SR9009联合吲哚丙酸通过核因子κB信号通路减轻C2C12成肌细胞的炎症反应

doi:10.12307/2025.283

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (6): 1220-1229.doi: 10.12307/2025.283

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

SR9009联合吲哚丙酸通过核因子κB信号通路减轻C2C12成肌细胞的炎症反应

姬慧慧1，蒋旭1，张志敏1，邢运虹2，王亮亮2，李娜2，宋雨庭1，罗旭光3，崔慧林1，曹锡梅1，4

山西医科大学，1组织学与胚胎学教研室，2法医学院，3微生物免疫学教研室，4山西省临床级细胞治疗转化中试基地，山西省晋中市 030604

收稿日期:2024-01-30 接受日期:2024-03-09 出版日期:2025-02-28 发布日期:2024-06-21
通讯作者: 曹锡梅，副教授，硕士生导师，山西医科大学，组织学与胚胎学教研室，山西省临床级细胞治疗转化中试基地，山西省晋中市 030604
作者简介:姬慧慧，女，1997年生，山东省济南市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事骨骼肌萎缩与再生机制的相关研究。
基金资助:
山西省回国留学人员科研资助项目(2023-095)，项目负责人：曹锡梅；山西省自然科学基金面上项目(202303021211113)，项目负责人：曹锡梅

SR9009 combined with indolepropionic acid alleviates inflammation in C2C12 myoblasts through the nuclear factor-kappa B signaling pathway

Ji Huihui1, Jiang Xu1, Zhang Zhimin1, Xing Yunhong2, Wang Liangliang2, Li Na2, Song Yuting1, Luo Xuguang3, Cui Huilin1, Cao Ximei1, 4

1Department of Histology and Embryology, 2School of Forensic Medicine, 3Department of Microbiology and Immunology, 4The Transformation Pilot-Base of Shanxi Clinical Cell Therapy, Shanxi Medical University, Jinzhong 030604, Shanxi Province, China

Received:2024-01-30 Accepted:2024-03-09 Online:2025-02-28 Published:2024-06-21
Contact: Cao Ximei, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University, Jinzhong 030604, Shanxi Province, China; The Transformation Pilot-Base of Shanxi Clinical Cell Therapy, Shanxi Medical University, Jinzhong 030604, Shanxi Province, China
About author:Ji Huihui, Master candidate, Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University, Jinzhong 030604, Shanxi Province, China
Supported by:
Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China, No. 2023-095 (to CXM); Natural Science Foundation of Shanxi Province (General Program), No. 202303021211113 (to CXM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Rev-erbα：昼夜节律钟基因之一。它是一种有效的转录抑制因子，抑制参与新陈代谢、昼夜节律和炎症等多种基因的表达，而且Rev-erbα能够促进血小板的活化和血栓形成。Rev-erbα将昼夜节律与代谢途径的转录调控联系起来，被认为是代谢性疾病的可控药物靶点。同时Rev-erbα是昼夜节律和免疫功能之间的桥梁，靶向Rev-erbα可能用于预防和治疗炎症性疾病。
核因子κB(NF-κB)信号通路：该通路参与机体炎症反应的发生发展。已知脂多糖能够识别并激活Toll样受体，Toll样受体进一步激活NF-κB，且NF-κB的异常调控与癌症、炎症性疾病和自身免疫性疾病等密切相关。

