淫羊藿类外泌体囊泡改善血管平滑肌细胞钙化：蛋白组学分析

doi:10.12307/2026.436

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (31): 8135-8145.doi: 10.12307/2026.436

• 干细胞外泌体 Stem cell exosomes • 上一篇下一篇

淫羊藿类外泌体囊泡改善血管平滑肌细胞钙化：蛋白组学分析

胡凯1，2，陈钰璘1，2，严静1，何莹莹1，2，蒙衍慧1，2，李闰珍1，2，唐耀平1，2，3

1广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530200；2广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530200；3广西中医药大学国际教育学院，广西壮族自治区南宁市 530001

收稿日期:2025-10-15 接受日期:2026-01-29 出版日期:2026-11-08 发布日期:2026-05-23
通讯作者: 唐耀平，博士，教授，主任医师，广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530200；广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530200；广西中医药大学国际教育学院，广西壮族自治区南宁市 530001
作者简介:第一作者：胡凯，男，1995年生，江西省赣州市人，汉族，广西中医药大学在读博士，主治医师，主要从事心血管疾病的中西医结合防治研究。
基金资助:
广西重点研发计划(桂科AB23026143)，项目负责人：唐耀平；国家自然科学基金委员会地区科学基金项目(81260856)，项目负责人：唐耀平；广西自然科学基金项目(2024GXNSFDA010031)，项目负责人：唐耀平

Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles ameliorate vascular smooth muscle cell calcification: a proteomic analysis

Hu Kai1, 2, Chen Yulin1, 2, Yan Jing1, He Yingying1, 2, Meng Yanhui1, 2, Li Runzhen1, 2, Tang Yaoping1, 2, 3

1Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Faculty of International Education, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2025-10-15 Accepted:2026-01-29 Online:2026-11-08 Published:2026-05-23
Contact: Tang Yaoping, MD, Professor, Chief physician, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Faculty of International Education, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Hu Kai, PhD candidate, Attending physician, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Guangxi Key Research and Development Program, No. AB23026143(to TYP); National Natural Science Foundation of China (Regional Science Fund Project), No. 81260856 (to TYP); Guangxi Natural Science Foundation, No. 2024GXNSFDA010031 (to TYP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

Ras同源家族成员A/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶信号通路：是细胞骨架动态调控的核心机制，广泛参与了血管平滑肌细胞的生物学功能。在这一通路中，Ras同源家族成员A小GTP酶作为一种Ras同源家族成员蛋白，在受刺激状态下由GDP结合形式转化为GTP结合形式，进而激活Rho相关卷曲螺旋含蛋白激酶1来调节多种细胞功能，包括细胞骨架重构、收缩、迁移及增殖等。
类外泌体囊泡：是植物细胞分泌的一类膜性囊泡，具有纳米级结构和高度稳定的物理化学性质，类外泌体囊泡中包含脂类、蛋白质、核酸及活性代谢产物，能够在细胞间传递信号分子并参与跨种属的生物信息交流。

摘要
背景：血管钙化属于骨代谢异常，病理机制与骨矿化过程高度相似，淫羊藿作为传统中药，在心血管疾病的应用以及如何改善生物利用度等问题尚无有效证据。
目的：探讨淫羊藿类外泌体囊泡改善血管钙化的作用及分子机制。
方法：①利用密度梯度离心法提取淫羊藿类外泌体囊泡，通过透射电镜、纳米粒径检测仪与纳米颗粒追踪分析仪进行鉴定；②CCK-8实验检测淫羊藿类外泌体囊泡对主动脉平滑肌细胞活性的影响；共聚焦扫描显微镜观察主动脉平滑肌细胞对淫羊藿类外泌体囊泡摄取情况；③通过蛋白组学技术对淫羊藿类外泌体囊泡蛋白成分进行分析鉴定，筛选出可能的功能蛋白；④将主动脉平滑肌细胞分为空白组、模型组以及淫羊藿类外泌体囊泡低、中、高剂量组，培养48 h后用共聚焦显微镜观察细胞骨架变化；流式细胞术检测细胞凋亡情况；Western blot检测Ras同源家族成员A/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶通路相关蛋白表达水平；ELISA检测Ras同源家族成员A-GTP水平；培养7 d后茜素红S染色检测细胞钙化面积，Western blot检测成骨相关蛋白表达水平。
结果与结论：①淫羊藿类外泌体囊泡呈茶托状，粒径在50-200 nm之间；②CCK-8实验显示淫羊藿类外泌体囊泡对细胞活性没有明显的影响；囊泡能被主动脉平滑肌细胞有效摄入，具有生物活性；③蛋白组学分析淫羊藿类外泌体囊泡中可能含有37种特异性蛋白，基因本体分析提示淫羊藿类外泌体囊泡可能通过复杂的蛋白互作网络，协同参与细胞代谢、信号转导及应激反应等过程发挥抗血管钙化作用；④茜素红S染色显示淫羊藿类外泌体囊泡组钙化面积较模型组显著减少；流式细胞术检测显示淫羊藿类外泌体囊泡具有显著的抗凋亡保护作用；共聚焦显微镜结果显示，与模型组相比，淫羊藿类外泌体囊泡低、中、高剂量组细胞骨架结构逐渐改善，呈剂量依赖性保护趋势；Western blot检测结果显示，与模型组相比，淫羊藿类外泌体囊泡低、中、高剂量组Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2、磷酸化Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1表达水平呈剂量依赖性降低，α-平滑肌肌动蛋白、平滑肌22α表达水平呈剂量依赖性升高；ELISA检测结果显示Ras同源家族成员A-GTP呈剂量依赖性降低。研究结果表明淫羊藿类外泌体囊泡可有效改善血管钙化，可能通过调控Ras同源家族成员A/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶通路发挥抗钙化作用。

https://orcid.org/0000-0003-4840-1148 (唐耀平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 淫羊藿, 类外泌体囊泡, Ras同源家族成员A/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(RhoA/ROCK), 血管钙化, 蛋白质组学, 细胞骨架

Abstract: BACKGROUND: Vascular calcification is a type of bone metabolic disorder, and its pathological mechanism is highly similar to the process of bone mineralization. However, there is a lack of effective evidence regarding the application of Epimedium Sagittatum Maxim. (a traditional Chinese medicine) in cardiovascular diseases and how to improve its bioavailability.
OBJECTIVE: To investigate the effects and molecular mechanisms of Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles on vascular calcification.
METHODS: (1) Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles were isolated from using density gradient centrifugation, and characterized by transmission electron microscopy, nanoparticle size analyzer, and nanoparticle tracking analysis. (2) The effects of Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles on the viability of aortic vascular smooth muscle cells were evaluated by CCK-8 assay. The cellular uptake of Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles by aortic vascular smooth muscle cells was observed by confocal laser scanning microscopy. (3) Proteomic analysis was performed to identify and characterize the protein composition of Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles, and potential functional proteins were screened. (4) Aortic vascular smooth muscle cells were divided into blank, model, and Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicle intervention groups (low, medium, and high doses). After co-culturing for 48 hours, cytoskeletal changes were observed by confocal microscopy. Apoptosis was assessed by flow cytometry. Ras homolog family member A/Rho-associated coiled-coil containing protein kinase pathway proteins were measured by western blot assay. Ras homolog family member A-GTP levels were assessed by ELISA. After 7 days of co-culture, calcification areas were detected by Alizarin Red S staining. The expression levels of osteogenic phenotype proteins were detected using western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles exhibited saucer-shaped morphology with particle sizes ranging from 50 to 200 nm. (2) CCK-8 assay showed that Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles had no significant effect on cell viability and were efficiently taken up by aortic vascular smooth muscle cells, indicating good bioactivity. (3) Proteomic analysis identified 37 specific proteins in Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles. Gene Ontology analysis suggested that Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles may exert anti-calcification effects by participating in cellular metabolism, signal transduction, and stress response via complex protein interaction networks. (4) Alizarin Red S staining revealed that Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicle intervention significantly reduced calcification areas compared with the model group. Flow cytometry indicated that Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles exerted notable anti-apoptotic effects. Confocal microscopy results showed that compared with the model group, Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles dose-dependently restored cytoskeletal structure in the Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicle intervention groups (low, medium, and high doses). Western blot analysis showed that, compared with the model group, the expression levels of Runt-related transcription factor 2, bone morphogenetic protein 2, and phosphorylated Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1 were dose-dependently decreased in the low, medium, and high-dose Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicle groups, while the expression levels of α-smooth muscle actin and smooth muscle 22α were dose-dependently increased. ELISA results showed a dose-dependent decrease in Ras homolog family member A-GTP. The results indicate that Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles can effectively improve vascular calcification, possibly by regulating the Ras homolog family member A/Rho-associated coiled-coil containing protein kinase pathway.

