谷氨酰胺对激素诱导骨微血管内皮细胞凋亡的影响

doi:10.12307/2026.660

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (12): 2965-2974.doi: 10.12307/2026.660

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谷氨酰胺对激素诱导骨微血管内皮细胞凋亡的影响

昝永锋，宋科官，刘玉达

哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江省哈尔滨市 150000

收稿日期:2025-03-07 接受日期:2025-07-31 出版日期:2026-04-28 发布日期:2025-09-28
通讯作者: 宋科官，主任医师，哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江省哈尔滨市 150000
作者简介:昝永锋，男，1994年生，安徽省亳州市人，汉族，哈尔滨医科大学在读硕士，主要从事骨与关节外科疾病研究。
基金资助:
黑龙江省仁芯骨健康医疗救助基金会项目(2022HX031)，项目负责人：宋科官

Glutamine regulates the effect of hormones on the apoptosis of bone microvascular endothelial cells

Zan Yongfeng, Song Keguan, Liu Yuda

The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150000, Heilongjiang Province, China

Received:2025-03-07 Accepted:2025-07-31 Online:2026-04-28 Published:2025-09-28
Contact: Song Keguan, Chief physician, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150000, Heilongjiang Province, China
About author:Zan Yongfeng, MS candidate, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150000, Heilongjiang Province, China
Supported by:
Heilongjiang Renxin Bone Health Medical Relief Foundation Project, No. 2022HX031 (to SKG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

谷氨酰胺：广泛分布于人体组织细胞中，属于非必需氨基酸。在体内，谷氨酰胺有助于促进蛋白质合成、增强免疫力、加速伤口愈合、促进细胞生长等生理功能。
磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路：是一条关键的细胞增殖与存活调节途径，它影响着细胞的增殖、凋亡、黏附、迁移及新生血管形成。

背景：糖皮质激素能够显著抑制人股骨头骨微血管内皮细胞中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B /哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)信号通路相关蛋白的表达，从而触发细胞的程序性死亡和坏死过程。已有证据表明谷氨酰胺能够激活PI3K/Akt/mTOR信号通路。
目的：探究谷氨酰胺对糖皮质激素诱导骨微血管内皮细胞凋亡的影响。
方法：从SD大鼠双侧股骨头中分离提取骨微血管内皮细胞，取传代第3代骨微血管内皮细胞，培养12 h后分4组处理：对照组常规培养
24 h，糖皮质激素组加入甲基泼尼松龙琥珀酸钠处理24 h，糖皮质激素+谷氨酰胺组加入甲基泼尼松龙琥珀酸钠处理12 h后添加谷氨酰胺处理12 h，糖皮质激素+谷氨酰胺+LY294002组加入甲基泼尼松龙琥珀酸钠处理12 h后添加谷氨酰胺处理6 h，再加入PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002处理6 h。培养结束后，AO-PI双重荧光染色及Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，RT-qPCR检测BCL-2、Bax、PI3K、Akt、mTOR mRNA表达，Western Blot检测BCL-2、Bax、PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达。
结果与结论：①糖皮质激素组细胞凋亡率高于对照组、糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)，糖皮质激素+谷氨酰胺+LY294002组细胞凋亡率高于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)；②糖皮质激素组BCL-2、PI3K、Akt、mTOR mRNA表达低于对照组、糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)，Bax mRNA表达高于对照组、糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)；糖皮质激素+谷氨酰胺+LY294002组BCL-2、PI3K、Akt、mTOR mRNA表达低于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)，Bax mRNA表达高于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)；③糖皮质激素组BCL-2、PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达低于对照组、糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)，Bax蛋白达高于对照组、糖皮质激素+
谷氨酰胺组(P < 0.05)；糖皮质激素+谷氨酰胺+LY294002组BCL-2、PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达低于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)，Bax蛋白表达高于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)；④结果表明，谷氨酰胺通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路减少糖皮质激素诱导的骨微血管内皮细胞凋亡。

https://orcid.org/0009-0003-6696-0813(昝永锋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 糖皮质激素, 凋亡, 激素性股骨头坏死, 谷氨酰胺, 内皮细胞, LY294002, 信号通路, 股骨头
缩略语：磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白：phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/Akt/mTOR

