黄精多糖促进脂肪干细胞成软骨分化的分子机制

doi:10.12307/2026.435

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (31): 8060-8067.doi: 10.12307/2026.435

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黄精多糖促进脂肪干细胞成软骨分化的分子机制

陈俊杰1，何佳洋2，王子赫1，彭腾3，刘映岐4，5，李森6，李敬池7，汪国友1，8，李婷9，余婉欣10，沈骅睿1，8

西南医科大学附属中医医院，1关节外科，7脊柱外科，8骨科，泸州市骨科疾病重点实验室，四川省泸州市 646000；2西南医科大学，四川省泸州市 646000；3成都中医药大学药学院，四川省成都市 611137；4西南大学材料与能源学院，重庆市 400715；5西南大学附属医院，重庆市 400700；6南京大学医学院附属鼓楼医院骨科，江苏省南京市 210003；9西南医科大学药学院，四川省泸州市 646000；10上海交通大学生物医学工程学院& Med-X研究院，上海市 200030

收稿日期:2025-10-17 接受日期:2026-01-29 出版日期:2026-11-08 发布日期:2026-05-22
通讯作者: 沈骅睿，硕士，主任中医师，西南医科大学附属中医医院，关节外科，骨科，泸州市骨科疾病重点实验室，四川省泸州市 646000
作者简介:陈俊杰，男，1999年生，成都中医药大学在读博士，医师，主要从事骨关节疾病的研究。
基金资助:
四川省科技计划资助(2024NSFSC0570)，项目负责人：沈骅睿；西南医科大学项目(2023ZYYJ05)，项目负责人：沈骅睿；四川省中医药管理局项目(2024zd018)，项目负责人：沈骅睿；泸州市人民政府-西南医科大学科技战略合作项目(2021LZXNYD-J31)，项目负责人：沈骅睿；2022年西南医科大学附属中医医院科研团队培育项目(2022-CXTD-08)，项目负责人：沈骅睿；重庆市自然科学基金面上项目(CSTB2023NSCQ-MSX0644)，项目负责人：刘映岐；重庆市中医药重点建设学科西南大学中医康复学(2021-4322190044)，项目负责人：刘映岐

Molecular mechanism of polygonatum sibiricum polysaccharide-promoted chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells

Chen Junjie1, He Jiayang2, Wang Zihe1, Peng Teng3, Liu Yingqi4, 5, Li Sen6, Li Jingchi7, Wang Guoyou1, 8, Li Ting9, Yu Wanxin10, Shen Huarui1, 8

1Department of Joint Surgery, Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 3School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan Province, China; 4School of Materials and Energy, Southwest University, Chongqing 400715, China; 5Affiliated Hospital of Southwest University, Chongqing 400700, China; 6Department of Orthopedics, Gulou Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School, Nanjing 210003, Jiangsu Province, China; 7Department of Spinal Surgery, Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 8Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Southwest Medical University, Key Laboratory of Orthopedic Diseases, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 9School of Pharmacy, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 10School of Biomedical Engineering & Med-X Institute, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China

Received:2025-10-17 Accepted:2026-01-29 Online:2026-11-08 Published:2026-05-22
Contact: Shen Huarui, MS, Chief physician, Department of Joint Surgery, Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Southwest Medical University, Key Laboratory of Orthopedic Diseases, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Chen Junjie, MD candidate, Physician, Department of Joint Surgery, Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
Sichuan Provincial Science and Technology Plan, No. 2024NSFSC0570 (to SHR); Southwest Medical University Project, No. 2023ZYYJ05 (to SHR); Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine Project, No. 2024zd018 (to SHR); Luzhou Municipal Government-Southwest Medical University Science and Technology Strategic Cooperation Project, No. 2021LZXNYD-J31 (to SHR); 2022 Research Team Cultivation Project of Southwest Medical University Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, No. 2022-CXTD-08 (to SHR); Chongqing Municipal Natural Science Foundation (General Program), No. CSTB2023NSCQ-MSX0644 (to LYQ); Chongqing Municipal Key Construction Discipline of Traditional Chinese Medicine-Southwest University Traditional Chinese Medicine Rehabilitation, No. 2021-4322190044 (to LYQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

黄精多糖：是以→6)-β-D-Fruf-(2→为主链，两→1)-β-D-Furf-(2→为侧链的果聚糖单体，有降血脂、抗衰老、抗病毒、提高免疫力的作用。
转化生长因子β3/Smad2通路：转化生长因子β3通过Smad蛋白介导信号通路的方式，调节细胞中的基因转录过程，进而对细胞的分化以及增殖具有调节作用。