Key words: Epimedium Sagittatum Maxim., extracellular vesicles, Ras homolog family member A/Rho-associated coiled-coil containing protein kinase (RhoA/ROCK), vascular calcification, proteomics, cytoskeleton

中图分类号:

胡凯, 陈钰璘, 严静, 何莹莹, 蒙衍慧, 李闰珍, 唐耀平. 淫羊藿类外泌体囊泡改善血管平滑肌细胞钙化：蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(31): 8135-8145.

Hu Kai, Chen Yulin, Yan Jing, He Yingying, Meng Yanhui, Li Runzhen, Tang Yaoping. Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles ameliorate vascular smooth muscle cell calcification: a proteomic analysis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(31): 8135-8145.

图/表（结果） 9

2.1 淫羊藿类外泌体囊泡纳米药物表征 淫羊藿类外泌体囊泡主要集中在蔗糖梯度45%和60%之间(图1A)，透射电子显微镜显示淫羊藿类外泌体囊泡呈茶托状，粒径大小在50-200 nm之间(图1B)，纳米颗粒追踪分析仪、纳米粒径检测仪与透射电子显微镜结果一致，均显示淫羊藿类外泌体囊泡粒径大小主要集中在50-200 nm之间，颗粒含量约为1.7×108/mL(图1C)。

2.2 淫羊藿类外泌体囊泡对主动脉平滑肌细胞活性的影响 CCK-8实验结果显示，淫羊藿类外泌体囊泡在设定的浓度范围内对主动脉平滑肌细胞活性无明显影响(图2A)，说明淫羊藿类外泌体囊泡的生物安全性较高，不会引起细胞毒性反应。
2.3 主动脉平滑肌细胞对淫羊藿类外泌体囊泡的摄取情况 孵育3 h，在主动脉平滑肌细胞中可以检测到淫羊藿类外泌体囊泡，表明淫羊藿类外泌体囊泡很快被细胞吸收；孵育12 h，大量主动脉平滑肌细胞已内化淫羊藿类外泌体囊泡(图2B)。

2.4 淫羊藿类外泌体囊泡蛋白质组学结果 通过蛋白组学分析方法，淫羊藿类外泌体囊泡中共鉴定出37种蛋白(表1)，其中包括Actin-related protein、Heat shock protein 90、Elongation factor 1-alpha及Histone H4等植物外泌体中常见的重要蛋白。此外，还发现了14-3-3 protein、EF-hand domain、Polyubiquitin等参与细胞骨架稳定、信号转导、蛋白质降解与修饰相关的蛋白质。这些蛋白质共同参与囊泡结构的稳定、细胞间信号的转导、应激反应及代谢调控等多个关键生理过程。

2.5 淫羊藿类外泌体囊泡中蛋白质的GO功能网络互作分析 GO功能网络互作分析发现(图3)，这些蛋白在生物学过程中显著富集于细胞对热刺激的响应、肌醇磷酸代谢、谷氨酰胺合成和戊糖磷酸途径等代谢与应激调控过程；在细胞组分方面则集中于RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物、细胞质核周区以及蛋白质复合物；而在分子功能方面主要与转醛醇酶活性、羧化酶/加氧酶激活活性、核苷酸酶活性等相关。同时，网络互作分析提示这些功能并非独立存在，细胞对热刺激的响应与RNA聚合酶Ⅱ介导的转录调控、ATP依赖的蛋白折叠伴侣活性以及蛋白质复合物之间存在密切的相互关系；而谷氨酰胺生物合成过程与谷氨酰胺合成酶活性，肌醇磷酸代谢过程与3’(2’)，5’-二磷酸核苷酸酶活性及硫酸盐同化作用之间也表现出明显的功能关联。

2.6 细胞钙化面积比较 茜素红S染色结果显示，空白组几乎未见红色钙结节沉积，而模型组则有明显且广泛的钙结节沉积(P < 0.001)，提示模型成功建立(图4A)。加入淫羊藿类外泌体囊泡处理后，细胞钙化情况明显改善(P < 0.001)，钙化面积显著减少(图4B)，且随着淫羊藿类外泌体囊泡质量浓度的升高，钙化沉积面积呈明显的剂量依赖性递减趋势，表明淫羊藿类外泌体囊泡对钙化细胞具有明显的抑制作用。

2.7 淫羊藿类外泌体囊泡对细胞骨架的影响 共聚焦扫描显微镜观察鬼笔环肽染色结果显示(图5)，空白组细胞骨架结构清晰完整，呈现均匀规则的纤维状分布；模型组则表现出明显的细胞骨架紊乱，大部分细胞仅有DAPI染色的细胞核，而鬼笔环肽染色的细胞骨架结构消失或严重紊乱，提示钙化损伤明显。经低、中、高剂量(5，10，20 mg/L)淫羊藿类外泌体囊泡干预后，细胞骨架结构明显改善，随淫羊藿类外泌体囊泡质量浓度的升高，细胞骨架形态逐渐恢复正常，呈现剂量依赖性改善趋势，提示淫羊藿类外泌体囊泡对钙化诱导的细胞骨架损伤具有显著的保护和修复作用。

2.8 淫羊藿类外泌体囊泡对主动脉平滑肌细胞的抗凋亡作用 流式细胞术检测结果显示(图6)，空白组细胞凋亡比例较低，细胞状态良好；模型组细胞凋亡比例显著增加(P < 0.000 1)，细胞受到明显的损伤；经过淫羊藿类外泌体囊泡处理后，细胞凋亡比例明显下降(P < 0.000 1)，细胞存活率明显提升，且细胞抗凋亡作用随淫羊藿类外泌体囊泡质量浓度的增加而增强。结果提示，淫羊藿类外泌体囊泡可有效抑制细胞凋亡，对血管平滑肌细胞具有显著的保护作用。

2.9 Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2、α-平滑肌肌动蛋白、平滑肌22α蛋白表达水平 Western blot结果显示(图7)，在钙化诱导下，模型组细胞中Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2表达显著升高(P < 0.000 1)，而α-平滑肌肌动蛋白、平滑肌22α表达明显降低(P < 0.000 1)，提示细胞表型发生明显的成骨转化。经过不同质量浓度淫羊藿类外泌体囊泡干预后，Runt相关转录因子2和骨形态发生蛋白2表达明显降低，而α-平滑肌肌动蛋白和平滑肌22α表达则明显升高，提示淫羊藿类外泌体囊泡能够显著抑制细胞的成骨表型转化，维持平滑肌细胞的收缩表型，进而发挥对细胞钙化的抑制作用。