背景：钟基因Rev-erbα参与调节炎症，但激活Rev-erbα会增加心脑血管疾病风险。为降低相关风险，探索Rev-erbα激动剂SR9009联合其他药物来减轻骨骼肌成肌细胞炎症，奠定治疗炎症相关性骨骼肌萎缩的理论基础。
目的：探讨脂多糖刺激C2C12成肌细胞时吲哚丙酸、SR9009与核因子κB信号通路的关系。
方法：①1 μg/mL脂多糖刺激C2C12成肌细胞，RNA转录组测序结合KEGG通路富集分析信号通路。②CCK-8法检测C2C12成肌细胞活性，筛选吲哚丙酸的最佳给药浓度；然后将细胞分为空白对照组、脂多糖(1 μg/mL)组、SR9009(10 μmol/L)+脂多糖组、吲哚丙酸(80 μmol/L)+脂多糖组、吲哚丙酸+SR9009+脂多糖组，ELISA检测细胞上清液中白细胞介素6水平，RT-qPCR检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、CD14 mRNA表达，Western blot检测NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达。③siRNA敲减Rev-erbα，RT-qPCR评估敲减效率，检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA表达。
结果与结论：①与空白对照组比较，脂多糖时间依赖性抑制成肌细胞融合形成肌管，白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA表达水平升高，细胞上清液中白细胞介素6水平显著升高；KEGG通路分析支持脂多糖刺激激活核因子κB信号通路。②吲哚丙酸浓度> 80 μmol/L时抑制C2C12成肌细胞活性；吲哚丙酸和SR9009通过抑制核因子κB信号通路发挥抗炎作用，降低白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、CD14 mRNA表达水平，p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达比值低于脂多糖组。SR9009联合吲哚丙酸显著降低脂多糖诱导的炎症，Toll样受体4、CD14、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α mRNA表达水平进一步下调，p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达比值显著低于吲哚丙酸+脂多糖组和SR9009+脂多糖组。③Rev-erbα随脂多糖刺激时间依赖性升高；siRNA敲减Rev-erbα效率达58%以上，成功敲减Rev-erbα后添加脂多糖，白细胞介素6和肿瘤坏死因子α mRNA表达较脂多糖组显著上调。④结果说明，Rev-erbα可以作为调节炎症反应的靶点，SR9009靶向激活Rev-erbα联合吲哚丙酸能抑制核因子κB信号通路显著减轻C2C12成肌细胞的炎症反应，联合抗炎效果优于单独干预。
https://orcid.org/0000-0002-1743-4433(姬慧慧)；https://orcid.org/0000-0002-5240-3253(曹锡梅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: Rev-erbα, SR9009, 吲哚丙酸, 脂多糖, 核因子κB信号通路, C2C12成肌细胞

Abstract:
BACKGROUND: Rev-erbα is involved in the regulation of inflammation, but pharmacological activation of Rev-erbα increases the risk for cardiovascular diseases. To reduce the relevant risk, an exploration on SR9009, a Rev-erbα agonist, combined with other drugs to relieve inflammation in skeletal myoblasts was conducted, laying the theoretical foundation for the treatment of inflammation-associated skeletal muscle atrophy.
OBJECTIVE: To investigate the relationship of SR9009, indolepropionic acid and nuclear factor-κB signaling pathways in lipopolysaccharide-induced C2C12 myoblasts.
METHODS: (1) C2C12 myoblasts were induced to differentiate in the presence of lipopolysaccharide (1 μg/mL). RNA-seq and KEGG pathway analysis were used to study signaling pathways. (2) C2C12 myoblast viability was assessed using the cell counting kit-8 assay to determine optimal concentrations of indolepropionic acid. Subsequently, cells were categorized into control group, lipopolysaccharide (1 μg/mL) group, SR9009 (10 μmol/L)+lipopolysaccharide group, indolepropionic acid (80μmol/L)+lipopolysaccharide group, and SR9009+indolepropionic acid+lipopolysaccharide group. ELISA was employed to measure protein expression levels of interleukin-6 in the cultured supernatant. Real-time quantitative PCR were employed to measure mRNA expression levels of interleukin-6, tumor necrosis factor α, TLR4 and CD14. Western blot assay were employed to measure protein expression levels of NF-κB p65 and p-NF-κB p65. (3) After Rev-erbα was knocked down by siRNA, knockdown efficiency was assessed by RT-qPCR. And mRNA levels of interleukin-6 and tumor necrosis factor α were also measured.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, lipopolysaccharide time-dependently inhibited myofibroblast fusion to form myotubes, the mRNA expression levels of interleukin-6 and tumor necrosis factor α were elevated, and the level of interleukin-6 in the cell supernatant was significantly increased. The results of KEGG pathway showed that the nuclear factor-κB signaling pathway was activated by lipopolysaccharide. Indolepropionic acid exhibited significant suppression of C2C12 myoblasts viability when its concentration exceeded 80 μmol/L. Indolepropionic acid and SR9009 inhibited the activation of NF-κB signaling pathway, thereby played an anti-inflammatory role, and suppressed the mRNA expression levels of interleukin-6, tumor necrosis factor α, TLR4 and CD14. Compared with the lipopolysaccharide group, the ratio of p-NF-κB p65/NF-κB p65 protein expression were downregulated. SR9009 combined with indolepropionic acid notably reduced lipopolysaccharide-induced inflammation, further downregulated the mRNA expression levels of interleukin-6, tumor necrosis factor α, TLR4 and CD14. The ratio of p-NF-κB p65/NF-κB p65 protein expression was significantly lower than that in the SR9009+lipopolysaccharide group or indolepropionic acid+lipopolysaccharide group. Rev-erbα increases time-dependently with lipopolysaccharide induction. The knockdown efficiency of Rev-erbα by siRNA reached over 58%, and lipopolysaccharide was added after Rev-erbα was successfully knocked down. Compared with the lipopolysaccharide group, the mRNA expression levels of interleukin-6 and tumor necrosis factor α were significantly up-regulated. These results conclude that Rev-erbα may act as a promising pharmacological target to reduce inflammation. SR9009 targeted activation of Rev-erbα combined with indolepropionic acid significantly inhibits the nuclear factor-κB signaling pathway and attenuates the inflammatory response of C2C12 myofibroblasts. Moreover, the combined anti-inflammatory effect is superior to that of the intervention alone.

