转录组测序与定量蛋白质组学分析医用臭氧治疗兔骨骼肌损伤的分子机制

doi:10.12307/2025.636

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (18): 3767-3774.doi: 10.12307/2025.636

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转录组测序与定量蛋白质组学分析医用臭氧治疗兔骨骼肌损伤的分子机制

阮珍1，寇久社2

1咸阳市中心医院麻醉手术部，陕西省咸阳市 712000；2陕西中医药大学第二附属医院，陕西省咸阳市 712000

收稿日期:2024-05-23 接受日期:2024-07-22 出版日期:2025-06-28 发布日期:2024-11-27
通讯作者: 寇久社，主任医师，陕西中医药大学第二附属医院，陕西省咸阳市 712000
作者简介:阮珍，女，1994年生，陕西省渭南市人，汉族，2022年陕西中医药大学毕业，硕士，医师，主要从事软组织创伤修复方面的研究。
基金资助:
陕西省科技计划项目(2019JM-483)，项目负责人：寇久社

RNA sequencing and quantitative proteomics analyses of molecular mechanism of medical ozone therapy for rabbit skeletal muscle injury

Ruan Zhen1, Kou Jiushe2

1Department of Anesthesiology and Surgery, Xianyang Central Hospital, Xianyang 712000, Shaanxi Province, China; 2Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, Shaanxi Province, China

Received:2024-05-23 Accepted:2024-07-22 Online:2025-06-28 Published:2024-11-27
Contact: Kou Jiushe, Chief physician, Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, Shaanxi Province, China
About author:Ruan Zhen, MS, Physician, Department of Anesthesiology and Surgery, Xianyang Central Hospital, Xianyang 712000, Shaanxi Province, China
Supported by:
Shaanxi Provincial Science and Technology Plan Project, No. 2019JM-483 (to KJS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
转录组测序技术：是一种深度测序技术，该技术集合了实验方法和计算机手段的转录组分析方法，它提供了转录结构和转录本表达水平的综合视图，可以确定生物样本中RNA序列的特征性和丰度。目前转录组测序技术已被广泛应用于生物学、医学、药学、农业等多领域。
定量蛋白质组学：是蛋白质组学研究的重要方法，可用于表征蛋白质丰度的变化，发现新的蛋白质-蛋白质及蛋白质-肽相互作用，和大分子复合物的形成情况，并解析信号转导级联过程中细胞器蛋白质组成和磷酸化的时间变化情况，从而帮助人们更加全面地理解生物体内的生理活动规律。

背景：医用臭氧局部注射作为一种新的治疗方法，对损伤的骨骼肌组织具有抗炎、镇痛及免疫调节等作用，但其作用机制尚缺乏系统的研究。
目的：观察医用臭氧对兔骨骼肌挤压伤模型的干预效应，通过转录组测序与标记定量蛋白技术分析损伤的兔胫骨前肌在经过臭氧治疗后基因表达的差异情况，以期揭示医用臭氧治疗骨骼肌损伤的分子机制。
方法：将18只日本大耳白兔随机分为空白组、模型组、臭氧组，每组6只，后两组构建兔胫前肌挤压伤模型。臭氧组在造模12 h后，损伤局部注射30 μg/mL医用臭氧2 mL，臭氧治疗后3 d进行组织取材。采用苏木精-伊红染色观察骨骼肌的形态学变化，并应用转录组测序及串联质谱标签标记定量蛋白技术对兔胫骨前肌组织进行检测，通过生物信息学分析探索组间差异表达基因及蛋白参与的生物学过程，进而探究臭氧治疗骨骼肌损伤的分子机制。
结果与结论：①经臭氧治疗后3 d，与空白组相比，模型组细胞肿胀，可见浸润的炎症细胞，部分肌纤维溶解；相对于模型组，臭氧组细胞水肿有所减轻，炎症细胞减少；②转录组测序及生物信息学分析结果显示：模型组与空白组相比，筛选出596个差异基因；臭氧组与模型组相比，筛选出405个差异基因；取其交集，共筛选出194个共有差异表达的基因；③定量蛋白质分析结果：模型组与空白组相比共有138个差异表达蛋白质，臭氧组与模型组相比共有242个差异表达蛋白，共有的差异表达蛋白有66个；④对共有差异表达的基因/蛋白进行基因本体论及京都基因与基因组百科全书富集分析，发现其主要富集在PI3K-Akt 信号通路、Ras 信号通路、MAPK 信号通路等；⑤提示医用臭氧可能通过作用于Syk、FGF16、CSF-1、MRAS这些关键靶点来调控PI3K/Akt/NF-κB信号通路及Ras/MAPK/NF-κB信号通路，进而促进损伤肌肉组织的修复。
https://orcid.org/0000-0002-1407-8656(阮珍)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨骼肌损伤, 医用臭氧, 转录组测序, 蛋白质组学, 基因差异表达