2.10 RhoA/ROCK通路RhoA-GTP、ROCK1、p-ROCK1蛋白表达水平 见图8。ELISA检测结果显示，模型组RhoA-GTP水平显著升高，与空白组相比差异明显(P < 0.000 1)。不同质量浓度淫羊藿类外泌体囊泡干预后，RhoA-GTP水平明显降低(P < 0.000 1)。Western blot结果显示，各组细胞ROCK1总蛋白表达水平无明显差异，而模型组p-ROCK1蛋白表达水平明显升高，提示ROCK通路激活；经淫羊藿类外泌体囊泡干预后，p-ROCK1蛋白表达水平显著下降。以上结果提示，淫羊藿类外泌体囊泡能够有效抑制钙化诱导的RhoA/ROCK信号通路活化。

参考文献

[1] SOROKIN V, VICKNESON K, KOFIDIS T, et al. Role of Vascular Smooth Muscle Cell Plasticity and Interactions in Vessel Wall Inflammation. Front Immunol. 2020;11:599415.
[2] BENZ K, HILGERS KF, DANIEL C, et al. Vascular Calcification in Chronic Kidney Disease: The Role of Inflammation. Int J Nephrol. 2018;2018:4310379.
[3] LEE SJ, LEE IK, JEON JH. Vascular Calcification-New Insights Into Its Mechanism. Int J Mol Sci. 2020;21(8):2685.
[4] DURHAM AL, SPEER MY, SCATENA M, et al. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovasc Res. 2018;114(4):590-600.
[5] SINGH A, TANDON S, TANDON C. An update on vascular calcification and potential therapeutics. Mol Biol Rep. 2021;48(1):887-896.
[6] AKHMANOVA A, KAPITEIN LC. Mechanisms of microtubule organization in differentiated animal cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022;23(8):541-558.
[7] DOKUMACIOGLU E, DUZCAN I, ISKENDER H, et al. RhoA/ROCK-1 Signaling Pathway and Oxidative Stress in Coronary Artery Disease Patients. Braz J Cardiovasc Surg. 2022;37(2):212-218.
[8] LIU H, YIN H, WANG Z, et al. Rho A/ROCK1 signaling-mediated metabolic reprogramming of valvular interstitial cells toward Warburg effect accelerates aortic valve calcification via AMPK/RUNX2 axis. Cell Death Dis. 2023;14(2):108.
[9] ZHOU W, YUAN X, LI J, et al. Retinol binding protein 4 promotes the phenotypic transformation of vascular smooth muscle cells under high glucose condition via modulating RhoA/ROCK1 pathway. Transl Res. 2023; 259:13-27.
[10] TSUDA T, IMANISHI M, OOGOSHI M, et al. Rho-associated protein kinase and cyclophilin a are involved in inorganic phosphate-induced calcification signaling in vascular smooth muscle cells. J Pharmacol Sci. 2020;142(3): 109-115.
[11] SUN Y, HUANG D, ZHANG Y. The bone-vascular axis: the link between osteoporosis and vascular calcification. Mol Cell Biochem. 2025;480(6): 3413-3427.
[12] VACHEY C, CANDELLIER A, TOUTAIN S, et al. The Bone-Vascular Axis in Chronic Kidney Disease: From Pathophysiology to Treatment. Curr Osteoporos Rep. 2024;22(1):69-79.
[13] WANG ZX, LUO ZW, LI FX, et al. Aged bone matrix-derived extracellular vesicles as a messenger for calcification paradox. Nat Commun. 2022; 13(1):1453.
[14] GAO J, XIANG S, WEI X, et al. Icariin Promotes the Osteogenesis of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells through Regulating Sclerostin and Activating the Wnt/β-Catenin Signaling Pathway. Biomed Res Int. 2021; 2021:6666836.
[15] 薛春阳,王秀会.淫羊藿苷调节酸性微环境减轻绝经后老年骨质疏松性疼痛[J].中国组织工程研究,2024,28(28):4461-4468.
[16] ZENG Y, XIONG Y, YANG T, et al. Icariin and its metabolites as potential protective phytochemicals against cardiovascular disease: From effects to molecular mechanisms. Biomed Pharmacother. 2022;147:112642.
[17] SHARMA S, IQUBAL A, KHAN V, et al. Icariin ameliorates oxidative stress-induced inflammation, apoptosis, and heart failure in isoproterenol-challenged Wistar rats. Iran J Basic Med Sci. 2023;26(5):517-525.
[18] HUANG X, LEI S, XIONG X, et al. Unveiling the Therapeutic Potential of Herba Epimedii: Enhancing Bone Healing Through Cytoskeletal Regulation of RhoA/Rock1 Pathway. Chem Biodivers. 2024;21(2): e202301383.
[19] 韩一旦,张海凤,许云腾,等.淫羊藿苷通过caveolin-1/Hippo信号通路促进BMSCs成骨分化改善骨代谢紊乱的机制研究[J].中国中药杂志, 2025,50(3):600-608.
[20] 闵捷,李雅琴,罗云梅,等.淫羊藿苷的心血管保护作用及机制研究进展[J].中国新药与临床杂志,2021,40(11):741-745.
[21] 白晓君,刘艳,郜珊珊,等.淫羊藿苷抑制氧化应激诱导主动脉血管平滑肌细胞钙化的机制研究[J].中国中药杂志,2021,46(17):4497-4503.
[22] XU Z, XU Y, ZHANG K, et al. Plant-derived extracellular vesicles (PDEVs) in nanomedicine for human disease and therapeutic modalities. J Nanobiotechnology. 2023;21(1):114.
[23] LIAN MQ, CHNG WH, LIANG J, et al. Plant-derived extracellular vesicles: Recent advancements and current challenges on their use for biomedical applications. J Extracell Vesicles. 2022;11(12):e12283.
[24] NEMATI M, SINGH B, MIR RA, et al. Plant-derived extracellular vesicles: a novel nanomedicine approach with advantages and challenges. Cell Commun Signal. 2022;20(1):69.
[25] ALZAHRANI FA, KHAN MI, KAMELI N, et al. Plant-Derived Extracellular Vesicles and Their Exciting Potential as the Future of Next-Generation Drug Delivery. Biomolecules. 2023;13(5):839.
[26] KANG SJ, LEE JH, RHEE WJ. Engineered plant-derived extracellular vesicles for targeted regulation and treatment of colitis-associated inflammation. Theranostics. 2024;14(14):5643-5661.
[27] MARTÍNEZ FAJARDO C, MOROTE L, MORENO-GIMÉNEZ E, et al. Exosome-like nanoparticles from Arbutus unedo L. mitigate LPS-induced inflammation via JAK-STAT inactivation. Food Funct. 2024; 15(22):11280-11290.
[28] DE ROBERTIS M, SARRA A, D’ORIA V, et al. Blueberry-Derived Exosome-Like Nanoparticles Counter the Response to TNF-α-Induced Change on Gene Expression in EA.hy926 Cells. Biomolecules. 2020; 10(5):742.
[29] NIU W, XIAO Q, WANG X, et al. A Biomimetic Drug Delivery System by Integrating Grapefruit Extracellular Vesicles and Doxorubicin-Loaded Heparin-Based Nanoparticles for Glioma Therapy. Nano Lett. 2021;21(3): 1484-1492.
[30] KIM J, LI S, ZHANG S, et al. Plant-derived exosome-like nanoparticles and their therapeutic activities. Asian J Pharm Sci. 2022;17(1):53-69.
