene oxide, hydroxyapatite, alginate, composite hydrogel, tissue engineering scaffold, bone tissue engineering

中图分类号:

李轩泽, 方汉洪, 徐哲. 海藻酸钠-羟基磷灰石-氧化石墨烯水凝胶的制备及细胞相容性[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(32): 8420-8426.

Li Xuanze, Fang Hanhong, Xu Zhe. Preparation and cytocompatibility of sodium alginate-hydroxyapatite-graphene oxide hydrogels[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(32): 8420-8426.

图/表（结果） 8

2.1 水凝胶溶液的黏度测试结果 SA-HA、SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO溶液的黏度分别为(31.4±2.3)，(76.5±2.1)，(78.0±2.3)，(81.7±2.9) Pa·s。结果显示，氧化石墨烯的加入提高了水凝胶溶液的黏度(P < 0.01)，并且SA-HA-12 g/L
GO水凝胶溶液的黏度大于SA-HA-8 g/L GO水凝胶溶液(P < 0.05)，见图2。
随着氧化石墨烯质量浓度的增加，水凝胶溶液的黏度增加缓慢，考虑氧化石墨烯达到一定浓度后出现团聚体，导致体系中活性点数目达到饱和，黏度不再大幅度增加。溶液黏度达到满足水凝胶塑形的黏度即为最佳，过高的黏度会导致水凝胶固化过快，从而达不到塑形要求。此次研究结果显示，SA-HA-10 g/L GO水凝胶溶液的黏度值可满足水凝胶塑形效果。

2.2 水凝胶的力学性能检测结果 SA-HA、SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO水凝胶的压缩应力分别为(64.1±4.0)，(135.4±5.2)，(165.5±5.1)，(174.2±9.3) kPa，弹性模量分别为(80.3±7.4)，(123.7±10.5)，(149.4±11.1)，(158.3±6.9) kPa。SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO水凝胶的压缩应力与压缩弹性模量均高于SA-HA组(P < 0.01)，SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO水凝胶的压缩应力与压缩弹性模量高于SA-HA-8 g/L GO水凝胶(P < 0.01)，SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO水凝胶的压缩应力与压缩弹性模量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。氧化石墨烯表面存在大量含氧基团，可通过氢键与聚合物形成物理交联网络，能够有效耗散应力，避免纯化学网络的应力集中，有效提高水凝胶的力学性能。

2.3 水凝胶的体外降解率检测结果 SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO水凝胶的降解率低于SA-HA水凝胶，SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO水凝胶的降解率低于SA-HA-8 g/L GO水凝胶，其中SA-HA水凝胶28 d的降解率达到32.96%，
SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO水凝胶28 d的降解率在26.96%-28.83%之间，见图4。该结果的可能原因为：氧化石墨烯的加入使水凝胶的结构显著改变，氧化石墨烯与海藻酸钠形成不同的分子间作用力(氢键、极性基团等)，从而有效抵抗了溶菌酶向材料基体内部的扩散，降低酶解速率。

2.4 水凝胶的平衡溶胀比检测结果 4组水凝胶在PBS中0.5 h内溶胀动力学迅速增加，并以较慢的速度递增，直至24 h趋于平衡，见图5。SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO水凝胶较SA-HA水凝胶的溶胀比明显降低，SA-HA水凝胶的平衡溶胀比在638.3%-654.4%之间，氧化石墨烯的掺入通过含氧基团之间的氢键降低了水凝胶的溶胀能力，SA-HA-8 g/L GO水凝胶的溶胀比在370.2%-387.1%之间，SA-HA-10 g/L GO和SA-HA-12 g/L GO水凝胶的溶胀比分别在334.8%-362.4%与324.3%-358.6%之间，说明氧化石墨烯的添加降低了水凝胶的溶胀比，使水凝胶的性能更稳定。

2.5 水凝胶的微观形貌检测结果扫描电镜显示4组水凝胶内部存在孔隙结构，SA-HA、SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-10 g/L GO、
SA-HA-12 g/L GO水凝胶的孔径分别为(327.11±42.54)，(189.54±23.76)，(165.37±19.85)，(132.97±14.12) μm，见图6。SA-HA、SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO水凝胶的孔隙率分别为(36.10±3.99)%，(54.62±5.00)%，(77.08±3.00)%，(70.93±4.87)%，SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO水凝胶的孔隙率大于SA-HA水凝胶(P < 0.01)，SA-HA-10 g/L GO水凝胶的孔隙率大于SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO水凝胶(P < 0.01，P < 0.05)，见图6。
有研究表明，支架孔隙率大于50%利于骨组织生长[29]。100-200 μm的支架孔径大小最适合成骨细胞黏附[30-32]。因此，氧化石墨烯添加组水凝胶的孔径大小更适合细胞黏附、增殖。结合孔隙率及孔径大小来看，SA-HA-10 g/L GO水凝胶更适合细胞黏附、增殖。