Key words: Rev-erbα, SR9009, Indolepropionic acid, lipopolysaccharide, nuclear factor-κB signaling pathway, C2C12 myoblast

中图分类号:

姬慧慧, 蒋旭, 张志敏, 邢运虹, 王亮亮, 李娜, 宋雨庭, 罗旭光, 崔慧林, 曹锡梅. SR9009联合吲哚丙酸通过核因子κB信号通路减轻C2C12成肌细胞的炎症反应[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1220-1229.

Ji Huihui, Jiang Xu, Zhang Zhimin, Xing Yunhong, Wang Liangliang, Li Na, Song Yuting, Luo Xuguang, Cui Huilin, Cao Ximei. SR9009 combined with indolepropionic acid alleviates inflammation in C2C12 myoblasts through the nuclear factor-kappa B signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(6): 1220-1229.

图/表（结果） 6

2.1 脂多糖刺激C2C12成肌细胞分泌白细胞介素6和肿瘤坏死因子α，并激活NF-κB信号通路 C2C12成肌细胞分化过程中添加1 μg/mL脂多糖诱导炎症反应，与对照组相比，C2C12成肌细胞生长减慢、细胞融合和肌管的形成被抑制。实验观察期内，脂多糖时间依赖性地抑制肌管形成(图1A)。RNA转录组测序结合KEGG通路分析结果显示，脂多糖刺激C2C12成肌细胞分化过程中的炎症反应与肿瘤坏死因子α、NF-κB及其相关信号通路的激活相关(图1B)。
验证实验结果显示，与对照组相比，C2C12成肌细胞分化过程中添加脂多糖上调NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表达，且p-NF-κB p65/NF-κB p65的比值随脂多糖刺激时间延长显著升高(图1C，D)，提示脂多糖刺激C2C12成肌细胞条件下，NF-κB信号通路被激活。RT-qPCR结果显示，脂多糖刺激组细胞中白细胞介素6 mRNA表达较对照组显著升高，且随时间依赖性升高(图1E)，肿瘤坏死因子α mRNA表达随脂多糖刺激时间依赖性升高，72 h达到小高峰后略有下降(图1F)。ELISA检测细胞上清液中白细胞介素6水平，其与mRNA的表达呈现相同升高趋势(图1G)。以上结果支持脂多糖刺激C2C12成肌细胞条件下，NF-κB信号通路被激活，诱发炎症反应。
2.2 吲哚丙酸抑制脂多糖刺激的C2C12成肌细胞炎症反应已知吲哚丙酸能通过NF-κB信号通路发挥抗炎作用[14-16]。
为进一步验证C2C12成肌细胞分化过程中脂多糖刺激的炎症反应与NF-κB信号通路有关，在生长培养基中添加吲哚丙酸培养18 h后，转入含1 μg/mL脂多糖的分化培养基，并维持吲哚丙酸干预剂量培养72 h。CCK-8检测吲哚丙酸的细胞毒性，筛选最佳给药浓度。结果显示，随着吲哚丙酸作用时间延长，吲哚丙酸浓度> 80 μmol/L对C2C12成肌细胞造成明显毒性损伤；吲哚丙酸浓度< 80 μmol/L时未对C2C12成肌细胞活性造成显著性影响，且低浓度吲哚丙酸表现出促增殖作用，以10 μmol/L最显著(图2A-C)。结合利用吲哚丙酸抑炎的实验目的，选择80 μmol/L作为吲哚丙酸的使用浓度进行后续实验。与脂多糖组相比，吲哚丙酸+脂多糖组干预72 h后白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA表达水平显著降低(图2D，E)；NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表达水平下调，尤以p-NF-κB p65下调显著，p-NF-κB p65/NF-κB p65比值较脂多糖组显著降低(图2F，G)。