[31] GUPTA D, ZICKLER AM, EL ANDALOUSSI S. Dosing extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 2021;178:113961.
[32] WELSH JA, GOBERDHAN DCI, O’DRISCOLL L, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 2024;13(2):e12404.
[33] HOU Z, WANG X, YANG Z, et al. Pomegranate-derived exosome-like nanovesicles ameliorate high-fat diet–induced nonalcoholic fatty liver disease via alleviating mitochondrial dysfunction. J Funct Foods. 2023;108:105734.
[34] DEMICHEV V, MESSNER CB, VERNARDIS SI, et al. DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat Methods. 2020;17(1):41-44.
[35] WANG S, LI W, HU L, et al. NAguideR: performing and prioritizing missing value imputations for consistent bottom-up proteomic analyses. Nucleic Acids Res. 2020;48(14):e83.
[36] MILACIC M, BEAVERS D, CONLEY P, et al. The Reactome Pathway Knowledgebase 2024. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D672-D678.
[37] PANG Q, WANG P, PAN Y, et al. Irisin protects against vascular calcification by activating autophagy and inhibiting NLRP3-mediated vascular smooth muscle cell pyroptosis in chronic kidney disease. Cell Death Dis. 2022;13(3):283.
[38] KÜRTÖSI B, KAZSOKI A, ZELKÓ R. A Systematic Review on Plant-Derived Extracellular Vesicles as Drug Delivery Systems. Int J Mol Sci. 2024; 25(14):7559.
[39] KIM M, JANG H, KIM W, et al. Therapeutic Applications of Plant-Derived Extracellular Vesicles as Antioxidants for Oxidative Stress-Related Diseases. Antioxidants (Basel). 2023;12(6):1286.
[40] TIWARI A, SONI N, DONGRE S, et al. The role of plant-derived extracellular vesicles in ameliorating chronic diseases. Mol Biol Rep. 2025;52(1):360.
[41] FENG W, TENG Y, ZHONG Q, et al. Biomimetic Grapefruit-Derived Extracellular Vesicles for Safe and Targeted Delivery of Sodium Thiosulfate against Vascular Calcification. ACS Nano. 2023;17(24): 24773-24789.
[42] 陈钰璘,何莹莹,胡凯,等.瓜蒌类外泌体囊泡防治动脉粥样硬化的作用及机制[J].中国组织工程研究,2026,30(7):1768-1781.
[43] SHARMA S, MAHANTY M, RAHAMAN SG, et al. Avocado-derived extracellular vesicles loaded with ginkgetin and berberine prevent inflammation and macrophage foam cell formation. J Cell Mol Med. 2024;28(7):e18177.
[44] ZHANG S, XIA J, ZHU Y, et al. Establishing Salvia miltiorrhiza-Derived Exosome-like Nanoparticles and Elucidating Their Role in Angiogenesis. Molecules. 2024;29(7):1599.
[45] LÓPEZ DE LAS HAZAS MC, TOMÉ-CARNEIRO J, DEL POZO-ACEBO L, et al. Therapeutic potential of plant-derived extracellular vesicles as nanocarriers for exogenous miRNAs. Pharmacol Res. 2023;198:106999.
[46] SHUKEN SR. An Introduction to Mass Spectrometry-Based Proteomics. J Proteome Res. 2023;22(7):2151-2171.
[47] LIU Z, CHEN X, YANG S, et al. Integrated mass spectrometry strategy for functional protein complex discovery and structural characterization. Curr Opin Chem Biol. 2023;74:102305.
[48] HUNTER CL, BONS J, SCHILLING B. Perspectives and opinions from scientific leaders on the evolution of data-independent acquisition for quantitative proteomics and novel biological applications. Aust J Chem. 2023;76(8): 379-398.
[49] YANG Y, LIN L, QIAO L. Deep learning approaches for data-independent acquisition proteomics. Expert Rev Proteomics. 2021;18(12):1031-1043.
[50] LIU Y, XIAO S, WANG D, et al. A review on separation and application of plant-derived exosome-like nanoparticles. J Sep Sci. 2024;47(8): e2300669.
[51] SUHARTA S, BARLIAN A, HIDAJAH AC, et al. Plant-derived exosome-like nanoparticles: A concise review on its extraction methods, content, bioactivities, and potential as functional food ingredient. J Food Sci. 2021; 86(7):2838-2850.
[52] OBSILOVA V, OBSIL T. Structural insights into the functional roles of 14-3-3 proteins. Front Mol Biosci. 2022;9:1016071.
[53] PENNINGTON KL, CHAN TY, TORRES MP, et al. The dynamic and stress-adaptive signaling hub of 14-3-3: emerging mechanisms of regulation and context-dependent protein-protein interactions. Oncogene. 2018; 37(42):5587-5604.
[54] CHIOSIS G, DIGWAL CS, TREPEL JB, et al. Structural and functional complexity of HSP90 in cellular homeostasis and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(11):797-815.
[55] LI W, SUN W, YANG CH, et al. Tanshinone II a protects against lipopolysaccharides-induced endothelial cell injury via Rho/Rho kinase pathway. Chin J Integr Med. 2014;20(3):216-223.
[56] CHEN J, WANG H, GAO C, et al. Tetramethylpyrazine alleviates LPS-induced inflammatory injury in HUVECs by inhibiting Rho/ROCK pathway. Biochem Biophys Res Commun. 2019;514(1):329-335.
[57] XIE L, WANG T, LIN S, et al. Uncaria Rhynchophylla attenuates angiotensin Ⅱ-induced myocardial fibrosis via suppression of the RhoA/ROCK1 pathway. Biomed Pharmacother. 2022;146:112607.
[58] ÁLVAREZ-SANTOS MD, ÁLVAREZ-GONZÁLEZ M, ESTRADA-SOTO S, et al. Regulation of Myosin Light-Chain Phosphatase Activity to Generate Airway Smooth Muscle Hypercontractility. Front Physiol. 2020;11:701.
[59] YAP C, MIEREMET A, DE VRIES CJM, et al. Six Shades of Vascular Smooth Muscle Cells Illuminated by KLF4 (Krüppel-Like Factor 4). Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(11):2693-2707.
[60] CAI X, WANG KC, MENG Z. Mechanoregulation of YAP and TAZ in Cellular Homeostasis and Disease Progression. Front Cell Dev Biol. 2021;9:673599.
[61] OH YJ, KIM H, KIM AJ, et al. Reduction of Secreted Frizzled-Related Protein 5 Drives Vascular Calcification through Wnt3a-Mediated Rho/ROCK/JNK Signaling in Chronic Kidney Disease. Int J Mol Sci. 2020;21(10):3539.
[62] GU X, MASTERS KS. Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2011;300(2):H448-458.