摘要
背景：黄精多糖作为中药黄精的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化及促进组织修复的作用。近年来研究表明，黄精多糖在骨与软骨代谢中可能发挥重要作用。
目的：探讨黄精多糖联合转化生长因子β3诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的效果及机制。
方法：采用酶消化法从大鼠腹股沟脂肪分离脂肪干细胞。首先采用CCK-8法检测不同质量浓度黄精多糖对脂肪干细胞增殖的影响，以筛选最佳促增殖质量浓度，然后将脂肪干细胞分为4组进行成软骨诱导分化：对照组、黄精多糖组、转化生长因子β3组、黄精多糖+转化生长因子β3组，通过细胞形态学观察、甲苯胺蓝染色、免疫荧光染色及Western blot检测软骨分化标志物的表达；采用Western blot检测转化生长因子β3/Smad2信号通路相关蛋白表达。为验证黄精多糖与转化生长因子β3是否通过转化生长因子β3/Smad2通路调控软骨分化，使用转化生长因子β受体激酶抑制剂SB-505124对通路进行特异性阻断，将脂肪干细胞分为5组：对照组、抑制剂组、黄精多糖+抑制剂组、转化生长因子β3+抑制剂组、黄精多糖+转化生长因子β3+抑制剂组，采用Western blot检测软骨分化标志物和转化生长因子β3/Smad2信号通路相关蛋白表达。

结果与结论：①CCK-8实验确定5 mg/L 黄精多糖为最佳干预质量浓度；②甲苯胺蓝染色显示，黄精多糖组、转化生长因子β3组及黄精多糖+ 转化生长因子β3组的蓝染面积均显著高于对照组(P < 0.05)；③细胞免疫荧光染色进一步证实，与对照组相比，黄精多糖组、黄精多糖+转化生长因子β3组的Ⅱ型胶原α1链荧光强度显著增强，其中黄精多糖+转化生长因子β3组荧光强度最高(P < 0.05)；④Western blot检测显示，与对照组相比，黄精多糖组、转化生长因子β3组及黄精多糖+转化生长因子β3组均能显著上调p-Smad2/Smad2以及软骨标志物Ⅱ型胶原α1链、Sox9、聚集蛋白聚糖的蛋白表达水平(P < 0.05)，且联合处理组上述指标蛋白表达量最高(P < 0.05)；⑤加入转化生长因子β受体激酶抑制剂后，与抑制剂组相比，其余组上述蛋白表达显著升高(P < 0.05)。结果表明，黄精多糖通过激活转化生长因子/Smad2信号通路进而诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化。

https://orcid.org/0009-0002-4929-7506(陈俊杰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 软骨损伤, 黄精多糖, 转化生长因子β3/Smad信号通路, 脂肪干细胞, 成软骨诱导, 骨关节炎, 转化生长因子β3, 细胞分化