Abstract: BACKGROUND: As a new treatment method, local injection of medical ozone has anti-inflammatory, analgesic and immunomodulatory effects on injured skeletal muscle tissue, but its mechanism of action is still lacking systematic research.
OBJECTIVE: To observe the intervention effect of medical ozone on skeletal muscle crush injury of rabbit models, and to analyze the differential gene expression of injured rabbit tibialis anterior muscle after ozone treatment through RNA-sequencing and tandem mass tag labeled quantitative proteomic technology, in order to partially reveal the molecular mechanism of medical ozone treatment for skeletal muscle injury.
METHODS: Eighteen Japanese white rabbits were randomly divided into a blank group, a model group, and an ozone group, with 6 rabbits in each group. Rabbit tibialis anterior muscle compression injury models were established in the latter two groups. After 12 hours of model establishment, 2 mL of medical ozone with a mass concentration of 30 μg/mL was injected into the injured muscle of rabbits in the ozone group. Tissue samples were taken 3 days after ozone treatment. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the morphological changes of skeletal muscle. RNA sequencing and tandem mass spectrometry tag were used to detect rabbit tibialis anterior muscle tissue. Bioinformatics analysis was used to explore the biological processes of differentially expressed genes and proteins between groups and then to investigate the molecular mechanism of ozone treatment of skeletal muscle injury.
RESULTS AND CONCLUSION: After 3 days of ozone treatment, compared with the blank group, the model group showed swelling of cells, infiltration of inflammatory cells, and partial dissolution of muscle fibers. Compared with the model group, cell edema was alleviated and the number of inflammatory cells was reduced in the ozone group. (2) The results of RNA sequencing and bioinformatics analysis showed that compared with the blank group, 596 differentially expressed genes were screened in the model group. Compared with the model group, 405 differentially expressed genes were screened in the ozone group. There were a total of 194 differentially expressed genes shared among these differentially expressed genes. Proteomic analysis results exhibited that compared with the blank group, the model group contained 138 differentially expressed proteins. Compared with the model group, 242 differentially expressed proteins were determined in the ozone group. There were 66 differentially expressed proteins shared between the two comparison groups. Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analyses were performed on differentially expressed genes/proteins, and it was found that they were mainly enriched in the PI3K-Akt signaling pathway, Ras signaling pathway, and MAPK signaling pathway. It is indicated that medical ozone may promote the repair of injured muscle through regulating PI3K/Akt/NF-κB and Ras/MAPK/NF-κB signaling pathway by acting on target genes, such as Syk, FGF16, CSF-1, and MRAS.

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Key words: skeletal muscle injury, medical ozone, RNA sequencing, proteomics, differential gene expression

中图分类号:

阮珍, 寇久社. 转录组测序与定量蛋白质组学分析医用臭氧治疗兔骨骼肌损伤的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(18): 3767-3774.

Ruan Zhen, Kou Jiushe. RNA sequencing and quantitative proteomics analyses of molecular mechanism of medical ozone therapy for rabbit skeletal muscle injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(18): 3767-3774.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析 18只日本大耳白兔随机分为空白组、模型组、臭氧组，每组6只。取材后每组3只行苏木精-伊红染色，每组另外3只行转录组测序及蛋白质组学测序。
2.2 各组骨骼肌组织的形态比较苏木精-伊红染色结果显示，空白组肌纤维形态规则，紧密排列，肌膜完整，肌细胞边界清晰，肌细胞核分布均匀；治疗后第3天，与空白组相比，模型组细胞肿胀、可见浸润的炎症细胞，部分肌纤维溶解；相对于模型组，臭氧组细胞水肿有所减轻，炎症细胞浸润明显减少，见图1。