引言

血管钙化是心血管疾病常见且重要的病理变化之一，以钙磷沉积于血管壁为主要特征，导致动脉硬化和弹性降低，这一过程不仅降低了心血管系统的功能储备，还显著增加了动脉粥样硬化、冠心病、慢性肾脏病及糖尿病患者的心血管并发症风险[1-2]。然而，血管钙化的形成并非单纯的钙盐沉积，而是一个多因素参与的复杂动态过程，包括钙磷代谢紊乱、细胞凋亡、慢性炎症和氧化应激等，这些因素共同导致血管平滑肌细胞发生成骨样分化，最终形成钙化结节[3-4]。尽管近年来血管钙化治疗领域取得了一定进展，但现有治疗方法仍面临多重局限性。大多数药物(如磷酸盐结合剂和钠硫代硫酸盐)仅能延缓钙化进程，难以逆转已形成的钙化斑块，此外，这些药物往往伴有显著的不良反应，如低钙血症和对骨代谢及肾功能的潜在损害，长期应用的安全性与疗效难以保障[5]，因此，寻找新的、有效的血管钙化防治策略仍是目前的研究热点。
细胞骨架作为细胞内结构的重要组成部分，主要包括微丝、微管和中间纤维3种成分，细胞骨架不仅在维持细胞形态和提供力学支撑方面发挥核心作用，还可通过调节细胞内物质运输、信号传递、细胞极性和细胞分裂等过程，实现细胞的功能性活动[6]。Ras同源家族成员A (Ras homolog family member A，RhoA)/ Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase，ROCK)信号通路是由RhoA及下游效应蛋白ROCK组成的重要细胞信号传导途径，RhoA在胞质中以GDP结合的非活化状态存在，受到细胞外刺激后转化为GTP结合的活化状态(RhoA-GTP)，并进一步激活下游效应因子ROCK[7]。RhoA/ROCK信号通路在细胞骨架重塑与血管平滑肌细胞功能转化中起关键作用，RhoA激活后通过ROCK介导的肌球蛋白轻链磷酸化，促进肌动蛋白聚合和细胞骨架重塑，从而诱导血管平滑肌细胞从收缩表型向成骨样合成表型转变，促进成骨相关基因的表达(如Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2)，进一步加速血管钙化进程[8-9]。已有研究证实，ROCK抑制剂(如Y-27632)能够明显抑制血管平滑肌细胞成骨转化，减少钙化结节形成，这表明靶向RhoA/ROCK通路可能是治疗血管钙化的重要策略之一[10]。
近年来提出的“骨-血管轴”理论强调了骨代谢与血管钙化之间的相互关系，即骨代谢异常可加速血管钙化进程，而血管钙化又反过来进一步影响骨组织代谢，形成恶性循环[11-12]。最近研究发现衰老骨基质胞外囊泡能够进入骨髓腔和血管组织，促进骨髓间充质干细胞成脂分化以及血管平滑肌细胞成骨分化，从而诱导骨-脂失衡，加剧血管钙化的进展[13]，为骨-血管轴理论提供了新的实验依据，进一步说明了骨与血管组织之间具有紧密的相互联系，在血管钙化病理进展中发挥重要作用。淫羊藿(Epimedium sagittatum Maxim.，ESM)作为传统中药，具有补肾阳、强筋骨等多种功效，在临床治疗骨质疏松等骨代谢疾病方面应用广泛[14-15]。研究发现，淫羊藿中的多种活性成分可以通过抗细胞增殖、抗炎、抗氧化、保护内皮功能、调节血流动力学等多方面改善心血管疾病[16-17]。现代药理研究发现，淫羊藿中的主要有效成分淫羊藿苷能够有效促进成骨细胞分化、抑制破骨细胞活性，通过改善骨代谢进而间接影响骨-血管轴，缓解血管钙化[18-19]。此外，淫羊藿苷还具有抗氧化、抗炎及改善内皮功能的作用，这些生物学效应使淫羊藿苷在防治动脉粥样硬化、心力衰竭和血管钙化等心血管疾病中具有重要的应用潜力[20-21]。但是，由于淫羊藿具有成分复杂、生物利用度低等局限性，不能完全发挥治疗心血管疾病的作用，因此，深入探索淫羊藿的活性成分及作用机制、开发现代化制剂、提高生物利用度等，是目前淫羊藿在骨代谢疾病、心血管疾病等领域研究的主流方向，具有较为广阔的应用前景。
近年来，植物来源细胞外囊泡研究越来越广泛，它们在结构和功能上与哺乳动物来源细胞外囊泡相似，在治疗人类疾病中发挥重要潜力[22-23]。细胞外囊泡富含蛋白质、脂类、核酸及其他生物活性分子，因天然的稳定性、高生物相容性和低免疫原性而备受关注。与动物来源细胞外囊泡相比，植物来源细胞外囊泡来源广泛、易于提取且具有较高的生物安全性，不易引发宿主免疫反应[24-25]。研究发现，红甘蓝、杨梅来源细胞外囊泡具有显著的抗炎作用，能够通过调节免疫反应减缓各种免疫性疾病的发展[26-27]。此外，蓝莓来源细胞外囊泡可以被原代内皮细胞以剂量依赖的方式摄取，并抑制肿瘤坏死因子α诱导活性氧的产生，保护血管系统免受各种应激源的影响，显示了植物细胞外囊泡在心血管疾病治疗中的巨大潜力[28]。血管钙化的病理机制与骨矿化过程高度相似，均涉及钙磷代谢紊乱和成骨样分化，而淫羊藿作为一种治疗骨代谢、心血管疾病的常用中药，研究淫羊藿来源细胞外囊泡对血管钙化的治疗作用，具有更为广阔的应用前景。
基于以上理论与研究进展，此次研究提出假设：淫羊藿类外泌体囊泡(Epimedium Sagittatum Maxim.-Extracellular vesicles，ESM-EVs)可能通过调控RhoA/ROCK信号通路抑制血管平滑肌细胞的成骨分化，进而改善血管钙化进程。此研究通过数据非依赖采集蛋白组学技术深入阐明淫羊藿类外泌体囊泡改善血管钙化的具体机制，以期为临床防治血管钙化提供新的理论基础与实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验。
1.2 时间及地点 实验于2024年12月至2025年5月在广西中医药大学科学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 小鼠主动脉血管平滑肌细胞(Mouse aortic vascular smooth muscle cells，MOVAs)系来自北京中生奥邦生物科技有限公司(06.0879)。
1.3.2 主要试剂与仪器 CCK-8试剂盒(Biosharp，BS350B)；血管平滑肌细胞诱导钙化试剂盒(瑾原生物，JY-H1041)；小鼠主动脉血管平滑肌细胞专用完全培养基(EallBio，03.20143)；外泌体红色荧光标记染料PKH26(Umibio，UR52302)；抗荧光淬灭封片剂(含DAPI)(UElandy，A4084)；FITC标记鬼笔环肽(ABclonal，RM02836)；多聚甲醛通用型组织固定液(兰杰柯，BL539A)；茜素红染色液(赛业，ALIR-10001)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(信天翁，100-101-100)；Runt相关转录因子2抗体(Nature Biosciences，A64087)；骨形态发生蛋白2抗体(Nature Biosciences，A71742)；α-平滑肌肌动蛋白抗体(Nature Biosciences，A33150)；平滑肌22α抗体(Nature Biosciences，A95670)；ROCK1抗体(Nature Biosciences，A90785)；p-ROCK1抗体(Thr455/Thr456)(Abmart，TA3895)；GAPDH抗体(Nature biosciences，RA0003)；小鼠转化蛋白RhoA-GTP ELISA检测试剂盒(上海凡科维，F0453-MA)；BCA蛋白定量试剂盒(兰杰柯，BL521A)；超速离心机(日立，CP10NX)；透射电子显微镜(日立，HT7700)；纳米粒径检测仪(Malvern，ZetasizerNanoZS)；纳米颗粒追踪分析仪(Particle Metrix，ZetaView S/N 20-553)；共聚焦扫描显微镜(奥林巴斯，Fluoview FV4000)；Orbitrap Astral质谱仪(Thermo Fisher Scientific)；高效液相色谱仪(Thermo Fisher Scientific)；流式细胞仪(BD LSRFortessa™，BD Biosciences)。
1.4 实验方法
1.4.1 密度梯度离心法提取淫羊藿类外泌体囊泡 从市场购买新鲜整株淫羊藿，选取新鲜淫羊藿叶子，用纯水洗净后加入纯水进行榨汁。将汁水依次以1 000×g离心10 min、3 000×g离心40 min、10 000×g离心60 min(每次均取上清液)，可以得到去除细胞碎片、细胞器以及其余大颗粒的上清液，将上清液以150 000×g超速离心70 min，将沉淀物重悬于PBS中[29]，将悬浮液在含梯度蔗糖(8%，30%，45%，60%)的PBS中以150 000×g超速离心2 h，吸取45%和60%界面条带，使用0.22 μm滤嘴进一步过滤细菌以及杂质，提取出高纯度的淫羊藿类外泌体囊泡进行后续实验。通过BCA蛋白检测试剂盒定量淫羊藿类外泌体囊泡的蛋白浓度[30]。
1.4.2 透射电子显微镜观察淫羊藿类外泌体囊泡形态与大小 用20 g/L多聚甲醛通用型组织固定液重悬淫羊藿类外泌体囊泡后使用铜网吸附，经过醋酸铀染色后，通过透射电子显微镜观察淫羊藿类外泌体囊泡的形态与大小[29]。
1.4.3 纳米粒径检测仪、纳米颗粒追踪分析仪检测淫羊藿类外泌体囊泡粒径大小及分布 按仪器说明使用纳米粒径检测仪和纳米颗粒追踪分析仪检测淫羊藿类外泌体囊泡粒径大小、分布以及丰度。
1.4.4 CCK-8实验检测淫羊藿类外泌体囊泡对主动脉平滑肌细胞活性的影响 将主动脉平滑肌细胞以1×107 L-1细胞浓度接种于96孔板中，每孔100 μL，用细胞专用完全培养基培养24 h后，分为空白组、淫羊藿类外泌体囊泡低、中、高剂量组，空白组正常培养，淫羊藿类外泌体囊泡低、中、高剂量组分别对应加入5，10，20 mg/L淫羊藿类外泌体囊泡[31]，孵育24 h，在孵育结束前60 min，向每孔中加入10 μL CCK-8试剂。使用全波长多功能酶标仪测定各组吸光度值，计算细胞活性。