Abstract: BACKGROUND: Glucocorticoids can significantly inhibit the expression of proteins related to the phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt)/mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway in bone microvascular endothelial cells, thereby triggering programmed cell death and necrosis. Glutamine has been shown to activate the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.
OBJECTIVE: To explore how glutamine regulates the effect of glucocorticoids on the apoptosis of bone microvascular endothelial cells.
METHODS: Bone microvascular endothelial cells were extracted from the femoral head tissues of Sprague-Dawley rats under aseptic conditions. Passage 3 bone microvascular endothelial cells were cultured for 12 hours and then divided into four groups: the control group was routinely cultured for 24 hours, the glucocorticoid group was cultured with methylprednisolone sodium succinate for 24 hours, the glucocorticoid+glutamine group was cultured with methylprednisolone sodium succinate for 12 hours and then with glutamine for 12 hours, and the glucocorticoid+glutamine+LY294002 group was cultured with methylprednisolone sodium succinate for 12 hours followed by addition of glutamine treatment for 6 hours and the PI3K/Akt signaling pathway inhibitor LY294002 for 6 hours. After culture, cell apoptosis was detected by AO-PI double fluorescence staining and Annexin V/PI double staining by flow cytometry; BCL-2, Bax, PI3K, Akt, mTOR mRNA expression was detected by RT-qPCR; and western blot was used to detect BCL-2, Bax, PI3K, Akt, mTOR, p-PI3K, p-Akt, and p-mTOR protein expression.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The apoptosis rate was higher in the glucocorticoid group than in the control group and the glucocorticoid+glutamine group (P < 0.05), and the apoptosis rate was higher in the glucocorticoid+glutamine+LY294002 group than in the glucocorticoid+glutamine group (P < 0.05). (2) BCL-2, PI3K, Akt, mTOR mRNA expression in the glucocorticoid group was lower than that in the control group and glucocorticoid+glutamine group (P < 0.05), and Bax mRNA expression was higher than that in the control group and glucocorticoid+glutamine group (P < 0.05); BCL-2, PI3K, and mTOR expression in the glucocorticoid+glutamine+LY294002 group was lower than that in the glucocorticoid+glutamine group (P < 0.05), and Bax mRNA expression was higher than that in the glucocorticoid+glutamine group (P < 0.05). (3) BCL-2, PI3K, Akt, mTOR, p-PI3K, p-Akt, p-mTOR protein expression in the glucocorticoid group was lower than that in the control group and the glucocorticoid+glutamine group (P < 0.05), and Bax proteins were higher than that in the control group and the glucocorticoid+glutamine group (P < 0.05); BCL-2, PI3K, Akt, mTOR, p-PI3K, p-Akt, p-mTOR protein expression in the glucocorticoid+glutamine+LY294002 group was lower than that in the glucocorticoid+glutamine group (P < 0.05) and Bax protein expression was higher than that in the glucocorticoid+glutamine group (P < 0.05). To conclude, glutamine reduces glucocorticoid-induced apoptosis in bone microvascular endothelial cells through activation of the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Key words: glucocorticoid, apoptosis, steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, glutamine, endothelial cells, LY294002, signaling pathway, femoral head

中图分类号:

昝永锋, 宋科官, 刘玉达. 谷氨酰胺对激素诱导骨微血管内皮细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(12): 2965-2974.

Zan Yongfeng, Song Keguan, Liu Yuda. Glutamine regulates the effect of hormones on the apoptosis of bone microvascular endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(12): 2965-2974.

图/表（结果） 10

2.1 骨微血管内皮细胞的分离培养及鉴定首先从大鼠股骨头组织中(图1A)分离培养出骨微血管内皮细胞并进行传代，代至第3代时细胞多呈长梭形、多角形或分支状生长(图1B)。
免疫荧光染色结果显示，分离培养的细胞高表达CD31及血管性血友病因子(图2)，表明成功分离并获得骨微血管内皮细胞。
2.2 筛选最适的糖皮质激素、谷氨酰胺、LY294002处理浓度 10 μmol/L糖皮质激素处理后，骨微血管内皮细胞活性展现出轻微提升趋势，然而随着糖皮质激素浓度的逐渐增加，细胞活性开始受到抑制，当糖皮质激素浓度达到50 μmol/L时，骨微血管内皮细胞活性显著降低，见图3A。随着谷氨酰胺浓度从2 mmol/L提升至8 mmol/L，骨微血管内皮细胞活性未见显著改变，当谷氨酰胺浓度进一步增加至10，12 mmol/L时，骨微血管内皮细胞活性较8 mmol/L时显著降低，见图3B。随着LY294002浓度从5 μmol/L逐渐提升至25 μmol/L，骨微血管内皮细胞活性未出现明显变化，当浓度增至30，35 μmol/L时骨微血管内皮细胞活性显著降低，见图3C。所以，最终确定50 μmol/L糖皮质激素、8 mmol/L 谷氨酰胺、20 μmol/L LY294002作为细胞实验最佳药物处理浓度。