Abstract: BACKGROUND: Polygonatum sibiricum polysaccharide is the main active component of the traditional Chinese medicine polygonatum and has anti-inflammatory, antioxidant, and tissue repair properties. Recent studies have shown that polygonatum sibiricum polysaccharide may play an important role in bone and cartilage metabolism.
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of polygonatum sibiricum polysaccharide combined with transforming growth factor-β3 on inducing the differentiation of rat adipose-derived stem cells into chondrocytes.
METHODS: Adipose-derived stem cells were isolated from rat inguinal fat using enzymatic digestion. First, the effect of different mass concentrations of polygonatum sibiricum polysaccharide on adipose-derived stem cell proliferation was detected using the CCK-8 assay to screen for the optimal proliferative concentration. Then, adipose-derived stem cells were divided into four groups for chondrogenic differentiation induction: control group, polygonatum sibiricum polysaccharide group, transforming growth factor β3 group, and polygonatum sibiricum polysaccharide + transforming growth factor β3 group. Cell morphology observation, toluidine blue staining, immunofluorescence staining, and western blot assay were used to detect the expression of chondrogenic differentiation markers. Western blot assay was used to detect the expression of related proteins in the transforming growth factor β3/Smad2 signaling pathway. To verify whether polygonatum sibiricum polysaccharide and transforming growth factor β3 regulate chondrogenic differentiation through the transforming growth factor β3/Smad2 pathway, the transforming growth factor β3 receptor kinase inhibitor SB-505124 was used to specifically block the pathway. Adipose-derived stem cells were divided into five groups: control group, inhibitor group, polygonatum sibiricum polysaccharide + inhibitor group, transforming growth factor β3 + inhibitor group, and polygonatum sibiricum polysaccharide + transforming growth factor β3 + inhibitor group. Western blot assay was used to detect the expression of cartilage differentiation markers and proteins related to the transforming growth factor β3/Smad2 signaling pathway.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The CCK-8 assay determined that 5 mg/L of polygonatum sibiricum polysaccharide was the optimal intervention concentration. (2) Toluidine blue staining showed that the blue-stained area in the polygonatum sibiricum polysaccharide group, transforming growth factor β3 group, and polygonatum sibiricum polysaccharide + transforming growth factor β3 group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). (3) Immunofluorescence staining further confirmed that compared with the control group, the fluorescence intensity of type II collagen α1 chain was significantly enhanced in the polygonatum sibiricum polysaccharide group and the polygonatum sibiricum polysaccharide + transforming growth factor β3 group, with the highest fluorescence intensity in the polygonatum sibiricum polysaccharide + transforming growth factor β3 group (P < 0.05). (4) Western blot assay showed that compared with the control group, the polygonatum sibiricum polysaccharide group, transforming growth factor β3 group, and polygonatum sibiricum polysaccharide + transforming growth factor β3 group significantly upregulated the p-Smad2/Smad2 and the protein expression levels of cartilage markers type II collagen α1 chain, Sox9, and aggrecan (P < 0.05), and the combined treatment group showed the highest protein expression levels of these indicators (P < 0.05). (5) After adding the transforming growth factor β receptor kinase inhibitor, compared with the inhibitor group, the protein expression levels of the above indicators were significantly increased in the other groups (P < 0.05). The results indicate that polygonatum sibiricum polysaccharide induces the differentiation of adipose-derived stem cells into chondrocytes by activating the transforming growth factor β/Smad2 signaling pathway.

Key words: cartilage injury, polygonatum sibiricum polysaccharide, transforming growth factor β3/Smad signaling pathway, adipose-derived stem cells, chondrogenic induction, osteoarthritis, transforming growth factor-β3, cell differentiation

中图分类号:

陈俊杰, 何佳洋, 王子赫, 彭腾, 刘映岐, 李森, 李敬池, 汪国友, 李婷, 余婉欣, 沈骅睿. 黄精多糖促进脂肪干细胞成软骨分化的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(31): 8060-8067.

Chen Junjie, He Jiayang, Wang Zihe, Peng Teng, Liu Yingqi, Li Sen, Li Jingchi, Wang Guoyou, Li Ting, Yu Wanxin, Shen Huarui. Molecular mechanism of polygonatum sibiricum polysaccharide-promoted chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(31): 8060-8067.

图/表（结果） 7

2.1 脂肪干细胞的生长状态 培养48 h时，梭形细胞开始贴壁生长，细胞大小不同、分布不均。培养4-7 d时，细胞生长更为密集，融合率超过90%。传代后，贴壁的长梭形细胞数量增加，排列更整齐，细胞大小均匀。在培养9-12 d期间，细胞持续增殖，形态保持一致，呈梭形生长。到第3代时，细胞生长活力仍然旺盛，24 h内完成贴壁，4-7 d融合率超90%，形态为梭形或不规则形，且第3代细胞的形态与生长模式无明显变化，与光学显微镜下脂肪干细胞的特征相符，见图2。

2.2 流式细胞学鉴定结果 脂肪干细胞高表达干细胞表面标志物CD29(95.6%)、CD90(96.7%)和CD44(90.3%)，低表达造血干细胞表面标志物CD45(1.2%)以及M1巨噬细胞表达物CD11b(0.6%)，见图3。这一细胞表面抗体表达模式进一步确认了脂肪干细胞的典型特征。