2.6 水凝胶的细胞相容性检测结果
2.6.1 水凝胶表面的细胞黏附扫描电镜下可见，SA-HA-10 g/L GO组水凝胶表面大量细胞分布均匀，成片出现；SA-HA-8 g/L GO组和SA-HA-12 g/L GO组水凝胶表面可见细胞黏附，但分布不均，有单个细胞，也有成团出现；SA-HA组水凝胶表面细胞黏附最少，仅能见少量细胞成团分布，见图7。结果显示，添加氧化石墨烯导致水凝胶内部孔隙增加，为细胞生长提供了有利的生长微环境，能促进细胞黏附、生长、增殖。氧化石墨烯复合水凝胶的结构与细胞外基质有一定的相似性，并且具备良好的细胞相容性和细胞相互作用能力。

2.6.2 水凝胶表面的细胞增殖 CCK-8检测显示，培养1 d，4组细胞吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养3，5，7 d，SA-HA-8 g/L GO组、SA-HA-10 g/L GO组、SA-HA-12 g/L GO组细胞吸光度值高于SA-HA组(P < 0.01)，见图8。结果表明，氧化石墨烯的添加促进了水凝胶表面的细胞增殖。
2.6.3 水凝胶表面的细胞活性 Live/Dead染色显示，SA-HA-8 g/L GO组、SA-HA-10 g/L GO组、SA-HA-12 g/L GO组可见大量活细胞、少量死细胞，SA-HA组少量死细胞与活细胞，见图9。定量分析显示，SA-HA组、SA-HA-8 g/L GO组、SA-HA-10 g/L GO组、SA-HA-12 g/L GO组细胞存活率分别为(41.10±3.50)%，(62.88±3.89)%，(87.40±3.37)%，(78.27±3.13)%，SA-HA-8 g/L GO组、SA-HA-10 g/L
GO组、SA-HA-12 g/L GO组细胞存活率高于SA-HA组(P < 0.01)，SA-HA-10 g/L GO组细胞存活率高于SA-HA-8 g/L GO组、SA-HA-12 g/L GO组(P < 0.01)，见图9。结果表明，氧化石墨烯的添加促进了水凝胶表面细胞的生长与存活，为细胞生长创造了更佳的环境。

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引言

组织工程是一个快速发展的领域，骨组织再生需要具有一定机械强度、可生物降解的支架，以支撑细胞的附着、分化和生长[1-2]。在骨组织工程中，支架充当天然细胞外基质的临时模板，直到成骨细胞产生骨基质。骨组织工程有多种不同材料的支架，如陶瓷、水凝胶和可生物降解的聚合物等。水凝胶支架具备优良的生物相容性、柔韧性和亲水性，为细胞的附着、生长和分化提供了较好的微环境[3-5]。
海藻酸钠是由古洛糖醛酸和甘露糖醛酸糖单元组成的长链多糖，经常用作生物医学植入物材料，是组织工程领域研究较早的水凝胶材料。在室温下，将二价阳离子如Ca2+加入到海藻酸钠水溶液中可形成稳定的水凝胶，但由于机械性能不足及有限的细胞相互作用，单纯海藻酸钠在组织工程的应用受到限制[6-7]。
羟基磷灰石是天然骨中矿化基质的重要成分，除了具有可再吸收性和生物相容性外，还具有良好的骨结合、骨再生和骨传导性[8-9]。理想的骨组织工程支架除了生物相容性和生物降解等要求外，还应具有适当的机械性能。羟基磷灰石的脆性大、韧性差、不易加工性限制了其应用范围，而海藻酸钠-羟基磷灰石复合水凝胶仍存在力学强度欠佳、塑形较差等问题[10]。
氧化石墨烯是化学制备石墨烯的前体，表面含有丰富的官能团，包括环氧基、羧基和羟基，这有助于氧化石墨烯颗粒分散在溶剂中并作为聚合物之间和聚合物-生物分子键的交联剂[11]，因此，氧化石墨烯复合水凝胶材料成为水凝胶设计的一个新方向。氧化石墨烯复合水凝胶表现出多种优异性能，如力学性能、生物相容性、可控的降解性等，因此，氧化石墨烯复合水凝胶具有极大的研究和应用价值。有研究表明，覆盖单层氧化石墨烯的钛具有促进细胞增殖效果[12]，氧化石墨烯可提升高分子聚乙烯材料的机械强度[13-14]。为了进一步探索氧化石墨烯在生物医学及组织工程领域的应用潜力，此次研究将氧化石墨烯与海藻酸钠-羟基磷灰石水凝胶材料复合，并调整氧化石墨烯的质量浓度，筛选最佳质量浓度的氧化石墨烯复合水凝胶，希望为组织工程水凝胶生物材料提供新的理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计水凝胶的制备与表征实验。实验方案设计见图1。