2.3 谷氨酰胺可降低糖皮质激素对骨微血管内皮细胞活性的抑制作用糖皮质激素组细胞活性低于对照组(P < 0.000 1)，糖皮质激素+4 mmol/L谷氨酰胺组、糖皮质激素+8 mmol/L谷氨酰胺组、糖皮质激素+12 mmol/L谷氨酰胺组细胞活性高于糖皮质激素组
(P < 0.000 1)，见图4。

2.4 谷氨酰胺可减少糖皮质激素诱导的骨微血管内皮细胞凋亡 AO-PI双重免疫荧光染色显示，糖皮质激素组细胞存活率低于对照组、糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.000 1，P < 0.05)，糖皮质激素+谷氨酰胺+LY294002组细胞存活率低于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)；糖皮质激素组细胞死亡率高于对照组、糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.000 1，P < 0.05)，糖皮质激素+谷氨酰胺+LY294002组细胞死亡率高于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)，见图5。
流式细胞术检测结果显示，对照组、糖皮质激素组、糖皮质激素+谷氨酰胺组、糖皮质激素+谷氨酰胺+LY294002组细胞凋亡率分别为7.40%，36.84%，14.30%，23.83%，糖皮质激素组细胞凋亡率高于对照组、糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)，糖皮质激素+谷氨酰胺+LY294002组细胞凋亡率高于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)，见图6。
2.5 谷氨酰胺对糖皮质激素诱导骨微血管内皮细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响 RT-qPCR检测结果显示，糖皮质激素组PI3K、Akt、mTOR mRNA表达均低于对照组、糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.001，P < 0.000 1)，糖皮质激素+谷氨酰胺+LY294002组PI3K、Akt、mTOR mRNA表达低于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.001，P < 0.000 1)，见图7。
Western Blot检测结果显示，糖皮质激素组PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达均

低于对照组、糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05，P < 0.001，P < 0.000 1)，糖皮质激素+谷氨酰胺+LY294002组PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达低于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.000 1)，见图8。
2.6 谷氨酰胺对糖皮质激素诱导骨微血管内皮细胞中凋亡相关基因表达的影响 RT-qPCR检测结果显示，糖皮质激素组BCL-2 mRNA表达低于对照组、糖皮质激素＋谷氨酰胺组(P < 0.000 1)，Bax mRNA表达高于对照组、糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.000 1)；糖皮质激素+谷氨酰胺+

LY294002组BCL-2 mRNA表达低于糖皮质激素+谷氨酰胺组，Bax mRNA表达高于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.05)，见图9。

Western Blot检测结果显示，糖皮质激素组BCL-2蛋白表达低于对照组、糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.000 1)，Bax 蛋白mRNA表达高于对照组、糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.000 1)；糖皮质激素+谷氨酰胺+LY294002组BCL-2蛋白表达低于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.000 1)，Bax蛋白表达高于糖皮质激素+谷氨酰胺组(P < 0.000 1)，见图10。