2.3 CCK-8实验结果 如图4所示，在干预24 h时，5 mg/L黄精多糖组细胞吸光度值显著高于对照组(P < 0.000 1)，2.5 mg/L黄精多糖组细胞吸光度值也与对照组存在显著差异(P < 0.01)，而1.25，10，20，40，80 mg/L黄精多糖组细胞吸光度值与对照组之间无统计学差异；在干预48 h时，5 mg/L黄精多糖组细胞吸光度值显著高于对照组(P < 0.001)，1.25，2.5，10，20，40，80 mg/L黄精多糖组细胞吸光度值与对照组之间无统计学差异；在干预72 h时，5 mg/L黄精多糖组细胞吸光度值显著高于对照组(P < 0.000 1)，10，20 mg/L黄精多糖组细胞吸光度值也与对照组存在显著差异(P < 0.001)，而1.25，2.5，40，80 mg/L黄精多糖组细胞吸光度值与对照组之间无统计学差异。综上，黄精多糖对脂肪干细胞增殖具有明显的时间和浓度依赖性，其中5 mg/L黄精多糖在24，48，72 h 3个时间点均表现出较显著的促生长作用，高质量浓度(40，80 mg/L)或过低质量浓度(1.25，2.5 mg/L，部分时间点)则未体现出明显的促生长或抑制效应，与对照组无明显差异。

2.4 甲苯胺蓝染色结果 诱导第7天时，对照组仅有微量甲苯胺蓝着色，而黄精多糖组、转化生长因子β3组及联合处理组的细胞外基质均呈浅蓝色。其中，黄精多糖组和转化生长因子β3组的细胞外基质仅显示轻度蓝色染色，呈现弱阳性反应；联合处理组则表现出强烈的阳性表达，且细胞形态更接近软骨细胞特征，见图5。

2.5 免疫荧光染色结果 采用免疫荧光方法检测脂肪干细胞成软骨分化后Ⅱ型胶原α1链蛋白表达，结果显示，黄精多糖组、联合处理组平均荧光表达强于对照组，其中联合处理组荧光强度较高；黄精多糖组荧光强度略高于转化生长因子β3组，转化生长因子β3组荧光强度略高于对照组，但无统计学差异(P > 0.05)，对照组有少量荧光表达，见图6。

2.6 Western blot检测相关蛋白表达 黄精多糖组和联合处理组p-Smad2/Smad2比值均显著高于对照组(P < 0.05)，转化生长因子β3组p-Smad2/Smad2比值略高于对照组，但无统计学差异(P > 0.05)，其中联合处理组p-Smad2/Smad2比值最高。黄精多糖组和转化生长因子β3组Ⅱ型胶原α1链表达轻度升高但无组间差异，而联合处理组Ⅱ型胶原α1链表达显著高于对照组(P < 0.05)。黄精多糖组和联合处理组Sox9蛋白表达显著高于对照组(P < 0.05)。各组聚集蛋白聚糖蛋白表达均呈上调趋势，联合处理组聚集蛋白聚糖蛋白表达最高，显著高于对照组(P < 0.001)，高于黄精多糖组和转化生长因子β3组，但与黄精多糖组和转化生长因子β3组无统计学差异(P > 0.05)。结果表明，黄精多糖与转化生长因子β3协同激活转化生长因子β/Smad通路(p-Smad2/Smad2比值升高)，显著促进软骨基质相关蛋白(Ⅱ型胶原α1链、Sox9、聚集蛋白聚糖)的表达，且整体效果优于单独处理，见图7。

2.7 转化生长因子抑制实验 与对照组相比，黄精多糖+抑制剂组、转化生长因子β3+抑制剂组、黄精多糖+转化生长因子β3+抑制剂组、抑制剂组p-Smad2/Smad2比值均显著下降(P < 0.000 1)。与对照组相比，黄精多糖+抑制剂组、转化生长因子β3+抑制剂组、抑制剂组Sox9蛋白表达均显著下降(P < 0.01，(P < 0.01，P < 0.001)；与抑制剂组相比，黄精多糖+转化生长因子β3+抑制剂组Sox9蛋白表达显著上升(P < 0.05)。与对照组相比，转化生长因子β3+抑制剂组、黄精多糖+转化生长因子β3+抑制剂组、抑制剂组聚集蛋白聚糖蛋白表达均显著下降(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.000 1)；与抑制剂组相比，黄精多糖+转化生长因子β3+抑制剂组、转化生长因子β3+抑制剂组、黄精多糖+抑制剂组聚集蛋白聚糖蛋白表达均显著上升(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，见图8。