1.4.5 共聚焦扫描显微镜观察主动脉平滑肌细胞对淫羊藿类外泌体囊泡的摄入情况 按PKH26试剂盒说明书配制PKH26工作液，将PKH26工作液与淫羊藿类外泌体囊泡混匀后静置避光孵育10 min，150 000×g超速离心70 min后吸除上清液以除去多余染料，使用PBS重悬即可得到PKH26染色标记的淫羊藿类外泌体囊泡，将标记好的淫羊藿类外泌体囊泡与主动脉平滑肌细胞共孵育3，6，12 h，用40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，按FITC标记鬼笔环肽试剂盒说明书配制FITC标记鬼笔环肽工作液，将FITC标记鬼笔环肽工作液与固定后的细胞共孵育50 min对细胞骨架进行染色，抗荧光淬灭封片剂(含DAPI)标记细胞核，使用共聚焦扫描显微镜观察和拍照。设置染料空白对照组：以等体积PBS替代淫羊藿类外泌体囊泡，按上述流程进行PKH26标记(混匀孵育10 min，150 000×g超速离心70 min去除游离染料，PBS重悬)，随后与主动脉平滑肌细胞共孵育12 h，其余所有条件与淫羊藿类外泌体囊泡12 h处理组完全一致，该对照组用于排除PKH26染料胶束和非特异性吸附导致的伪影[32-33]。
1.4.6 淫羊藿类外泌体囊泡蛋白质组学分析 采用SDS裂解液裂解淫羊藿类外泌体囊泡，BCA法测定蛋白浓度后，取100 μg蛋白进行二硫苏糖醇还原和碘乙酰胺烷基化，随后胰蛋白酶酶解，脱盐干燥后进行液相质谱检测。利用Vanquish Neo UHPLC系统进行肽段分离，流动相为A液(0.1%甲酸水溶液)和B液[80%乙腈(含0.1%甲酸)]，采用梯度洗脱方式。质谱分析采用Orbitrap Astral高分辨质谱仪进行数据非依赖采集，一级扫描分辨率为240 000 (@200 m/z)，扫描范围为380-980 m/z，质谱数据用Spectronaut软件分析，通过UniProt数据库进行蛋白鉴定(FDR≤1%)[34-36]。利用R包clusterProfiler进行基因本体论(Gene Ontology，GO)富集分析，以揭示差异表达蛋白的生物学功能。
1.4.7 细胞分组与模型建立 按说明书将血管平滑肌细胞诱导钙化试剂盒中的血管平滑肌细胞诱导钙化基础培养基与钙化因子、双抗混合均匀，配置成血管平滑肌细胞诱导钙化完全培养基。将小鼠主动脉平滑肌细胞以3×108 L-1细胞浓度接种于6孔板中，每孔2 mL，用血管平滑肌细胞专用完全培养基培养24 h，将细胞分为空白组、模型组、淫羊藿类外泌体囊泡低、中、高剂量组。空白组用血管平滑肌细胞专用培养基培养，模型组与淫羊藿类外泌体囊泡低、中、高剂量组均加入血管平滑肌细胞诱导钙化完全培养基，2 d更换1次培养液，共培养7 d构建细胞钙化模型[37]。
1.4.8 给药方案 在上述1.4.7模型开始诱导的同时，淫羊藿类外泌体囊泡低、中、高剂量组分别加入5，10，20 mg/L淫羊藿类外泌体囊泡，2 d更换培养液的同时重新加入相对应的淫羊藿类外泌体囊泡共培养。
1.4.9 茜素红S染色观察细胞钙化面积 各组细胞干预7 d，吸净培养基后用PBS洗涤2次，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，吸去固定液后再用PBS洗涤2次，用茜素红染液染色5 min，吸去染色液后再用PBS洗涤2次，用倒置相差显微镜观察染色情况，采用Image J软件计算钙化面积。
1.4.10 共聚焦扫描显微镜观察淫羊藿类外泌体囊泡对细胞骨架的影响 将小鼠血管平滑肌细胞以1×108 L-1细胞浓度接种于激光共聚焦专用培养皿中，每孔1 mL，用血管平滑肌细胞专用完全培养基培养24 h，按上述1.4.7分组建模方法与1.4.8给药方案，淫羊藿类外泌体囊泡干预48 h后，用PBS清洗2次，40 g/L多聚甲醛固定50 min，按FITC标记鬼笔环肽试剂盒说明书配制鬼笔环肽工作液，将FITC标记鬼笔环肽工作液与固定后的细胞共孵育50 min对细胞骨架进行染色，抗荧光淬灭封片剂(含DAPI)标记细胞核。激光共聚焦扫描显微镜观察细胞骨架的形态和分布。
1.4.11 流式细胞术检测淫羊藿类外泌体囊泡的抗凋亡作用 各组细胞干预48 h后，用胰酶消化，离心收集细胞，预冷PBS洗涤2次，用结合缓冲液重悬细胞并调整细胞浓度至1×109 L-1，取100 µL细胞悬液，依次加入5 µL Annexin V-FITC和5 µL碘化丙啶，轻柔混匀，室温避光孵育15 min，随后加入400 µL结合缓冲液混匀，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，结果采用FlowJo软件进行数据分析。
1.4.12 Western blot检测细胞成骨表型Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2、α-平滑肌肌动蛋白、平滑肌22α蛋白表达水平 各组细胞干预7 d后，用RIPA裂解液裂解，离心取上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后转移到PVDF膜上，5%牛血清蛋白封闭，加入一抗(Runt相关转录因子2、平滑肌22α，1∶1 000；GAPDH，1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜后室温下二抗(1∶5 000)孵育60 min，加入ECL试剂显影，用Image J软件分析条带灰度值，计算各组目的蛋白的相对表达水平。由于 GAPDH(36 kD)与α-平滑肌肌动蛋白(42 kD)、骨形态发生蛋白2(44 kD)分子质量相近，为避免条带重叠与显影串扰，故将这些蛋白采用洗膜的方法，放在独立膜上检测分子质量，同时保证目标蛋白与内参来自同一块膜：按照上述方法，将裂解细胞后离心的上清液，用SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移到PVDF膜上，5%牛血清蛋白封闭，加入一抗(α-平滑肌肌动蛋白，1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜后室温下二抗(1∶5 000)孵育60 min，加入ECL试剂显影。用Stripping Buffer在37 ℃条件下洗脱膜上的抗体30 min，再用TBST彻底洗膜，重新用5%牛血清蛋白封闭，加入GAPDH一抗(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜后室温下二抗(1∶5 000)孵育60 min，加入ECL试剂显影，用Image J软件分析条带灰度值，计算各组α-平滑肌肌动蛋白与GAPDH蛋白的相对表达水平；采用同样的方法检测骨形态发生蛋白2与GAPDH蛋白的相对表达水平(条件均保持一致)。
1.4.13 ELISA检测RhoA-GTP蛋白水平 各组细胞干预48 h后，用RIPA裂解液裂解，离心取上清液，按照小鼠转化蛋白 RHOA-GTP ELISA检测试剂盒说明检测上清液中RhoA-GTP水平。
1.4.14 Western blot检测细胞RhoA/ROCK通路ROCK1、p-ROCK1蛋白表达 各组细胞干预48 h后，用RIPA裂解液裂解细胞，离心取上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度，用SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移到PVDF膜上，5%牛血清蛋白封闭，加入一抗(ROCK1，1∶1 000；GAPDH，1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜后室温下二抗(1∶5 000)孵育60 min，加入ECL试剂显影。用Stripping Buffer在37 ℃条件下洗脱膜上的抗体30 min，再用TBST彻底洗膜后，重新用5%牛血清蛋白封闭，加入p-ROCK1一抗(1∶1 000；GAPDH，1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜后室温下二抗(1∶5 000)孵育60 min，加入ECL试剂显影，用Image J软件分析条带灰度值，计算各组ROCK1、p-ROCK1蛋白的相对表达。
1.5 主要观察指标 ①淫羊藿类外泌体囊泡的形态及大小；②淫羊藿类外泌体囊泡对主动脉平滑肌细胞活性的影响；③主动脉平滑肌细胞对淫羊藿类外泌体囊泡的摄取情况；④淫羊藿类外泌体囊泡中与RhoA/ROCK通路密切相关的蛋白；⑤主动脉平滑肌细胞钙化面积；⑥淫羊藿类外泌体囊泡对主动脉平滑肌细胞的抗凋亡作用；⑦主动脉平滑肌细胞成骨表型Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2、α-平滑肌肌动蛋白、平滑肌22α蛋白表达水平；⑧主动脉平滑肌细胞RhoA/ROCK通路RhoA-GTP、ROCK1、p-ROCK1蛋白表达水平。
1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 10.1.2软件进行统计学分析，数据以x±s表示，数据符合正态性分布，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，不符合正态性采用非参数检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已由广西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