2.3 靶向抑制或激活Rev-erbα对炎性细胞因子白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的影响 KEGG通路分析结果显示昼夜节律钟基因参与调节炎症反应(图1B)。研究表明，Rev-erbα参与调节巨噬细胞的炎症反应[17]。靶向Rev-erbα是否参与调节脂多糖刺激C2C12成肌细胞的炎症反应值得进一步研究。脂多糖组Rev-erbα mRNA的表达水平呈时间依赖性升高(图3A)。通过Rev-erbα siRNA有效敲减Rev-erbα，并用RT-qPCR确定其抑制效率达58%以上(图3B)。Rev-erbα敲减组白细胞介素6和肿瘤坏死因子α mRNA表达水平较脂多糖组显著上调(图3C，D)。提示，敲减Rev-erbα加重脂多糖刺激C2C12成肌细胞的炎症反应。
吡咯衍生物SR9009是Rev-erbα的激动剂，可以增强Rev-erbα依赖性阻遏因子活性[18]。10 μmol/L SR9009预处理C2C12成肌细胞后给予脂多糖刺激，白细胞介素6和肿瘤坏死因子α mRNA表达水平较脂多糖组呈现下降趋势(图3E，F)；细胞上清液中白细胞介素6水平的表达趋势与其mRNA水平基本一致(图3G)。提示，药理性激活Rev-erbα能够发挥抗炎效应。
2.4 Rev-erbα激动剂SR9009抑制NF-κB p65磷酸化，减轻脂多糖刺激的炎症反应 TLR4是与脂多糖结合的主要受体，TLR4/CD14信号通路是介导脂多糖刺激引发炎症反应的重要通路[19-20]。随脂多糖刺激时间延长，TLR4、CD14 mRNA的表达水平依赖性增加。当SR9009药理性激活Rev-erbα后，SR9009+脂多糖组较脂多糖组TLR4、CD14 mRNA的表达水平下调，尤以72 h以后显著(图4A，B)。NF-κB是TLR4介导的信号通路中的关键转录因子。蛋白免疫印迹实验进一步检测脂多糖刺激C2C12成肌细胞分化过程中NF-κB信号通路的变化，结果显示p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白比值较对照组时间依赖性升高。激动剂SR9009预处理后，SR9009+脂多糖组p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白比值逐渐下调且显著低于脂多糖组(图4C，D)。同一时间点NF-κB p65的表达水平在脂多糖组和SR9009+脂多糖组之间无显著差异。提示，SR9009预处理通过下调TLR4、CD14 mRNA的表达，抑制NF-κB p65激活，以72 h后显著，进而减轻脂多糖刺激的炎症反应。
2.5 Rev-erbα激动剂SR9009联合吲哚丙酸具有更强的抗炎作用为评价脂多糖刺激C2C12成肌细胞分化过程中Rev-erbα激动剂SR9009联合吲哚丙酸共培养条件下NF-κB信号通路的变化，检测脂多糖刺激72 h时TLR4、CD14、炎性细胞因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA的表达，结果显示SR9009+脂多糖组和吲哚丙酸+脂多糖组TLR4、CD14、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA的表达均显著低于脂多糖组；SR9009和吲哚丙酸联合后，上述因子的表达水平进一步下降，尤以白细胞介素6的下降更为显著(图5A-D)。SR9009和吲哚丙酸联合后，p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白比值较SR9009+脂多糖组或吲哚丙酸+脂多糖组均显著下调(图5E，F)。提示，Rev-erbα激动剂SR9009联合吲哚丙酸具有更强的抗炎作用。