1.2 时间及地点实验于2023年6月至2025年4月在华中科技大学同济医学院和贵州医科大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 4周龄SD大鼠5只，雌雄不拘，体质量80-120 g，由贵州医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK (湘)2024-0021。实验方案得到贵航贵阳医院伦理委员会批准，伦理批号：GHGYYY-KXXM-2024-28。
1.3.2 主要试剂及仪器海藻酸钠、CCK-8试剂(Sigma-Aldrich)；羟基磷灰石(纯度99.9%，平均粒径10 μm，比表面积10 m2/g，北京德科岛金)；氧化石墨烯(纯度99.9%，平均粒径小于10 μm，氧含量46%-49%，中科院山西煤炭化学研究所)；DMEM培养基(Sigma Aldrich，Co.)；Live/Dead染色试剂盒(Bestbio，上海贝博)；激光共聚焦显微镜LSM5 Excitor(Carl Zeiss)；扫描电镜(Hitachi，日本)；多功能酶标仪(SpectraMax M5，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)；动态机械分析仪(DMA 100，Matervib)；
真空冷冻干燥机(SGZ-1000，江苏宇通)；数字黏度测试仪(NDJ-8S，上海精密仪器仪表有限公司)；超声破碎仪(DH-250，宁波尤维斯)。
1.4 实验方法
1.4.1 水凝胶溶液的制备及黏度测试以超纯水为溶剂，分别配置海藻酸钠-羟基磷灰石、海藻酸钠-羟基磷灰石-8 g/L氧化石墨烯、海藻酸钠-羟基磷灰石-10 g/L氧化石墨烯、海藻酸钠-羟基磷灰石-12 g/L氧化石墨烯溶液，体积40 mL，其中海藻酸钠的质量浓度为20 g/L、羟基磷灰石的质量浓度为50 g/L，氧化石墨烯的质量浓度分别为8，10，12 g/L。有研究表明，20 g/L海藻酸钠[15-16]、50 g/L羟基磷灰石为构建骨组织工程支架的最佳质量浓度[17-18]。采用超声破碎仪使溶液均匀分散，保持室温24 ℃环境，置于数字黏度测试仪中，选取1号转子，保持转速30 r/min，分别测得4种水凝胶溶液的黏度值。
1.4.2 水凝胶的制备将海藻酸钠-羟基磷灰石、海藻酸钠-羟基磷灰石-8 g/L氧化石墨烯、海藻酸钠-羟基磷灰石-10 g/L氧化石墨烯、海藻酸钠-羟基磷灰石-12 g/L氧化石墨烯溶液分别置入50 mL 5%CaCl2溶液中交联20 min，得到的水凝胶分别记为SA-HA、SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO。
1.4.3 水凝胶的力学性能测试将上述4组水凝胶压缩至其原始厚度的60%，压缩应变速率为0.01 mm/s，通过MetraviB动态机械分析仪以压缩模式分析弹性模量和压缩应力[19]。
1.4.4 水凝胶的体外降解率测试将4组水凝胶制备成2 cm×2 cm×3 cm大小的样品，置入50 ℃烘箱中干燥6 h后称质量(记为m0)，分别置于100 mL烧杯中，加入50 mL含有溶菌酶的PBS(酶活性10 000 U/L)，使用锡箔纸将烧杯封口，37 ℃下恒定振荡(100 r/min)4周。在1，3，5，7，14，21，28 d取出支架，在50 ℃烘箱中干燥6 h后称质量(记为mt)。通过公式(1)计算水凝胶的降解率[20-21]。
降解率=(m0-mt)/m0×100% (1)
1.4.5 水凝胶的平衡溶胀比测试将4组水凝胶制备成1 cm×1 cm×1 cm大小的块状，置于25 ℃真空冷冻干燥48 h，称量质量(记为mds)；随后分别浸入PBS中，于0.5，3，6，12，18，
24 h从PBS中取出水凝胶，轻轻吸干水凝胶表面的溶液，使用称重天平测量溶胀后水凝胶的质量(记为mss)。通过公式(2)计算溶胀比[22]。
溶胀比=(mss-mds)/mds×100% (2)