2.3 转录组测序结果分析
2.3.1 差异基因分析见图2。

主成分分析结果显示，空白组和模型组之间的转录本差异较大，臭氧组和空白组之间的差异较小，见图2A。根据基因表达的相似性，主成分分析表明了两组之间不同的方向性，结果表明，臭氧治疗减少了肌肉挤压损伤引起的转录变化。对差异基因进行统计发现，模型组与空白组相比，共有596个差异基因，其中485个基因表达水平上调，111个基因下调；臭氧组与模型组相比，共有405个差异基因，其中64个基因表达水平上调，341个基因下调，见图2B。火山图结果更直接地显示了组间差异基因的分布，见图2E，F。韦恩图显示，模型组/空白组和臭氧组/模型组比较中，有194个共有差异表达的基因，其中180个基因在模型组/空白组中上调，而在臭氧组/模型组中下调，14个基因在模型组/空白组中下调，而在臭氧组/模型组中上调，见图2C，D，表明医用臭氧治疗影响了骨骼肌损伤中的194个基因的表达，这194个基因可能是臭氧治疗骨骼肌损伤的关键基因。对194个共有差异基因双向聚类分析显示：每组内的3个生物重复首先聚在一起，聚类成不同的区间；不同组的组内表达情况基本一致，表明组内相关性强，生物重复性好。相较于空白组和臭氧组，模型组有更多的基因上调；臭氧组和空白组的相似度较高，聚类分层接近，见图3A。
2.3.2 差异基因的富集分析对模型组/空白组与臭氧组/模型组重叠的194个差异表达基因做GO 富集分析，分析结果见图4A，显示共有表达差异基因主要参与细胞表面受体信号通路、细胞黏附生物附着、免疫系统过程等生物学过程；主要富集于细胞表面、细胞外区域、细胞外间隙、膜筏、整合素复合物等细胞组分；参与信号受体结合、细胞黏附分子结合、整合素结合、钙离子结合、磷酸甘油酸酯激酶活性和生长因子受体结合等分子功能。KEGG pathway富集结果见图4B，显示这些差异基因主要富集于肌动蛋白细胞骨架调节、Rap1信号通路、细胞黏附分子、白细胞的跨内皮迁移、趋化因子信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt)信号通路、核因子κB信号通路等。
2.4 蛋白质组学结果分析
2.4.1 差异蛋白的分析模型组与空白组相比，共有 138 个差异表达蛋白质，其中上调的蛋白有 87 个，下调的蛋白有 51 个；臭氧组与模型组相比，共有 242 个差异表达蛋白，其中上调的蛋白有106 个，下调的蛋白有 136 个。蛋白质定量结果统计见图5A。韦恩图显示4组间共有66个差异表达蛋白，44个蛋白在模型组/空白组中上调，而在臭氧组/模型组中下调，10个蛋白在模型组/空白组中下调，而在臭氧组/模型组中上调(图5B，C)。对组间的66个共有差异蛋白进行双向聚类分析显示，组内聚类较好，组内各样本间相关性较好，3组间呈现明显差异，

与转录组结果相一致，见图3B。
2.4.2 差异蛋白富集分析 66个共有差异表达蛋白质主要参与到基于肌动蛋白丝的过程、肌动蛋白细胞骨架组织、原纤维组织等生物学过程；富集到肌动蛋白细胞骨架、细胞骨架部分、细胞骨架等细胞组分，及肌动蛋白结合、细胞骨架蛋白结合、蛋白质结合等分子功能，见图4C。KEGG富集结果显示共富集到了63条信号通路，包含补体和凝血级联、心肌收缩、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、肌动蛋白细胞骨架的调节、PI3K-Akt 信号通路等，见图4D。
2.5 差异表达基因和差异表达蛋白共同富集的KEGG通路分析对模型组/空白组与臭氧组/模型组的差异基因/蛋白取交集得到的194个差异基因和66个差异蛋白，分别对其进行KEGG通路的富集分析。其共同富集到的通路共有36条，主要通路有PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，见表1，2。