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引言

骨关节炎是一种以关节软骨破坏进展为特征的慢性进展性疾病，临床主要以负重关节的进行性功能障碍为特征[1]。随着全球老龄人口的增多，骨关节炎的发病率也逐年上升，已成为公共的健康问题[2]。虽然现有的药物可以减缓疾病的发展，但仍有局限[3]，开发新型治疗药物及探索关键作用靶点已成为当前骨关节炎防治研究的重点方向[4-5]。
间充质干细胞软骨向分化潜能的发现具有里程碑意义[6]。2008年，CENTENO等[7]报道了间充质干细胞在人体软骨再生中的应用，随后于2010年进一步证实了该技术的临床安全性[8]。2001年，脂肪组织间充质干细胞被提取出来，并定义为脂肪衍生干细胞[9-11]。大量临床前研究证实脂肪干细胞在骨关节炎和软骨缺损治疗中具有明确疗效[12-15]。
在传统中医系统中，黄精主要具有养阴润肺、滋肾益精、补脾益气之功效，可填精髓、补虚损[16-17]。现代研究表明，黄精有效成分黄精多糖有调节脂质代谢、抗氧化、抑菌、免疫等药理作用，张磊等[18]发现miR-204与黄精多糖联合应用可促进骨关节炎软骨细胞增殖并抑制凋亡；WANG等[19]通过创新性提取工艺(过热水萃取联合分级纯化技术)从药用植物中分离获得新型黄精多糖组分，在体外实验中表现出显著的抗炎效应。这些研究结果为黄精多糖具有软骨保护与抗炎双重作用提供了实验依据。
该研究通过体外实验探讨黄精多糖对脂肪干细胞的促增殖和促分化效果，检测成软骨相关标志物表达水平，探讨黄精多糖促进脂肪干细胞成软骨分化的具体作用机制，为开发新的软骨诱导剂提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年4月至2024年6月在西南医科大学附属中医医院·泸州市中西医结合骨伤疾病防治重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠8只，1月龄，体质量(120±5) g，由西南医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(川)2023-0017。所有动物实验操作均严格遵循国际实验动物评估和认证委员会(AAALAC)的规范要求，并符合中国《实验动物管理条例》(国务院令第676号)的伦理标准。研究方案已通过四川省实验动物伦理委员会审批(批准号：SWMU20220121)。

1.3.2 实验试剂 黄精多糖(成都中医药大学彭腾教授团队馈赠，HPLC≥99%，均一)(图1)；DMEM/F12培养基(普诺赛生物，中国，货号PM150312)；α-MEM基础培养基(Gibco公司，美国，货号8122744)；胎牛血清(Gibco公司，美国，货号2375386CP)；CCK-8细胞增殖检测试剂盒(宝光生物，中国，货号K1018)；甲苯胺蓝染色液(索莱宝生物，中国，货号G3661)；流式抗体：PE标记抗大鼠CD11b(BioLegend公司，美国，货号01807)、FITC标记抗大鼠CD90(BioLegend公司，美国，货号206105)、FITC标记抗大鼠CD29(BioLegend公司，美国，货号102205)、PE标记抗大鼠CD45(BioLegend公司，美国，货号202207)；FITC标记羊抗兔IgG二抗(亲科生物，中国，货号S0008)；Western blot和免疫荧光检测一抗：Smad2抗体(亲科生物，中国，货号AF6449)、p-Smad2抗体(亲科生物，中国，货号AF3450)、Ⅱ型胶原抗体(亲科生物，中国，货号28459-1-AP)、Sox9抗体(亲科生物，中国，货号AF6330)；重组转化生长因子β3蛋白(诺唯赞生物，中国，货号CJ44)；转化生长因子β受体激酶抑制剂SB-505124(TargetMol/陶术，中国，T2462)。