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引言

钟基因Rev-erbα在机体不同组织器官广泛分布，是NR1D1(nuclear receptor subfamily 1，group D member 1)的基因产物，其功能具有多样性。REV-ERBα作为转录抑制因子，能够招募共抑制因子并结合到靶基因的特定DNA区域发挥抑制效应，抑制参与昼夜节律、新陈代谢等多种基因的表达[1-2]。Rev-erbα的表达具有昼夜节律特点，若破坏其表达节律，会引发炎症性疾病、代谢综合征等[3]。Rev-erbα−/−小鼠的昼夜节律周期变短，小鼠体质量明显下降，骨骼肌纤维萎缩、横截面积变小；进一步还发现Rev-erbα能够控制骨骼肌自噬和线粒体的发生[2]，提示Rev-erbα可以作为改善骨骼肌功能的靶点，调控骨骼肌质量。
已知多种慢性疾病伴发骨骼肌萎缩，如癌症、糖尿病，且机体常伴慢性炎症反应、循环脂多糖水平升高[4-6]。脂多糖是革兰阴性菌外膜的主要成分，能够触发单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞释放促炎细胞因子，导致炎症[7-9]。脂多糖识别并激活Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)，诱导形成TLR4-CD14复合物，增加核因子κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB)的活性[7]。脂多糖还能通过TLR4激活NF-κB信号通路参与抑制骨骼肌成肌细胞分化[7]。然而，脂多糖对骨骼肌成肌细胞的抑制作用具有可逆性[7]，提示去除炎性刺激或缓解炎症反应后骨骼肌成肌细胞的结构和功能能够恢复。已知REV-ERBα能抑制NF-κB p65的转录，通过NF-κB信号通路间接抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体的转录，在炎症反应中发挥调节作用[10]。在结肠炎等炎症性疾病中，若激活Rev-erbα能够减轻炎症反应[1，10-11]。一系列以REV-ERBα为靶点的激动剂或抑制剂被运用于多种生理或病理模型，其中激动剂SR9009能够抑制脂多糖诱导的炎症反应[12]。经SR9009处理还可以使野生型小鼠对葡聚糖钠盐诱导的实验性结肠炎具有更强的抵抗力[10]。脂多糖抑制骨骼肌成肌细胞分化过程中，靶向激活Rev-erbα是否参与减轻骨骼肌成肌细胞炎症反应值得进一步研究。
然而，有研究显示激活Rev-erbα可能会诱发高同型半胱氨酸血症和血栓形成，增加心脑血管疾病的发病风险[13]。近年来，关于肠道菌群与心脑血管疾病的相关研究越来越多，也更加关注肠道菌群代谢产物的抗炎特性，其中吲哚丙酸是色氨酸经肠道菌群代谢后产生的吲哚衍生物，能够通过NF-κB信号通路发挥抗炎作用[14]。此外，吲哚丙酸能够增强线粒体氧化应激活性调节慢性炎症反应[15]。靶向激活Rev-erbα联合吲哚丙酸是否有助于减轻炎症反应需要进一步验证，并为揭示骨骼肌炎症机制、降低心脑血管疾病风险研究奠定理论基础。该研究结合国内外研究现状，探讨脂多糖刺激C2C12成肌细胞时吲哚丙酸、SR9009与NF-κB信号通路的关系，为治疗炎症相关性骨骼肌萎缩提供新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2022年9月至2023年10月在山西医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 C2C12成肌细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心(目录号 GNM26)。
1.3.2 实验用主要试剂和设备脂多糖(L2880，Sigma，德国)；吲哚丙酸(57400-5G-F，Sigma，德国)；DMEM高糖培养基(国产)(C11965500BT，Gibco，中国)；Opti-MEM减血清培养基(31985070，Gibco，美国)；胎牛血清(SA101.02，Cellmax，中国)；马血清(S9050，Solarbio，中国)；SR9009(M5143，Sigma，德国)；Cell Counting Kit-8细胞增殖及毒性检测试剂盒(MA0218，MeilunBio，中国)；Control siRNA-A(sc-37007，Santa Cruz，美国)；Rev-erbα siRNA(sc-61459，Santa Cruz，美国)；Lipofectamine™ 3000转染试剂(L300015，Invitrogen，美国)；RNAiso Plus (TRIZol® Reagent)(9109，TaKaRa，日本)；PrimeScript™ RT reagent Kit (RR037B，TaKaRa，日本)；扩增试剂2X ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02，Vazyme，中国)；白细胞介素6 ELISA试剂盒(EK0411，博士德，中国)；RIPA裂解液(AR0102-100，博士德，中国)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(AR0146，博士德，中国)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(AR0138，博士德，中国)；抗NF-κB p65抗体(T55034F，Abmart，中国)；抗p-NF-κB p65抗体(TP56372F，Abmart，中国)；飞克特超敏ECL发光液(MA0186，MeilunBio，中国)；倒置相差荧光显微镜(IX71，OLYMPUS，日本)；全自动细胞计数仪(Countess 3，Invitrogen，美国)；低温高速离心机(2-16PK，Sigma，德国)；荧光定量PCR检测系统(CFX384 Touch™，Bio-Rad，美国)；多功能连续波长酶标仪(Infinite® M200 Pro，TECAN，瑞士)；凝胶成像仪(Gel Doc XR+，Bio-Rad，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 C2C12成肌细胞的培养与诱导分化结合常规细胞培养经验用生长培养基(DMEM高糖培养基+体积分数为10%胎牛血清+1%青链霉素)，在37 ℃、体积分数5%CO2条件下进行细胞培养，隔天换液，待细胞生长至汇合度为80%左右时，转入分化培养基(DMEM高糖培养基+体积分数为2%马血清+1%青链霉素)诱导C2C12成肌细胞分化。倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况并采集图像。