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引言

骨骼肌占人体总质量的30%-50%，作为机体最主要的运动器官，骨骼肌收缩为身体运动提供了基本的力量保障和平衡的稳定性。因此，无论何种骨骼肌的损伤都会导致一定程度的活动性障碍。骨骼肌损伤作为慢性软组织损伤的主要类型之一，是生活及体育运动中最为常见的肌纤维损伤，占运动型损伤的10%–55%[1]，其中机械性损伤是骨骼肌损伤中最为常见的类型，包括挫伤、拉伤、挤压伤等。若骨骼肌损伤得不到恰当及时的治疗，损伤愈合迟缓，导致肌肉功能恢复不完全，则易引起损伤复发，诱发瘢痕组织的形成，进而引起功能性障碍[2]。另外，骨骼肌在机体的能量代谢平衡中也发挥着重要的作用[3]。因此，骨骼肌损伤不仅会导致运动障碍，也会导致机体稳态的失衡，严重危害机体健康。
医用臭氧是以医用纯氧制备所得的臭氧-氧气混合气体，具有杀菌、抗炎、抗氧化、镇痛、免疫调节及促进组织再生的能力[4-6]。目前臭氧已广泛应用于多个医学领域，对血管疾病、退行性疾病、口腔疾病、慢性感染、急慢性软组织损伤等疾病均有着明显的疗效[7-11]。作者课题组的前期研究证实，臭氧治疗可明显降低兔骨骼肌损伤后损伤组织及血浆中白细胞介素6及肿瘤坏死因子α等炎症因子的含量，减轻损伤组织的炎症反应，从而加速损伤骨骼肌组织的修复[12-13]。然而，目前对于医用臭氧促进骨骼肌损伤修复的机制尚不明晰。此次研究旨在探索医用臭氧治疗骨骼肌损伤的分子机制，进而为臭氧在骨骼肌损伤方面的进一步研究提供基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，转录组测序及与定量蛋白质组学分析。
1.2 时间及地点实验于2020年10月至2021年6月在陕西中医药大学医学科研实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物与分组健康清洁级雄性日本大耳白兔18只，2月龄，体质量(2.0±0.2) kg，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物合格证号：SCXK(川)2020-030。适应性喂养1周，饲养环境保持通风，自然照明，自由饮食摄水，垫料每日更换。动物护理严格按照《实验动物饲养管理和使用指南》进行[14]。所有实验方案均经陕西中医药大学实验伦理委员会批准(批准号：SUCMDL20190101001)。
1.3.2 主要试剂与仪器医用臭氧治疗仪(型号：ZAMT-100，淄博前沿医疗器械有限公司)，组织脱水机、生物组织包埋机、冷冻台、轮转切片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)，超纯水系统(美国Milli Q纯水系统)，光学显微镜成像系统(德国蔡司公司)，高通量测序仪(Illumina HiSeqTM 2500)，液相色谱仪(美国 Thermo Fisher公司，Zoletil舒泰(维克贸易(上海)有限公司)，40 g/L多聚甲醛(博士德生物工程有限公司)，二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)，PBS(博士德生物工程有限公司)，苏木精-伊红染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，不含RNA酶的无核酸酶水(上海碧云天生物技术有限公司)，FASP Protein Digestion 试剂盒(Abcam 公司)，Trizol试剂盒(Ambion公司)，T4 DNA 聚合酶(上海碧云天生物技术有限公司)，串联质谱蛋白标记试剂盒(美国 Thermo Fisher 公司)。
1.4 方法
1.4.1 造模与干预方法将日本大耳白兔适应性喂养1周后，按照随机数字表随机分为3组：空白组(n=6)、模型组(n=6)、臭氧组(n=6)。后两组采用课题组前期自行设计的兔胫骨前肌损伤模型挤压器制备兔胫骨前肌挤压伤模型[15]，造模12 h后，对臭氧组实施损伤局部臭氧(30 μg/mL)注射治疗：使用医用臭氧治疗仪制备臭氧，在骨骼肌损伤处缓慢推注2 mL的医用臭氧，治疗1次。臭氧治疗后3 d，使用舒泰(替来他明与唑拉西泮1∶1混合)对实验兔进行肌肉注射麻醉(麻醉前实验兔禁食禁水12 h)，麻醉剂量为75 mg/kg。麻醉后各组兔胫骨前肌组织进行取材，组织样本一部分迅速置入液氮中冷冻以提取RNA和蛋白质，一部分置于40 g/L多聚甲醛中固定用于组织学分析。
1.4.2 组织学分析通过苏木精-伊红染色观察各组兔骨骼肌组织，将组织在40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h，然后进行脱水透明后包埋在石蜡中，并以4 μm厚切片进行组织学检查。切片按苏木精-伊红染色试剂盒说明书进行染色，在显微镜下观察组织切片并拍摄图像。