1.4.6 水凝胶的微观形貌检测采用乙醇置换法测定4组水凝胶的孔隙率[23-24]。将4组水凝胶制备成1 cm×1 cm×1 cm大小的块状，真空冷冻干燥48 h后喷金，使用扫描电镜在20 kV的加速电压下观察样品，利用Image J软件分析孔径大小[25]。
1.4.7 骨髓间充质干细胞的分离培养采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞[26]。取5只SD大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，置于体积分数75%医用乙醇浸泡10 min，超净工作台内清除股骨及胫骨周围肌肉及筋膜，PBS反复冲洗骨头后剪除干骺端，用注射器吸取PBS冲洗骨髓腔至骨头发白透亮；将收集的骨髓液1 500 r/min离心5 min后弃上清液，用完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素链霉素的DMEM低糖培养基)重悬后滴加入Percoll分离液，形成密度梯度分离液；
2 000 r/min离心25 min，吸取中间白色细胞层，加入PBS清洗，1 800 r/min离心5 min，弃上清，保留的细胞沉淀即为骨髓间充质干细胞。
完全培养基重悬细胞沉淀后转移至T25瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养，首次48 h后换液，待细胞贴壁稳定后两三天换液1次，增长至瓶壁80%时可用胰酶消化传代。后续实验选择第3代骨髓间充质干细胞。
1.4.8 水凝胶的细胞相容性检测
扫描电镜观察细胞黏附：将大鼠骨髓间充质干细胞分别与4组水凝胶溶液混合，细胞浓度为2×1010 L-1，溶液总体积为20 mL，置入5%CaCl2溶液中交联20 min，PBS冲洗3次后加入普通DMEM低糖培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养。培养7 d后，2.5%戊二醛固定水凝胶过夜，扫描电镜水凝胶表面的细胞黏附情况。
细胞增殖检测：将大鼠骨髓间充质干细胞分别与4组水凝胶溶液混合，细胞浓度为2×108 L-1，溶液总体积为20 mL，置入5%CaCl2溶液中交联20 min。取各组细胞/水凝胶100 µL分别滴入96孔板，设置空白组(仅添加细胞培养基，无细胞、无水凝胶)，每组5个复孔，置于37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养。培养1，3，5，7 d后，每孔加入10 µL CCK-8试剂孵育4 h，使用酶标仪在470 nm吸收波长下测定吸光度值[27]，制作细胞生长曲线。
细胞活性检测：将大鼠骨髓间充质干细胞分别与4组水凝胶溶液混合，细胞浓度为7×109 L-1，置入5%CaCl2溶液中交联20 min。交联后制备成1 cm×1 cm×1 cm大小的样本，置于37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养。培养7d后，将样本切为0.5 mm厚度小样，用PBS冲洗2次，每次5 min；加入Live/Dead染色试剂室温下作用1 h，用PBS冲洗2次，每次5 min，共聚焦显微镜下观察，红色的为死细胞，绿色的为活细胞[28]，利用Image J软件测定活细胞数与死细胞数。按照公式(3)计算细胞存活率。
细胞存活率=活细胞数/(活细胞数+死细胞数) ×100% (2)
1.5 主要观察指标各组水凝胶的压缩弹性模量、压缩应力、体外降解率、平衡溶胀比与微观形貌与细胞相容性。
1.6 统计学分析数据采用SPSS 27.0软件进行处理，结果采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，事后多重比较采用LSD法。该文统计学方法已经贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