1.4.2 实验分组与处理按照实验目的设计实验分组，见表1。

1.4.3 转录组测序 C2C12成肌细胞分化过程中分别添加1 μg/mL脂多糖刺激0，24，72，168 h后收集细胞，委托艾普拜生物科技(苏州)有限公司进行RNA转录组测序。使用TRIZol®试剂提取总RNA，反转录成双链cDNA，使用HISAT2将过滤后数据与参考基因组序列进行比对，得到比对参考基因组。使用Stringtie软件转录本重构，并统计每个基因或转录本的表达量。使用DESeq2进行表达量差异分析，最后通过KEGG富集分析找到相关通路。
1.4.4 细胞转染 Rev-erbα siRNA订购于Santa Cruz生物技术公司，按照细胞siRNA转染技术说明书进行实验操作。首先将C2C12成肌细胞以2×105个/孔的密度接种在6孔板上，培养24 h左右(37 ℃、体积分数5% CO2)，待生长汇合度达60%-80%时，添加制备的转染复合物。转染复合物的配置：①5 μL/孔Lipofectamine® 3000转染试剂添加至100 μL Opti-MEM减血清培养基中轻轻混匀；②5 μL Rev-erbα siRNA或Control siRNA(阴性对照)分别添加至100 μL Opti-MEM减血清培养基中轻轻混匀。将①+②混匀室温静置15-20 min后添加至6孔板中继续培养24 h，然后更换为含体积分数2%马血清的分化培养基或含1 μg/mL脂多糖的分化培养基继续培养24 h，收集细胞RT-qPCR评估敲减效率并进行相关检测。
1.4.5 细胞活性测定根据Cell Counting Kit-8细胞增殖及毒性检测试剂盒的标准方案进行实验操作。C2C12成肌细胞培养过程中加入吲哚丙酸(0，10，20，40，80，160 μmol/L)干预24，48，72 h，结束培养前60 min按1∶100的比例加入CCK-8后在培养箱内继续孵育1 h，待培养液颜色变为黄色时，应用酶标仪于450 nm波长处测定各孔的吸光度值，评估细胞活性。
1.4.6 RT-qPCR检测mRNA表达
(1)总RNA的提取纯化和反转录：使用TRIZol®Reagent提取各组C2C12成肌细胞的总RNA，脂多糖刺激及收集时间见表1。应用酶标仪测定A260、A280并计算其比值，判定RNA的质量和纯度。参照反转录试剂盒说明书，以总RNA(400 ng)为模板反转录成cDNA于4 ℃冰箱保存备用。

(2)RT-qPCR检测Rev-erbα、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、TLR4、CD14的mRNA表达：Allele ID6软件分析基因序列并设计引物，委托生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列详见表2。以反转录所得cDNA为模板，选用南京诺唯赞生物科技有限公司反应液ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，运行实时荧光定量PCR系统，设定反应条件：95 ℃预变性10 s、95 ℃变性15 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s并采集荧光，循环40次，58-95 ℃生成熔解曲线。选取内参基因β-actin校准。

(3)数据分析：根据RT-qPCR阳性结果采集到的Ct值计算不同基因的表达量，实验组/对照组=2-ΔΔCt，其中∆∆Ct=(Ct目的-Ct内参)实验-(Ct目的-Ct内参)对照。GraphPad Prism 10.0.2统计软件进行绘图分析。
1.4.7 Western blot检测蛋白表达 RIPA裂解液提取表1所列的空白对照组、脂多糖组、SR9009+脂多糖组、吲哚丙酸+脂多糖组和吲哚丙酸+SR9009+脂多糖组中相对应收集时间点(0 h除外)的C2C12成肌细胞总蛋白。BCA蛋白浓度测定试剂盒检测实验样本蛋白浓度，定量后20 μg蛋白上样SDS-PAGE凝胶电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂奶常温封闭1.5 h，孵育抗REV-ERBα抗体(1∶2 000)、抗NF-κB p65抗体(1∶2 000)、抗p-NF-κB p65抗体(1∶1 000)、抗β-actin抗体(1∶10 000)，4 ℃过夜，第2天TBST洗膜3次，室温孵育二抗HRP标记的羊抗兔IgG (1∶15 000)1 h，ECL显影曝光并采集实验结果。Image J软件扫描条带并分析灰度值，Graphpad Prism 10.0.2软件分析数据。
1.4.8 酶联免疫吸附实验(ELISA) 将C2C12成肌细胞以2×105个/孔密度接种于6孔板上，待细胞生长汇合度达80%时转入含体积分数2%马血清的分化培养基中，设置空白对照组、脂多糖组、SR9009+脂多糖组(具体处理方法见表1)，分别于0，24，72，168 h收集细胞上清液检测白细胞介素6水平。实验步骤按照ELISA试剂盒说明书进行，应用酶标仪于450 nm波长处测定各孔的吸光度值。
1.5 主要观察指标 ①倒置显微镜下观察细胞形态；②RNA转录组测序结合KEGG富集分析确定相关通路；③RT-qPCR检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、CD14和TLR4的mRNA表达；④Western blot检测NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表达及条带灰度值分析；⑤ELISA检测细胞上清液中白细胞介素6水平；⑥RT-qPCR确定Rev-erbα siRNA的敲减效率。
1.6 统计学分析所有实验均独立重复3次。研究数据采用Graphpad Prism 10.0.2进行统计分析，计量资料使用x±s描述，采用独立样本t检验比较两组间差异、单因素方差分析比较多组间(两组以上)差异，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过山西医科大学卫生统计学专家审核。