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引言

近年来股骨头坏死的病例数逐年增加，这一现象与糖皮质激素在临床治疗中的广泛使用密切相关，特别是在非创伤性股骨头坏死中，由糖皮质激素诱发的此类病症已成为最常见的致病因素[1]。激素性股骨头坏死已成为股骨头坏死中最普遍的类型，特点是坏死范围广泛且进展迅速，因此早期干预显得尤为关键[2]，然而，迄今为止尚无公认的、有效的治疗方法，因此，寻找预防和治疗激素性股骨头坏死的方法，已成为临床上亟待解决的问题。激素性股骨头坏死表现为一种渐进且持续恶化的病理变化过程，早期症状往往隐匿不显，容易导致患者错过最佳的预防和干预时机，当症状最终显现时病情通常已进展至较为严重的中晚期阶段，随着疾病的进一步发展，股骨头坏死区域逐渐扩大，最终可能导致股骨头塌陷和变形，继而引发髋关节炎，严重影响患者的生活质量[3-6]。当前针对早期股骨头坏死的主要治疗策略涵盖保守疗法与外科干预，但这些方法均未能有效阻止疾病的进一步发展，最终多数患者仍需接受全髋关节置换手术。尽管髋关节置换手术是目前较为成熟的解决方案，但术后假体的长期耐久性及可能出现的并发症(如假体周围骨折、感染和脱位)等问题依然是患者关注的重点，因此，髋关节置换手术并非理想的终极治疗方案[7]。鉴于此，深入探究激素性股骨头坏死的具体发病机制，并开发出有效的药物治疗手段显得尤为迫切。
激素性股骨头坏死的致病机制繁复，专家们提出诸多假说解释其病理过程，诸如脂肪代谢失衡假说、骨内压上升假说、氧化压力假说、细胞程序性死亡及干细胞假说、血管内皮受损及凝血功能障碍假说等[8]，不管诱因如何，缺血是骨坏死的首要因素。由于股骨头通过末端动脉系统提供血供，并且不存在双重供血系统，使得股骨头局部血液循环很容易受到干扰而使血供减少[9-10]，股骨头血液供应减少为股骨头坏死发生的关键环节，因此，骨微血管内皮细胞受损可能是股骨头坏死的关键因素[11]。骨微血管内皮细胞和内皮祖细胞在股骨头微血管和骨窦内部发挥着至关重要的作用，这些细胞是维持骨骼血液供应的关键结构。骨微血管内皮细胞分布于股骨头微血管及骨窦的内壁，对保持血管正常功能和确保组织获得充足的血液供给起着不可替代的作用，骨微血管内皮细胞损伤是股骨头循环功能障碍的重要基础[12-13]，也是糖皮质激素作用的重要部位[14-15]。某些刺激(如糖皮质激素的影响)可能会导致骨微血管内皮细胞和内皮祖细胞受损甚至凋亡，进而破坏血管稳态，最终引发血流减少和骨组织坏死。这一过程揭示了骨微血管内皮细胞在股骨头健康中的核心地位及其损伤对骨组织健康的重大影响。
谷氨酰胺作为细胞生长不可或缺的氮源，是细胞生长所必需的氮源，是人体非必需氨基酸，但却是人体内含量最丰富的游离性氨基酸，同时也是重要的氮运载体和供者，能够促进细胞生长[16-17]。
在哺乳动物细胞中，谷氨酰胺与雷帕霉素靶蛋白之间存在复杂的代谢调控网络，通过同位素标记等实验手段已证实，谷氨酰胺能够激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B /哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)构成的信号传导路径[18]。为了探究微小RNA-133b在血管内皮细胞损伤中的作用机制，有研究构建了氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞损伤模型，发现微小RNA-133b通过靶向调控富含谷氨酰胺34-四肽重复序列的小蛋白分子，显著减轻氧化低密度脂蛋白引发的内皮细胞凋亡及氧化应激反应，上调微小RNA-133b表达或抑制目标蛋白的活性均能有效缓解由氧化低密度脂蛋白引起的细胞损伤[19]，这一发现揭示了微小RNA-133b及其靶标蛋白在心血管疾病中的潜在保护作用。LY294002是一种人工合成的PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂，通过竞争性抑制PI3K的ATP结合位点来阻碍PI3K表达[20]，为PI3K广谱抑制剂，它对食管癌、肿瘤相关血管内皮细胞及干细胞等具有抑制作用[21]。