植物来源细胞外囊泡是一类由植物细胞分泌释放的纳米级膜性囊泡，含有丰富的蛋白质、脂质、核酸及多种活性代谢产物，可以通过胞吞作用进入靶细胞，发挥抗炎、抗氧化、促进细胞修复和改善组织功能等多种生物学效应[38]。与动物来源外泌体相比，植物来源外泌体因独特优势，在心血管疾病治疗领域中展现出了广泛的研究与应用前景[39-40]。越来越多的研究已经证实了植物来源外泌体改善心血管疾病的有效性，如研究发现葡萄柚来源外泌体能够作为高效药物载体，靶向递送硫代硫酸钠至血管的钙化部位，可有效抑制血管平滑肌细胞的成骨转分化，减少钙化斑块的形成，表现出明确的血管保护效应[41]。瓜蒌类外泌体囊泡通过抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎性小体活化来减少炎症因子释放，可有效改善动脉粥样硬化的血管炎症[42]。鳄梨来源细胞外囊泡可作为天然纳米载体递送药物，能抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体及核因子κB信号通路的活化，下调血管壁促炎与促粥样硬化因子的表达，从而减轻血管炎症并延缓动脉粥样硬化进程[43]。丹参来源外泌体能显著促进人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移，修复损伤的血管，从而改善血流和氧气供应，可有效抑制动脉粥样硬化[44]。然而，淫羊藿本身存在成分复杂、生物利用度较低等限制，制约了临床疗效。植物来源外泌体作为天然的药物递送载体，不仅能提高药物的生物利用度，还能降低免疫原性，增强组织细胞的靶向性[45]。此次研究采用超速离心法结合蔗糖密度梯度离心法对淫羊藿类外泌体囊泡进行纯化，经透射电镜观察形态、纳米粒径检测、颗粒浓度分析等多种鉴定方法，得到了在50-200 nm之间的纳米尺度双层膜囊泡颗粒，共聚焦成像显示淫羊藿类外泌体囊泡可被主动脉平滑肌细胞呈时间依赖性摄取，表明淫羊藿类外泌体囊泡具有生物活性，为后续进一步机制研究提供了可靠的材料与方法学基础。
蛋白质组学是一门系统性研究细胞、组织或生物体中全部蛋白质表达与功能的技术，通过对蛋白表达水平、翻译后修饰以及蛋白相互作用的分析，可以深入揭示疾病发生、发展机制及药物作用的分子基础[46-47]。数据非依赖采集质谱技术是近年来蛋白组学领域的一项重要进展，与传统数据依赖采集技术相比，数据非依赖采集质谱在蛋白鉴定的数量和准确性上均有显著提升，能够高效、全面地分析复杂样本中的蛋白质组，适合对未知或复杂机制进行探索[48-49]。此研究利用数据非依赖采集蛋白组学技术对淫羊藿类外泌体囊泡蛋白组成进行鉴定和分析，发现了37种特异性蛋白，其中包括Actin-related protein、Heat shock protein 90、14-3-3 protein、Elongation factor 1-alpha和Histone H4等植物来源外泌体常见的蛋白，这些蛋白在细胞代谢调控、信号转导和应激反应过程中发挥关键作用[50-51]。
14-3-3蛋白已被证明在维持细胞骨架稳定、调节细胞凋亡和炎症信号传导等生物过程中发挥重要作用[52-53]；Heat shock protein 90则通过调控蛋白质折叠及稳定性，参与细胞的应激保护与炎症调控[54]。GO功能富集分析与蛋白互作网络分析显示，淫羊藿类外泌体囊泡中的蛋白质可能通过调控多种代谢、信号转导及应激反应途径发挥协同作用，从而参与淫羊藿类外泌体囊泡的生物学效应，因此具有潜在的治疗血管钙化及相关疾病的应用价值。此研究采用的蛋白组学技术，不仅全面揭示了淫羊藿类外泌体囊泡所含蛋白质的种类及潜在功能，还为进一步阐明改善血管钙化的作用机制提供了支持，同时也为淫羊藿类外泌体囊泡在心血管疾病领域的应用提供了坚实的理论与实验基础。然而，蛋白组学技术本身也存在一定局限性，此研究所鉴定的蛋白质功能多为预测性的理论分析，尚缺乏深入的功能验证实验。后续研究应进一步针对具体关键蛋白进行功能学验证(如基因敲低、过表达等)，并结合转录组学、代谢组学和细胞功能验证，进一步确定关键蛋白质的具体生物功能和下游作用途径，以更加精准地揭示淫羊藿类外泌体囊泡改善血管钙化的作用机制。
近年来，中药成分在调控RhoA/ROCK通路、保护细胞和治疗心血管疾病方面表现出良好的疗效与潜力。例如，中药丹参酮ⅡA能够通过抑制RhoA/ROCK信号活化来保护脂多糖诱导的血管内皮细胞损伤[55]。川芎嗪也可通过抑制RhoA/ROCK通路激活，发挥对内皮细胞损伤的保护作用，进而改善血管功能[56]。此外，钩藤碱也被证实可通过下调RhoA/ROCK信号通路的表达，有效改善高血压、延缓心肌纤维化病变进程[57]。以上研究提示部分中药成分具有明确调控RhoA/ROCK通路的活性，并可通过此通路改善心血管相关疾病。RhoA/ROCK通路在血管平滑肌细胞钙化病理过程中发挥关键作用也逐渐受到广泛关注，在高磷、炎症刺激或力学强度升高等促钙化微环境下，血管平滑肌细胞中的炎症因子受体招募接头蛋白或者激酶复合体，从而激活RhoGEFs刺激因子，刺激因子与磷盐共同在血管平滑肌细胞中促进RhoA由GDP结合态转为RhoA-GTP活化状态，继而进一步激活ROCK磷酸化，导致p-MLC升高与F-actin聚合，形成持续的细胞骨架张力[58]。该机械信号经核-细胞骨架偶联引发2条相反的转录通路指向：其一，平滑肌收缩程序依赖MRTF-A/B
与SRF·myocardin复合体维持α-平滑肌肌动蛋白、平滑肌22α等收缩基因表达，但在病理条件下，myocardin可被下调或抑制MRTF-A/B入核，从而削弱收缩表型[59]；其二，增强的细胞骨架张力促进YAP/TAZ核转位，上调Runt相关转录因子2与骨形态发生蛋白2等成骨相关基因[60]，伴随基质囊泡与碱性磷酸酶活性增加，最终促进钙盐沉积与钙化形成(图9)。