创伤及肿瘤引起的大段骨缺损修复一直是临床棘手难题，骨组织工程有望为大段骨缺损提供解决方案。骨组织工程作为再生医学的核心领域，近年来在材料设计、制造技术和临床转化等方面取得了突破性进展，展现出广阔的应用前景[33]。
此次研究证实海藻酸钠-羟基磷灰石-氧化石墨烯水凝胶为细胞的生长、增殖提供了良好的微环境；与海藻酸钠-羟基磷灰石水凝胶相比，海藻酸钠-羟基磷灰石-氧化石墨烯水凝胶的力学性能及相关表征得到提升，同时促进了细胞的增殖及长入。此次研究结果显示，添加氧化石墨烯后，海藻酸钠-羟基磷灰石水凝胶的孔隙率由31.08%-40.2%上升至49.21%-81.03%，孔径大小由280.30-368.42 μm降至115.27-216.31 μm，后续细胞与水凝胶复合共培养电镜扫描微观结构证实了细胞的生长附着得以提升。氧化石墨烯的添加使得海藻酸钠-羟基磷灰石水凝胶的力学性能得以提升，这得益于氧化石墨烯表面有多种含氧官能团使其表现出多种优异性能，氢键与聚合物形成物理交联网络，能够有效耗散应力，避免纯化学网络的应力集中，有效提高了水凝胶的力学性能[34-35]。氧化石墨烯添加后，海藻酸钠-羟基磷灰石水凝胶溶液的黏度由28.17-33.69 Pa·s提升至74.28-84.96 Pa·s，水凝胶的黏度达到满足凝胶支架塑形即为最佳，过高的黏度会导致凝胶固化过快，从而达不到塑形要求。氧化石墨烯的添加在一定范围内可保证水凝胶塑形，当氧化石墨烯质量浓度达到10 g/L时，结合黏度测试以及塑形实验已能达到形态构建要求，继续添加质量浓度并不能更好地呈现构建效果，反而会因为黏度的增加导致水凝胶塑形效果差。氧化石墨烯复合水凝胶的降解率在26.96%-28.83%之间，而海藻酸钠-羟基磷灰石水凝胶的降解率为32.96%。水凝胶降解速率变慢的可能原因为：氧化石墨烯的加入使得凝胶材料结构发生显著改变，导致水凝胶更加稳定，氧化石墨烯与海藻酸钠形成不同的分子间作用力(氢键、极性基团等)，从而有效抵抗了溶菌酶向材料基体内部的扩散，降低酶解速率[36]。支架的溶胀性能对其在骨组织工程中的应用具有重要意义，支架在体外和体内条件下的溶胀是为了增加其孔隙率，以促进细胞附着和生长。海藻酸钠-羟基磷灰石水凝胶的平衡溶胀比在638.3%-654.4%之间，掺入氧化石墨烯后降至334.8%-387.1%，氧化石墨烯通过氧基间氢键网络降低了水凝胶的膨胀能力，说明亲水性基团减少；然而，由于Ca2+与氧化石墨烯和聚合物骨架的强烈相互作用使得交联密度增加[37]，所以氧化石墨烯的添加虽然导致水凝胶的亲水性降低，但是水凝胶的孔隙率反而增加，使得细胞黏附、生长及增殖效率得到了进一步提升[38-39]。CCK-8与Live/Dead染色结果显示，添加氧化石墨烯后，海藻酸钠-羟基磷灰石水凝胶表面的细胞存活率由37.08%-45.14%升至58.22%-91.09%，不但没有出现细胞生长抑制，反而升高，扫描电镜观察细胞黏附同步印证了其优越的细胞相容性。
有趣的是，各方面数据显示，水凝胶的性能并没有随着氧化石墨烯质量浓度的增加表现出持续性上升，可能是由于随着氧化石墨烯质量浓度增加，体系黏度增大、团聚体形成，导致氧化石墨烯与羟基磷灰石的分散受限，体系中活性点数目达到饱和所致；还有可能是因为氧化石墨烯对骨髓间充质干细胞增殖和分化的促进作用具有一定的浓度依赖性，低质量浓度氧化石墨烯能有效促进骨髓间充质干细胞的增殖，但高质量浓度氧化石墨烯反而会抑制骨髓间充质干细胞的活性。
将海藻酸钠-羟基磷灰石-氧化石墨烯溶液与Ca2+进行离子交联成功制备了水凝胶材料，即SA-HA、SA-HA-8 g/L GO、SA-HA-10 g/L GO、SA-HA-12 g/L GO，实验结果表明，氧化石墨烯的整合显著影响了水凝胶的形态、溶胀能力和力学性能，同时氧化石墨烯的添加有利于促进细胞生长。分析各项实验结果及形成原因后，综合考虑10 g/L 氧化石墨烯的复合水凝胶在塑形、降解速率、力学性能、细胞相容性等方面优于8 g/L 氧化石墨烯复合水凝胶和12 g/L 氧化石墨烯复合水凝胶。因此，SA-HA-10 g/L GO水凝胶具有更出色的细胞相容性、适宜的降解速率和足够的机械性能，有望成为组织工程新型支架。
此次研究制备了海藻酸钠-羟基磷灰石-氧化石墨烯水凝胶，初步探索了氧化石墨烯的最佳质量浓度，完成了支架材料体外构建及物理特性、生物相容性的相关检测，为后续动物实验提供了理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

海藻酸钠-羟基磷灰石-氧化石墨烯水凝胶的制备及细胞相容性

Preparation and cytocompatibility of sodium alginate-hydroxyapatite-graphene oxide hydrogels

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