PI3K/Akt/mTOR信号通路不仅在细胞增殖和存活过程中发挥关键作用，还参与调控细胞凋亡、黏附、迁移及新生血管形成[22-23]。研究表明，糖皮质激素能够显著抑制人股骨头骨微血管内皮细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达，从而触发这些细胞的程序性死亡和坏死过程[24]。研究发现激素性股骨头坏死患者的外周血中内皮祖细胞数量减少、衰老细胞比例增加及成管和分化能力下降，这些现象表明内皮祖细胞数量的减少和功能降低可能对正常血管生成和血管修复功能造成了影响[25-26]。动物实验已证实，抑制血管内皮细胞损伤、促进纤维蛋白溶解是治疗激素性股骨头坏死的有效方法之一[27]。然而，目前尚不明确谷氨酰胺是否能够通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路来抑制骨微血管内皮细胞的凋亡，从而对激素性股骨头坏死发挥治疗作用。此次研究通过糖皮质激素诱导骨微血管内皮细胞凋亡的实验模型，观察谷氨酰胺是否能够干预糖皮质激素诱导的骨微血管内皮细胞凋亡，并探讨作用机制是否与PI3K/Akt/mTOR信号通路相关，以期深入理解激素性股骨头坏死的发病机制并探索潜在的治疗方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计体外细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2023年9月至2024年6月在哈尔滨市风湿免疫病基础研究与临床转化中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 4周龄雄性SD大鼠10只，体质量(90±10) g，用于分离提取骨微血管内皮细胞，购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心。大鼠饲养条件：室温25 ℃，湿度50%-60%，光照黑暗各12 h交替，自由进食饮水。实验已通过哈尔滨医科大学实验动物伦理委员会批准(IACUC编号：2022058)。
1.3.2 实验药品及试剂甲基泼尼松龙琥珀酸钠(货号103060，北京索莱宝)；L-谷氨酰胺(货号L810391，麦克林，中国)；胎牛血清(货号10437-028)、DMEM培养液(货号GNM-11965-S)、胰蛋白酶(货号SH30042.01)(Gibco公司，美国)；青霉素-链霉素(货号C0222)、PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂LY294002(货号S1737-5 mg)、PIPA裂解液(货号P00013E)、蛋白酶抑制剂(货号P1008)、磷酸酶抑制剂(货号P1086)、BCA检测试剂盒(货号P0012)、甘氨酸(货号ST085)、Western Blot快速封闭液(货号P0220)、ECL发光显微液(货号P0018S)、考马斯亮蓝染液(货号P0003)、吐温20(货号ST825)(碧云天公司，中国)；胶原酶(货号9001-12-1，上海研生，中国)；PBS(货号T16550，尙宝生物)；Tris-base(货号MA0145)、SDS(货号MA0238)(大连美仑公司，中国)；CCK-8试剂(货号CK04，同仁，日本)；基质胶(货号354234，Corning，美国)；Annexin-V-PI双染试剂盒(货号CA1020)、TBS粉末(货号T1084)(索莱宝，中国)；PAGE凝胶快速制备试剂盒(货号PG110)、蛋白预染三色Marker(货号WJ103)(雅酶，中国)；牛血清白蛋白(货号BL512B，Biosharp，中国)；PVDF膜(货号03010040001，Roche，美国)；HRP标记的山羊抗兔二抗(货号yk2231)；BCL-2 (货号ab194583)、Bax(货号ab182734)、PI3K(货号ab154598)、p-PI3K(货号ab191606)、Akt(货号ab8805)、p-Akt(货号ab81283)、mTOR(货号ab32028)、p-mTOR(货号ab134903)、β-actin(货号ab8227)、GAPDH(货号ab263962)、血管性血友病因子(批号ab154193)、CD31(批号ab9498)抗体(美国Abcam)。
1.3.3 主要设备高压灭菌锅(苏州佳宝，中国，型号YXQ-70A)；恒温干燥箱(上海博迅，中国，型号BXH-65G)；4，-20 ℃冰箱(海尔，中国，型号BCD-472WGHTDB9SYU1)；-80 ℃超低温冰箱(海尔，中国，型号TSX60086V)；细胞恒温孵育培养箱(上海博迅，型号BPH-9092)；超净细胞工作台(上海智城，型号ZHJH-C1109C)；倒置显微镜(尼康日本，型号Eclipse TE300)；台式离心机(长沙英泰，型号TD5Z)；荧光酶标仪(BIOTEX，美国，型号Synergy2)；流式细胞仪(BD Biosciences公司，美国，型号
BDFACSCantoⅡ)；细胞培养瓶(Corning，美国，型号3289)。
1.4 实验方法
1.4.1 骨微血管内皮细胞的分离、培养、传代及鉴定无菌环境下，腹腔注射2%戊巴比妥钠80 mg/kg麻醉后处死SD大鼠，迅速取出双侧股骨头并剔除皮质骨与软组织，将股骨头内的松质骨切割成细小骨粒，转移到装有30 mL无血清低糖DMEM培养基的50 mL