1.3.3 主要仪器、设备 水平摇床(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；高速冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；生物安全柜(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；普通冰箱(4 ℃/-20 ℃，海尔集团，中国)；超低温冰箱(-80 ℃，Thermo Fisher Scientific公司，美国)；正置光学显微镜(ZEISS公司，德国)；倒置荧光显微镜(Nikon公司，日本)；恒温水浴箱(国华仪器，中国)；显微图像采集系统(Leica公司，美国)；转印系统(Bio-Rad公司，美国)；超声波细胞破碎仪(Branson公司，美国)；自动细胞计数仪(DeNovix公司，美国)；二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；低速离心机(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；精密电子天平(OHAUS公司，美国)；多功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；超纯水系统(Millipore公司，美国)；脱色摇床(预明仪器，中国)；化学发光成像系统(勤翔科技，中国)；电泳系统(Bio-Rad公司，美国)；高压蒸汽灭菌锅(新华医疗，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 黄精多糖工作液制备 精密称取10 mg黄精多糖标准品，加入1 mL α-MEM基础培养基充分溶解，转移至无菌离心管中，置于37 ℃恒温水浴中辅以超声处理30 min以确保完全溶解。经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，获得10 mg/mL的黄精多糖母液，分装后于-20 ℃保存备用。
1.4.2 脂肪干细胞的分离与体外培养 无菌条件下将SD大鼠麻醉后立刻分离腹股沟及附睾区域脂肪，用预冷的PBS反复冲洗组织3次，彻底去除血细胞及结缔组织。将纯化后的脂肪组织剪碎至约1 mm3大小，按1∶3比例加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化液，37 ℃恒温振荡(200 r/min)消化50 min；终止消化后，依次通过100 μm和70 μm细胞筛过滤，离心(1 000 r/min，5 min)收集细胞沉淀；用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM完全培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度的培养箱培养；48 h后首次换液，去除未贴壁细胞，待细胞融合度达80%-90%时进行传代培养。
1.4.3 脂肪干细胞表面标志物鉴定 取第3代脂肪干细胞，制备单细胞悬液(细胞浓度为1×109 L-1)。取100 μL细胞悬液与荧光标记抗体(CD11b-PE、CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE、CD90-FITC)避光孵育30 min，PBS洗涤2次，采用流式细胞术检测表面标志物的表达，分析细胞纯度及间充质干细胞特性。
1.4.4 黄精多糖对脂肪干细胞增殖活性的影响 第3代脂肪干细胞以每孔5×103细胞密度接种于96孔板，设置8个浓度梯度(80，40，20，10，5，2.5，1.25，0 mg/L)，每个质量浓度设5个复孔，并设立空白对照组。干预后24，48，72 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，计算细胞相对增殖率。
1.4.5 实验分组 第3代脂肪干细胞以每孔8×104细胞密度接种于6孔板，分为4组：对照组、黄精多糖组、转化生长因子β3组、联合处理组(黄精多糖+转化生长因子β3组)。在细胞融合度达到80%-90%后，弃去原培养基，更换为相应的含诱导因子(如黄精多糖、转化生长因子β3)的培养基。对照组更换为含体积分数10%胎牛血清与100 U/mL青霉素、链霉素双抗的α-MEM基础培养基；黄精多糖组在对照组培养基中添加5 mg/L黄精多糖；转化生长因子β3组在对照组培养基中添加10 ng/mL转化生长因子β3(药物说明书推荐用量)；联合处理组在对照组培养基中添加10 ng/mL转化生长因子β3与5 mg/L黄精多糖。