在此研究中，淫羊藿类外泌体囊泡干预钙化细胞后呈现出自上而下、先后对应的通路变化与表型改善：在干预48 h时，RhoA-GTP水平及p-ROCK1/ROCK1比值下降，提示RhoA/ROCK通路可能被抑制；同时，细胞骨架由粗大紊乱转为相对规整，符合通路活性下降后细胞骨架张力减轻的预期，至第7天时，Runt相关转录因子2和骨形态发生蛋白2蛋白表达下调而α-平滑肌肌动蛋白和平滑肌22α蛋白表达上调，细胞表型由成骨样趋于收缩型，并通过茜素红S染色检测显示钙盐沉积降低。上述结果在淫羊藿类外泌体囊泡低、中、高剂量组均呈同向变化，在时间与层级上呈现由通路活性减弱到细胞骨架重塑，最后到表型与终点改善的递进一致性，与RhoA/ROCK通路被抑制的生物学预期相符。综合上述研究结果，发现淫羊藿类外泌体囊泡在血管平滑肌细胞中对RhoA/ROCK信号轴产生的抑制作用与抗钙化效应相一致，揭示了淫羊藿类外泌体囊泡的抗血管钙化作用可能是通过调控RhoA/ROCK信号通路实现的，因此，靶向RhoA/ROCK信号通路可能是缓解或治疗血管钙化的有效策略之一[61-62]。综上所述，此研究基于蛋白组学分析揭示了淫羊藿类外泌体囊泡在血管钙化防治中的潜在作用机制，明确发现淫羊藿类外泌体囊泡能够有效抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化，作用机制可能与抑制RhoA/ROCK信号活性相关，从而改善细胞骨架损伤、降低细胞凋亡并抑制血管平滑肌细胞的成骨样转分化，最终产生显著的血管保护效应。此研究采用了蛋白质组学技术，对淫羊藿类外泌体囊泡中关键功能蛋白及潜在作用机制进行了探索与分析，揭示了淫羊藿类外泌体囊泡可能抑制血管钙化的多靶点、多途径作用模式，为淫羊藿类外泌体囊泡成为心血管疾病防治的潜在新型植物来源纳米制剂提供了重要的理论依据和实验支撑。然而，此研究仍存在一些局限性与不足：尚缺乏动物实验和体内功能验证，研究结果的临床转化价值仍需进一步的动物模型研究及验证；其次，蛋白质组学分析中所揭示的蛋白功能主要基于生物信息学预测，尚缺乏深入的功能验证与机制研究。在未来研究中，尚需在细胞研究中加入相关通路抑制剂及激活剂，以加强因果性，同时进一步通过动物模型验证淫羊藿类外泌体囊泡的抗血管钙化作用，深入探索淫羊藿类外泌体囊泡中活性分子与靶细胞的特异互作机制，结合多组学技术，如转录组学、代谢组学等，从不同维度全面阐明淫羊藿类外泌体囊泡改善血管钙化的分子机制。此外，应进一步研究淫羊藿类外泌体囊泡作为药物递送载体的稳定性、生物相容性及安全性，以促进淫羊藿类外泌体囊泡在临床治疗心血管疾病领域的转化与应用。此研究为植物来源细胞外囊泡防治血管钙化及相关心血管疾病提供了新的思路与方法，也为进一步开发安全有效的新型植物来源药物或纳米药物递送系统奠定了重要的实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

淫羊藿类外泌体囊泡改善血管平滑肌细胞钙化：蛋白组学分析

Epimedium Sagittatum Maxim.-extracellular vesicles ameliorate vascular smooth muscle cell calcification: a proteomic analysis

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[1]	金东升, 赵张红, 朱子银, 张森, 孙祖延, 邓江. 淫羊藿苷缓释微球三维支架对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1658-1668.
[2]	陈钰璘, 何莹莹, 胡凯, 陈枝凡, 聂莎, 蒙衍慧, 李闰珍, 张小朵, 李宇稀, 唐耀平. 瓜蒌类外泌体囊泡防治动脉粥样硬化的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1768-1781.
[3]	李林臻, 焦泓焯, 陈伟南, 张铭哲, 王建龙, 张君涛. 淫羊藿苷含药血清对脂多糖诱导人软骨细胞炎症损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1368-1374.
[4]	陈伟南, 李玉生, 李林臻, 焦泓焯, 张铭哲, 王建龙, 张君涛. 淫羊藿苷含药血清药效物质对炎性软骨细胞作用的代谢组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(36): 9429-9436.
[5]	朱礼丰, 王文驰, 刘强, 崔宪钦, 章震浩, 黄杰, 吕柱成, 王磊航, 崔伟. 淫羊藿苷防治骨质疏松症的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(35): 9248-9257.
[6]	赵张红, 金东升, 阮世强, 黄文良, 万喻, 田仁元, 邓江. 淫羊藿苷缓释微球三维支架的体外促成骨与抗炎性能[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(26): 6710-6718.
[7]	王子奇, 卜献忠, 郭晓辉, 李寒曦, 钱煜昊, 王奕鑫, 卜保献. 整合蛋白质组学、转录组学分析补阳还五汤保护急性脊髓损伤模型大鼠的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(25): 6472-6488.
[8]	刘瑾薇, 张丹, 郭红丽, 陈欢, 李晶晶, 曹纬国. 蛋白质组学和代谢组学联合应用分析冠心病模型小鼠的病理机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(25): 6544-6553.
[9]	周天乐, 王威, 张志文, 刘曦明. 转录组学和蛋白质组学技术在椎间盘退行性变研究中的应用与进展[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(23): 5925-5933.
[10]	詹蕾, 吴丽娜, 李欢, 刘敏, 陈涛, 蒲小兵, 周长春. 负载淫羊藿苷的丝素蛋白水凝胶促进腱骨愈合[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(20): 5178-5787.
[11]	梁周, 潘成镇, 陈锋, 张驰, 杨博, 韦宗波, 蒙建华, 周砫. 骨质疏松相关外泌体诊断标志物的鉴定与药物初筛[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(13): 3458-3473.
[12]	刘琪, 李林臻, 李玉生, 焦泓焯, 杨程, 张君涛. 淫羊藿苷含药血清促进3种细胞共培养体系中软骨细胞增殖和干细胞成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1371-1379.
[13]	喻婷, 吕冬梅, 邓浩, 孙涛, 程钎. 淫羊藿苷预处理增强人牙周膜干细胞对M1型巨噬细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1328-1335.
[14]	张艺璇, 李东娜, 刘春艳. 牙周炎的病理过程、炎症反应及相关生物标志物：多组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7601-7610.
[15]	王凯茹, 付士哲, 李家辉, 燕茹, 马玉茹, 师波, 冶从燕, 闫瑞, 丛广志, 贾绍斌. 亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶1参与血管平滑肌细胞钙化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(32): 6836-6842.