离心管中，反复摇晃混合，过滤以去除油脂，加入PBS并重复摇晃过滤步骤两三次。将5 mL含0.2%Ⅰ型胶原酶的DMEM培养基加入离心管中，置于37 ℃恒温摇床内消化1 h。加入0.25%胰蛋白酶3 mL，于37 ℃水浴消化5 min，用手反复振荡。200目细胞筛过滤，900 r/min离心5 min后弃上层培养液，接种于含有2%明胶(提前30 min铺皿)的直径10 cm培养皿内，加入10 mL完全培养基(含100 μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素、100 μg/mL血管内皮生长添加物、40 U/mL肝素、体积分数20%胎牛血清的M199培养基)。置于含体积分数5% CO2、温度为37 ℃的恒温孵箱中培养，前3 d每天更换一次培养基，之后每2 d更换一次培养基。通过倒置显微镜观察细胞生长情况，待细胞覆盖瓶底后使用胰蛋白酶进行传代。取第3代骨微血管内皮细胞进行实验。
通过免疫荧光染色法鉴定分离细胞的血管性血友病因子和CD31表达。40 g/L多聚甲醛固定细胞10-15 min，应用5%牛血清白蛋白封室温封闭30 min，加入血管性血友病因子(1∶250)、CD31抗体(1∶400)于4 ℃孵育过夜，PBS漂洗2次；加入羊抗小鼠IgG重链或轻链多克隆二抗(1∶800)室温避光孵育60 min，PBS充分漂洗3次，选取含DAPI成分的抗荧光淬灭封固剂封固，通过荧光显微成像系统观察标记结果，其中血管性血友病因子呈现绿色荧光信号定位于胞质区域，CD31显示红色荧光信号分布于细胞膜结构，双阳性信号区域显示血管内皮特异性表达特征。
1.4.2 筛选最佳药物处理浓度将骨微血管内皮细胞悬液接种于96孔板内，细胞浓度1×108 L-1，每孔100 μL，置于37 ℃、体积分数5% CO2恒温条件下孵育12 h，吸去原培养基，分别加入含不同浓度[0(对照)，10，20，30，40，50，60，70 μmol/L]甲基泼尼松龙琥珀酸钠的M199培养基，或含不同浓度[0(对照)，2，4，6，8，10，12 mmol/L]谷氨酰胺的M199培养基、含不同浓度[0(对照)，5，10，15，20，25，30，35 μmol/L]LY294002的M199培养基，每个浓度3-5个复孔。培养24 h后去除培养基，每孔加入10% CCK8试剂避光条件下孵育2 h，使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，计算细胞活性。细胞活性(%)=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。
1.4.3 谷氨酰胺对糖皮质激素诱导骨微血管内皮细胞增殖活性的影响将骨微血管内皮细胞悬液接种于96孔板内，细胞浓度1×108 L-1，每孔100 μL，置于37 ℃、体积分数5% CO2恒温条件下孵育12 h，吸去原培养基，分5组处理：①对照组添加M199培养基培养24 h；②糖皮质激素组添加含50 μmol/L甲基泼尼松龙琥珀酸钠的M199培养基培养24 h；③糖皮质激素+4，8，12 mmol/L谷氨酰胺组添加含 50 μmol/L甲基泼尼松龙琥珀酸钠的M199培养基培养2 h后，再添加4，8，12 mmol/L谷氨酰胺培养24 h。培养结束后去除培养基，每孔加入10% CCK8试剂避光条件下孵育2 h，使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，计算细胞活性。
1.4.4 实验分组将骨微血管内皮细胞接种于6孔培养板中，细胞密度为5.0×105/孔，培养12 h后分4组培养：对照组常规培养24 h；糖皮质激素组加入50 μmol/L甲基泼尼松龙琥珀酸钠处理24 h；糖皮质激素+谷氨酰胺组加入50 μmol/L甲基泼尼松龙琥珀酸钠处理12 h后添加8 mmol/L谷氨酰胺处理12 h；糖皮质激素+谷氨酰胺+LY294002组加入50 μmol/L甲基泼尼松龙琥珀酸钠处理12 h后添加8 mmol/L谷氨酰胺处理6 h，再加入20 μmol/L LY294002处理6 h。培养结束后进行以下检测。
1.4.5 AO-PI双重免疫荧光染色法观察细胞存活移除培养基并用PBS轻轻冲洗细胞，加入1 mL含有AO和PI染料的PBS，在室温下避光孵育5 min，利用荧光倒置显微镜捕捉骨微血管内皮细胞图像，利用Image J软件分别计数绿色荧光细胞(活细胞)及红色荧光细胞(死细胞)数量。细胞存活率(%)=活细胞数/总细胞数×100%，细胞死亡率(%)=死细胞数/总细胞数×100%。
1.4.6 流式细胞术检测细胞凋亡胰酶消化后重悬细胞，用PBS洗涤，1 500 r/min离心5 min后弃上清，使用ddH2O/Binding Buffer缓冲溶液(体积比9∶1)调整细胞浓度至1×109 L-1；吸取100 μL细胞悬液置于流式管内，避光条件下加入5 μL Annexin V和5 μL PI充分混合，加入PBS至体系总体积为500 μL，室温下避光反应15 min，进行流式细胞术检测。实验重复3次。