1.4.6 Western blot检测Ⅱ型胶原α1链、聚集蛋白聚糖、Sox9、Smad2及p-Smad2蛋白表达水平 各组脂肪干细胞干预7 d，弃去培养基，用预冷的PBS轻柔漂洗2次，每孔加入200 μL RIPA裂解液(含1% PMSF和1%磷酸酶抑制剂)于冰上裂解30 min，期间每隔10 min晃动数次以确保充分裂解。用细胞刮将裂解物收集至预冷的1.5 mL离心管中，于4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min，小心吸取上清液即为总蛋白样品。采用BCA法测定蛋白浓度，并根据测定结果用裂解液和5×Loading Buffer将各样本蛋白浓度调整至一致，于100 ℃金属浴中煮沸10 min使蛋白变性，分装后于-80 ℃保存备用。取等量蛋白(30 μg)进行SDS-PAGE电泳(浓缩胶80 V，30 min；分离胶120 V，60 min)，随后通过湿转法(300 mA，90 min)将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭液室温封闭2 h后，弃去封闭液，直接加入按如下比例稀释的一抗：p-Smad2 (1∶1 000)、Smad2 (1∶2 000)、 Ⅱ型胶原α1链(1∶1 000)、聚集蛋白聚糖(1∶1 000)、Sox9 (1∶ 1 000) 及GAPDH (1∶5 000)，4 ℃摇床孵育过夜；次日，回收一抗，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min，随后加入相应种属的HRP标记山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，再用TBST洗涤3次，每次10 min；最后，按1∶1比例混合ECL化学发光试剂A液与B液，均匀滴加至膜上，使用化学发光成像系统采集图像。采用Image J软件对目标条带的灰度值进行分析，以GAPDH作为内参计算目标蛋白的相对表达量。
1.4.7 抑制剂干预实验 在1.4.5分组基础上，增设抑制剂干预组。使用转化生长因子β受体激酶抑制剂SB-505124(ANT)对通路进行特异性阻断，该抑制剂使用二甲基亚砜溶解配制为10 mmol/L的储存液并于-20 ℃保存，临用前以完全培养基稀释至工作浓度10 μmol/L。实验共设5组：对照组(常规培养)、抑制剂组(加入10 μmol/L SB-505124)、黄精多糖+抑制剂组(含5 mg/L黄精多糖及10 μmol/L SB-505124)、转化生长因子β3+抑制剂组(含10 ng/mL转化生长因子β3及10 μmol/L SB-505124)以及黄精多糖+转化生长因子β3+抑制剂组(含5 mg/L黄精多糖、10 ng/mL转化生长因子β3及10 μmol/L SB-505124)。各组细胞在诱导分化开始时即加入抑制剂或等体积溶剂对照(二甲基亚砜终浓度< 0.1%)，干预培养7 d，按照1.4.6所述方法收集细胞蛋白样品，通过Western blot法检测Smad2、p-Smad2及软骨分化标志物(Ⅱ型胶原α1链、Sox9、聚集蛋白聚糖)的蛋白表达水平。
1.4.8 甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达 取根据1.4.5分组干预处理7 d后的细胞，弃去培养基，用预冷的PBS轻柔漂洗3次，每次5 min，每孔加入40 g/L多聚甲醛溶液1 mL，室温固定15 min，弃去固定液，PBS漂洗3次，每次5 min，每孔加入0.1%甲苯胺蓝染色液(pH 2.5)1 mL，室温避光染色30 min，弃去染液，用0.1%冰醋酸溶液轻柔漂洗3次，每次2 min，以去除非特异性背景染色，PBS再次漂洗1次，加入1 mL PBS覆盖细胞防止干燥，于正置光学显微镜下观察并采集图像，蓝染区域表示蛋白聚糖阳性表达。使用Image J软件对蓝染面积进行半定量分析。
1.4.9 Ⅱ型胶原α1链免疫荧光染色 取根据1.4.5分组干预处理7 d后的细胞，以每孔2×10⁵细胞密度接种到6孔板，培养24 h后，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，用封闭液封闭30 min，加入Ⅱ型胶原α1链一抗(稀释比例1∶100) 4 ℃孵育过夜，次日用PBS清洗细胞后，加入二抗(稀释比例1∶400) 37 ℃孵育1 h，加入DAPI染色液染色10 min，通过倒置荧光显微镜观察并记录细胞染色情况。每组随机选取3个视野，使用Image J软件测量每个视野下Ⅱ型胶原α1链的绿色荧光强度积分吸光度值，同时以DAPI蓝色荧光标记细胞核确认视野内细胞数量基本一致。
1.5 主要观察指标 ①原代及传代后脂肪干细胞的形态学特征与生长状态；②流式细胞术检测第3代脂肪干细胞表面标志物(CD29、CD44、CD90、CD11b、CD45)的表达，以鉴定细胞纯度；③CCK-8法检测不同质量浓度黄精多糖干预24，48，72 h后对脂肪干细胞增殖活性的影响，以确定最佳促增殖质量浓度；④经不同方案(黄精多糖、转化生长因子β3、黄精多糖+转化生长因子β3)诱导分化7 d后，通过甲苯胺蓝染色定性观察细胞外基质中蛋白聚糖的分泌情况；⑤采用免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原α1链的表达与分布，并对荧光强度进行定量分析；⑥应用Western blot法检测软骨分化关键标志物(Ⅱ型胶原α1链、Sox9、聚集蛋白聚糖)及Smad2、p-Smad2的表达水平；⑦使用转化生长因子β通路抑制剂干预后，再次通过Western blot法检测上述蛋白的表达变化，以验证通路机制。