讨论

骨骼肌约占身体质量的45%，对保持健康具有非常重要的意义[21]。研究发现多种慢性疾病伴发骨骼肌萎缩，如癌症、糖尿病，机体常伴慢性炎症反应且循环脂多糖水平明显升高[7，22-24]。脂多糖是公认的炎症启动因子，常诱导产生炎性细胞因子，如白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等[7]。近年来研究发现骨骼肌具有内分泌功能，能释放包括白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素15和鸢尾素等在内的肌细胞因子，并通过内分泌、自分泌或旁分泌发挥生物学效应[25]。上述慢性疾病伴发骨骼肌萎缩过程中的炎症机制极其复杂，目前并未完全阐明。已知炎症反应过程中，表达升高的白细胞介素6和肿瘤坏死因子α成为JAK-STAT信号转导通路的激活子，上调骨骼肌肌生成抑素的表达，肌生成抑素参与抑制骨骼肌合成代谢途径，刺激分解代谢途径[26]。然而，脂多糖对骨骼肌成肌细胞的抑制作用具有可逆性[7]。提示慢性炎症反应参与骨骼肌萎缩的发生和发展，明确炎症反应机制可能为干预骨骼肌萎缩奠定理论基础。该研究首先选用C2C12成肌细胞为研究对象，诱导分化过程中添加1 μg/mL脂多糖建立细胞炎症模型，细胞受脂多糖影响，生长速度减慢，且脂多糖时间依赖性地抑制细胞融合和肌管的形成。
RT-qPCR检测白细胞介素6和肿瘤坏死因子α mRNA的表达水平，二者随时间依赖性的上调，细胞上清液中白细胞介素6水平呈现相同趋势，提示1 μg/mL脂多糖成功诱导C2C12成肌细胞炎症反应，异常分泌的炎性细胞因子参与抑制肌管的形成。已知NF-κB信号通路参与调控炎症反应在内的多种生物学过程，该信号通路的激活能够促进炎性细胞因子表达[27]。KEGG通路分析结果显示脂多糖刺激C2C12成肌细胞分化过程中的炎症反应与NF-κB信号通路的激活密切相关。Western blot验证实验表明p-NF-κB p65/NF-κB p65比值随脂多糖刺激时间延长显著升高，支持脂多糖刺激条件下NF-κB信号通路被激活。
吲哚丙酸作为吲哚衍生物，能够通过NF-κB通路发挥抗炎作用，降低小鼠骨骼肌组织中促炎细胞因子水平；抑制小胶质细胞M1极化，减轻继发性脊髓损伤[28]，可见吲哚丙酸有助于重塑炎症微环境，该实验结果与之相一致。吲哚丙酸干预脂多糖刺激条件下的C2C12成肌细胞，白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA表达水平显著降低，p-NF-κB p65/NF-κB p65比值较脂多糖组显著降低，表明吲哚丙酸可能通过抑制NF-κB信号通路发挥作用，也进一步支持脂多糖刺激C2C12成肌细胞分化过程中NF-κB信号通路处于激活状态。推测吲哚丙酸联合其他靶点共同抑制NF-κB信号通路能够发挥更好的抗炎效果。
该研究KEGG通路分析结果支持昼夜节律钟基因参与调节脂多糖刺激C2C12成肌细胞的炎症反应。已知24 h的昼夜节律在行为、生理和代谢方面表现出明显的周期性，并参与机体生理、病理过程，如机体免疫、癌症和代谢性疾病的发生发展等[20-22]。昼夜节律的分子机制由转录-翻译反馈回路的交互式网络组成，核心钟基因包括Bmal1、Clock、Rev-erbα/β、Per和Cry，其中Rev-erbα参与调节昼夜节律、新陈代谢和炎症[23]。关于结肠炎小鼠模型的研究发现药理性激活Rev-erbα能够抑制葡聚糖硫酸钠诱导的炎症[10]。在脂多糖刺激小鼠的肺部炎症模型中检测到大量的炎性细胞因子，且肺组织中REV-ERBα蛋白快速下调[29]，提示Rev-erbα与多种炎性细胞因子的表达密切相关，参与机体炎症反应的进展。该研究结果支持上述观点，观察到脂多糖刺激C2C12成肌细胞分化过程中，伴随炎性细胞因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA表达上调，Rev-erbα呈时间依赖性升高。当敲减Rev-erbα同时添加脂多糖刺激，炎症反应加剧，白细胞介素6和肿瘤坏死因子α mRNA表达水平显著上调。SR9009是Rev-erbα的激动剂，已经在抗炎治疗策略研究领域中被开发应用。该研究用SR9009预处理药理性激活Rev-erbα后添加脂多糖刺激，上述炎性细胞因子的表达则显著下调，提示Rev-erbα可以作为参与调节炎症反应的靶点。已知过表达Rev-erbα能降低脂多糖刺激RAW264细胞的NF-κB信号传导，且通过与NF-κB结合间接抑制白细胞介素6表达[30]，提示Rev-erbα能通过NF-κB信号通路影响炎症反应的强度。上述观点与该研究观察到的结果一致。