1.4.7 RT-qPCR检测利用TRIzol试剂提取细胞总RNA，通过PrimeScript RT反转录试剂盒将RNA转录为cDNA，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒执行RT-qPCR扩增反应，热循环参数设定为：初始变性95 ℃持续30 s，95 ℃下变性5 s，60 ℃下退火20 s，72 ℃下延伸15 s，共计40个循环周期。以GAPDH作为内参基因，通过2-ΔΔCt方法计算BCL-2、Bax、PI3K、Akt、mTOR mRNA表达。引物序列见表1。

1.4.8 Western Blot检测提取细胞总蛋白，用RIPA裂解液裂解后离心，BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性后备用。通过10% SDS-PAGE分离蛋白，转移至PVDF膜，封闭后与一抗孵育过夜，一抗主要包括BCL-2、Bax、PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR，内参为GAPDH及β-actin，稀释比均为1∶1 000。将一抗废弃并回收后，利用TBST清洗PVDF膜10 min，这个环节重复3次。弃掉TBST，加入二抗溶液在常温下孵育2 h，ECL显影，利用Image J软件进行定量分析，实验重复3次。
1.5 主要观察指标各组骨微血管内皮细胞凋亡情况、凋亡相关基因mRNA及蛋白表达、PI3K/Akt/mTOR信号通路关键基因mRNA及蛋白表达。
1.6 统计学分析采用 GraphPad Prism 8软件处理实验数据，所有实验均重复3次，数据采用x±s表达，多组间数据符合正态分布采取参数检验，方差齐时采用 One-Way-ANOVA检验，方差不齐时采用Welch-ANOVA检验。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经宋科官专家审核。