1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 9.0统计软件进行数据处理与分析。多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，若方差齐性满足，事后两两比较采用Tukey检验；若方差不齐，则采用Dunnett’s T3检验。P < 0.05为差异有显著性意义。所有实验均独立重复至少3次。统计学方法已通过西南医科大学附属中医医院生物统计学专家审核确认。

讨论

关节软骨损伤修复是骨科领域的重大挑战。由于软骨组织自我修复能力有限，损伤后往往导致骨关节炎等退行性疾病[20-22]。
目前临床治疗方法如微骨折术和人工关节置换术存在疗效有限、费用高昂及并发症多等问题，无法实现功能性软骨再生。
近年来，组织工程与再生医学为软骨修复提供了新思路。黄精作为传统中药材，具有“补中益气、除风湿、安五脏”的功效[23]。现代研究表明，黄精能补益气阴、健脾益肾，在骨病治疗中应用广泛[24]。黄精的活性成分黄精多糖具有多种药理作用，在软骨保护与修复方面表现出显著效果[25]。研究表明，黄精多糖能促进软骨细胞增殖分化[26-27]，通过激活Wnt/β-catenin信号通路诱导干细胞向成骨细胞分化[28]，同时还具有抗炎、抗氧化特性[29-30]，并能促进软骨基质合成[31]。脂肪干细胞作为重要的成体干细胞，具有多向分化潜能。自ZUK等[32]分离鉴定以来，脂肪干细胞因来源广泛、获取简便等优势成为软骨组织工程的理想种子细胞。研究表明，脂肪干细胞表达特定的表面标志物(CD29、CD44、CD90、CD105阳性；CD31、CD45、HLA-DR阴性)和多能性因子(Nanog、Oct-4、Sox2)[33-34]。目前诱导脂肪干细胞成软骨分化的策略主要包括生长因子诱导、基因调控、共培养体系等方法[35]。在软骨分化过程中，转化生长因子β3/Smad信号通路起关键调控作用[36-38]。转化生长因子β3通过激活Smad2/3磷酸化，促进p-Smad2/3与Smad4形成复合物并转入细胞核，调控下游靶基因表达[39-40]。Ⅱ型胶原α1链作为软骨细胞外基质主要成分，是软骨分化的重要标志[41]。Sox9作为关键转录因子，通过调节Ⅱ型胶原α1链、聚集蛋白聚糖等软骨特异性基因表达，维持软骨细胞表型稳定。
该研究阐明了黄精多糖促进脂肪干细胞增殖和软骨分化的作用及机制。研究发现，在1.25-80 mg/L质量浓度范围内，黄精多糖能促进脂肪干细胞增殖，其中5 mg/L质量浓度效果最佳。更重要的是，黄精多糖不仅能单独诱导软骨分化，与转化生长因子β3联合使用时产生协同增效作用。机制研究表明，黄精多糖可能通过上调Smad2磷酸化水平激活Smad信号通路。
该研究发现黄精多糖与转化生长因子β3在促进软骨分化中具有协同作用，揭示了黄精多糖通过Smad信号通路调控软骨分化的新机制，为中药活性成分在组织工程中的应用提供了实验依据。然而，该研究仍存在以下局限性：①仅在细胞水平进行实验，缺乏体内验证；尽管抑制剂实验证实黄精多糖的促软骨分化效应严格依赖于转化生长因子β3/Smad2通路的激活，但并未直接检测黄精多糖是否影响转化生长因子β3配体的表达或分泌，黄精多糖与转化生长因子β3之间表现出显著的协同效应，提示黄精多糖可能作为该通路的一个强效激活剂或敏化剂，通过上调转化生长因子β受体表达、促进受体磷酸化或抑制细胞内负反馈机制等方式发挥作用[42]，这一精确的上游机制将是未来研究的重点；②甲苯胺蓝染色作为评估软骨分化的形态学证据，主要提供了定性结果，未来研究可采用更精确的生化定量方法(如二甲亚甲基蓝法检测糖胺聚糖含量)进一步验证；③未全面评估分化软骨细胞的功能特性。值得注意的是，该研究黄精多糖的诱导分化效应是在未使用ITS、地塞米松、抗坏血酸等经典软骨诱导添加因子的基础培养基中实现的，这提示黄精多糖自身具有较强的启动软骨分化的能力。未来研究应建立动物模型验证黄精多糖的体内软骨修复效果，深入探讨黄精多糖调控Smad信号通路的分子机制，优化黄精多糖与生长因子的联合应用方案，并开展长期安全性和有效性评估。该研究为开发基于中药活性成分的软骨再生策略提供了新的思路和实验依据，具有重要的理论意义和临床应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

黄精多糖促进脂肪干细胞成软骨分化的分子机制

Molecular mechanism of polygonatum sibiricum polysaccharide-promoted chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells

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