CD14与TLRs是天然免疫中重要的模式识别受体，是介导细胞与脂多糖发生反应的关键分子[31]。CD14能够与脂多糖直接结合；TLRs则定位在细胞膜上，可以识别病原体相关分子并激活抗病原体反应[32-33]。TLRs的异常激活会诱发慢性炎症和自身免疫性疾病[34]。已知脂多糖与TLR4结合后能够激活NF-κB通路[19]，NF-κB通路是否被激活可以作为评价TLR4是否具有活性的指标[35]。NF-κB在脂多糖-TLR4引发的炎症反应中发挥重要作用，并作为转录因子帮助白细胞介素1β和白细胞介素6等炎症相关基因启动子反式激活[36-38]。在巨噬细胞中，Rev-erbα抑制TLR4的活性、调控炎症反应强度[39]。该实验脂多糖刺激C2C12成肌细胞分化过程中，TLR4、CD14 mRNA的表达水平随脂多糖刺激时间延长依赖性增加，NF-κB激活引起炎性细胞因子分泌，炎性细胞因子反过来循环刺激NF-κB通路；SR9009预处理激活Rev-erbα可下调TLR4和CD14 mRNA的表达，抑制NF-κB p65的激活，推测Rev-erbα能够通过NF-κB通路调节脂多糖刺激C2C12成肌细胞的炎症反应。靶向Rev-erbα抑制NF-κB通路可能是治疗慢性炎症性疾病减少并发症的一条有效途径。但是单纯靶向激活Rev-erbα可能会诱发高同型半胱氨酸血症和血栓形成，增加发生心脑血管疾病的风险[13]。基于脂多糖刺激C2C12成肌细胞条件下，吲哚丙酸同样通过NF-κB通路发挥抗炎作用，应用吲哚丙酸与SR9009联合作用结果显示，相较于吲哚丙酸+脂多糖组或SR9009+脂多糖组，p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白比值显著下调；通过抑制NF-κB通路，炎症反应减轻，TLR4、CD14、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA的表达水平进一步下降，尤以白细胞介素6的下降更为显著，表明吲哚丙酸与Rev-erbα激动剂SR9009联合抑制NF-κB通路发挥更强的抗炎作用。实验结果将为干预癌症、糖尿病等疾病伴发的慢性炎症反应提供药物治疗策略，进而减轻可能的骨骼肌萎缩并发症。
该研究初步阐明了脂多糖刺激C2C12成肌细胞的炎症反应过程中NF-κB信号通路被激活，吲哚丙酸和Rev-erbα激动剂SR9009都能够通过NF-κB信号通路发挥炎症调节作用，二者联合能够发挥更强的抗炎效果。然而也存在不足之处，仅是体外细胞实验，缺少动物实验，无法评估二者联合是否能降低单纯靶向激活Rev-erbα的潜在风险。
综上所述，研究证明了Rev-erbα激动剂SR9009联合吲哚丙酸可以通过下调NF-κB信号通路减轻脂多糖刺激C2C12成肌细胞的炎症反应，联合抗炎效果优于单独干预。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

SR9009联合吲哚丙酸通过核因子κB信号通路减轻C2C12成肌细胞的炎症反应

SR9009 combined with indolepropionic acid alleviates inflammation in C2C12 myoblasts through the nuclear factor-kappa B signaling pathway

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