讨论

细胞在受到糖皮质激素刺激后所经历的程序性死亡过程，构成了特发性股骨头坏死的生物学基础[28]。
股骨头坏死的主要成因是股骨头内部血液供应的减少，这一现象直接导致了骨微血管内皮细胞损伤，成为触发股骨头坏死的关键因素。TAO等[29]的研究表明，甲基强的松龙可通过调节因子细胞色素C、促凋亡蛋白/抗凋亡蛋白和促凋亡复合物的形成及活性氧增加导致内皮细胞发生凋亡和功能障碍，明显抑制血管生成，导致股骨头的血供减少，从而发生股骨头坏死。大量研究表明，糖皮质激素通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路信号通路诱导细胞凋亡和线粒体损伤，从而导致激素性股骨头坏死的发
生[30]。因此，骨微血管内皮细胞凋亡与激素性股骨头坏死的发生发展密切相关。
谷氨酰胺(2-氨基-5羧基戊酰胺，化学式为C5H10N2O3，相对分子质量146.15)作为一种非必需氨基酸，在人体各组织细胞中广泛存在，在维持机体正常生理功能方面扮演着关键角色，包括促进蛋白质合成、增强免疫反应及加速伤口修复等。血液和骨骼肌中谷氨酰胺的浓度较高，这有助于激活肌肉细胞内的蛋白质合成信号通路，从而增加肌肉蛋白质的生成。长期缺乏谷氨酰胺补充会导致一系列不良后果，如肌肉质量下降、肌肉再生能力减弱以及免疫力降低等问题，进而可能引发多种疾病。值得注意的是，谷氨酰胺代谢显著增强是肿瘤细胞的一个重要特征，它不仅为肿瘤细胞的快速增殖提供了必要的营养物质，还可能是导致肿瘤免疫逃逸的关键因素之一[31]。研究发现小鼠肠上皮细胞癌基因Kras突变激活可导致谷氨酰胺流出，抑制细胞谷氨酰胺转出的关键蛋白SLC7A5，阻断Kras突变肠癌细胞的增殖[32]。研究表明，谷氨酰胺能够通过减轻严重烧伤小鼠内质网应激促进MG53二聚化加速骨骼肌膜修复，减轻骨骼肌局部炎症反应，减少骨骼肌的消耗[33]。此次实验结果显示，8 mmol/L谷氨酰胺对骨微血管内皮细胞增殖的促进作用最明显，
50 μmol/L糖皮质激素可明显抑制骨微血管内皮细胞活性，因此将50 μmol/L糖皮质激素与骨微血管内皮细胞共同培养，并引入了不同浓度梯度的谷氨酰胺进行干预，实验结果显示谷氨酰胺能够显著缓解糖皮质激素对骨微血管内皮细胞的损伤作用。
PI3K/Akt/mTOR信号通路是重要的细胞内信号传导通路，参与细胞生长、增殖、凋亡和分化调控等代谢过程。研究表明谷氨酰胺可激活体内的PI3K/Akt/mTOR信号通路[18]，但不清楚谷氨酰胺是否可激活骨微血管内皮细胞内PI3K/Akt/mTOR信号通路来减少细胞凋亡。此次实验将谷氨酰胺应用于大鼠骨微血管内皮细胞中，验证谷氨酰胺是否可通过激活骨微血管内皮细胞内PI3K/Akt/mTOR信号通路来减少糖皮质激素所诱导的细胞凋亡，RT-qPCR检测结果显示，PI3K/Akt/mTOR信号通路中关键基因PI3K、Akt、mTOR的表达增加，表明谷氨酰胺可提高糖皮质激素诱导下骨微血管内皮细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路关键基因的mRNA表达；Western Blot检测进一步显示谷氨酰胺可提高糖皮质激素诱导下骨微血管内皮细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路关键基因的蛋白表达，揭示了谷氨酰胺能够激活骨微血管内皮细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路。
细胞凋亡过程由多种因子调控，其中线粒体在这一进程中扮演着核心角色。BCL-2基因家族中的成员及其编码的蛋白质在细胞凋亡中发挥关键作用，具体而言，Bax蛋白作为促凋亡因子位于细胞凋亡启动的上游，能够触发细胞凋亡机制；与此同时，BCL-2基因编码一种抗凋亡蛋白，通过与Bax蛋白相互作用抑制细胞凋亡的发生，这两种蛋白质在细胞内形成一个复杂的调控网络，彼此拮抗并协同作用，以确保细胞正常更替和凋亡的平衡。通过调节BCL-2基因和Bax蛋白之间的动态平衡可以有效控制细胞凋亡进程，从而影响细胞命运[34-36]。此次研究通过RT-qPCR和Western Blot检测对不同组别骨微血管内皮细胞中与凋亡相关基因及蛋白表达水进行了检测，结果显示：谷氨酰胺干预后，糖皮质激素诱导下骨微血管内皮细胞中抗凋亡基因BCL-2的mRNA与蛋白表达升高，而促凋亡基因Bax的mRNA与蛋白呈现下降趋势，表明谷氨酰胺能够提升抗凋亡基因BCL-2的表达、降低促凋亡基因Bax的表达。
为从细胞层面进一步验证谷氨酰胺对糖皮质激素诱导下骨微血管内皮细胞凋亡的影响，采用AO-PI双重免疫荧光染色技术观察骨微血管内皮细胞的存活状况，结果显示糖皮质激素+谷氨酰胺组细胞凋亡率低于糖皮质激素组；流式细胞术分析结果显示，与对照组相比，糖皮质激素组骨微血管内皮细胞的凋亡率从7.40%上升至36.84%，添加谷氨酰胺后细胞凋亡率降低至14.30%，表明谷氨酰胺的加入显著降低了骨微血管内皮细胞的凋亡率。分子水平与细胞水平研究结果均呈现一致趋势，共同验证了谷氨酰胺在降低骨微血管内皮细胞凋亡方面的有效性。
综上所述，谷氨酰胺能够抑制由糖皮质激素引起的骨微血管内皮细胞凋亡，潜在作用机制可能涉及激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而提升抗凋亡基因BCL-2的表达并减少促凋亡基因Bax的表达。该实验存在一定的不足，仅聚焦于谷氨酰胺在细胞凋亡机制中的作用，鉴于激素性股骨头坏死是一个涉及多种机制、因素和通路的复杂疾病，未来的研究将扩展至谷氨酰胺在其他潜在机制中的作用，并且进一步开展动物实验，通过苏木精-伊红染色及micro-CT等观察股骨头内骨小梁的变化，从而进一步验证谷氨酰胺可通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路降低糖皮质激素所诱导的细胞凋亡，为激素性股骨头坏死的治疗提供有力参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

谷氨酰胺对激素诱导骨微血管内皮细胞凋亡的影响

Glutamine regulates the effect of hormones on the apoptosis of bone microvascular endothelial cells

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