1.4.3 转录组测序分析从每组中随机选择3只兔的骨骼肌样本，用Trizol试剂盒提取总RNA，浓度及纯度采用nanodrop2000检测，完整性采用RNA专用琼脂糖电泳检测。选择总量≥1 μg的total RNA，使用NEBNext UltraⅡ RNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA 尾的mRNA，随后通过离子打断的方式使用二价阳离子将mRNA随机打断，以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物，合成cDNA。对双链cDNA进行纯化，之后进行双末端修复及3’端引入“A”碱基并连接测序接头。用AMPure XP beads筛选400-500 bp的cDNA，进行PCR扩增，完成文库构建工作。质检合格后使用Illumina HiSeqTM 2500测序仪对这些文库进行双末端测序，测序所得原始下机数据(Raw Data)采用fastqc软件对过滤后的数据进行质量控制，获得Clean Reads后，使用hisat 2软件将过滤后的Clean Reads比对到参考基因组，使用htseq将hisat 2所输出的sam文件进行计数，得到每一个基因上的Read Count值，用每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片进行标准化。使用R包DESeq对空白组与模型组、模型组与臭氧组的基因表达进行比较分析，筛选差异表达基因条件为：表达差异倍数|log2 Fold Change|> 1，显著性P < 0.05。使用在线DAVID工具(https://david.ncifcrf.gov/)对筛选出的差异基因进行基因本体论(Gene Ontology，GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析。
1.4.4 串联质谱标记定量蛋白检测分析使用碧云天公司的BCA试剂盒按照说明书操作对蛋白含量进行测定。采用滤膜辅助酶解方法(FASP Protein Digestion Kit)进行胰蛋白酶酶解，各样品分别取100 μg，按照 Thermo Fisher 公司串联质谱蛋白标记试剂盒说明书进行标记。将每组标记后的肽段混合，采用 AKTA Purifier 25进行分级。应用纳升流速高效液相色谱系统进行分离。应用Mascot 2.2 和Proteome Discoverer 1.4软件，根据液相色谱质谱/质谱联用分析获得的RAW 文件的原始数据，进行查库鉴定及定量分析。然后以差异倍数变化大于1.2倍且 P值小于0.05 的标准筛选差异表达蛋白质，进行组间差异表达蛋白数目比较。对相关蛋白质集合进行 GO注释及KEGG通路富集。
1.5 主要观察指标苏木精-伊红染色法观察各组兔骨骼肌组织的形态学变化，对损伤的骨骼肌组织进行转录组测序及标记定量蛋白检测后，分析得到差异表达基因/蛋白，对差异表达基因/蛋白进行GO、KEGG等生信分析，观察空白组与模型组、臭氧组与模型组之间的变化，分析臭氧治疗对骨骼肌损伤产生的影响。

讨论

医用臭氧具有强烈的氧化性和杀菌作用，可以抑制炎症反应过程。医用臭氧通过减少炎症递质的释放，抑制白细胞活化，从而起到抗炎作用，减少组织损伤；同时可以增加血液中氧气的供应量，促进血管新生、改善微循环、增加氧气和营养物质的供应，促进组织再生[16-17]。
很少有研究关注医用臭氧在骨骼肌损伤修复中的作用。此次研究中，应用组学分析来探讨医用臭氧在骨骼肌损伤修复中的作用机制。炎症是肌肉组织损伤的早期反应，首先发挥作用的是中性粒细胞，吞噬外来病原体，随后单核细胞被招募到炎症区域分化成M0巨噬细胞，接着促炎环境会使得M0继续分化成M1巨噬细胞，主要参与吞噬和清除细胞碎片，同时还可以分泌大量的促炎因子，包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6等，这些促炎因子在清除病原微生物及损伤组织的同时，也会引发炎症的级联反应，介导活性氧的产生，加重组织损伤，破坏组织再生。抗炎环境会使得M0转换为M2型巨噬细胞[18]，M2型巨噬细胞通过分泌白细胞介素10、胰岛素样生长因子1、血管内皮生长因子等来影响再生部位的微环境，以促进成肌细胞分化与融合、抑制骨骼肌细胞凋亡、促进损伤骨骼肌部位的血管再生，进而帮助形成新的肌纤维[19-21]。
通过转录组测序和串联质谱标记定量蛋白质组学技术，结合生物信息学分析，作者发现臭氧可能通过PI3K-Akt 信号通路、Ras 信号通路及MAPK信号通路发挥作用。富集到这3条通路的基因多数与巨噬细胞及炎症相关。Syk是一种胞内酪氨酸激酶，在巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞和B细胞中是免疫受体信号传导的重要介质。研究发现，SYK的磷酸化可进一步激活核因子κB信号通路，引起巨噬细胞释放炎症因子，促进炎症反应，加重损伤[22]。在类风湿关节炎中，Syk的表达与关节炎症细胞浸润水平相关，Syk抑制剂具有有效的抗炎活性，可改善类风湿关节炎患者的临床症状[23]。FGF16，为成纤维细胞生长因子，FGFs结合相应的FGFR激活下游信号通路，如 PI3K/AKT、RAS/MAPK，从而调节细胞生长、免疫调节和血管生成等。研究表明，激活的FGFR1信号通过核因子κB信号诱导趋化因子CX3CL1表达促进了巨噬细胞募集[24]。CSF-1、集落刺激因子1、核因子κB被证明可以通过促进具有调控巨噬细胞生产和分化功能的CSF-1存活来影响炎症细胞功能[25]。CSF-1可以保持中性粒细胞的活性，并激活它们产生炎症递质，在类风湿关节炎动物模型的研究中表明，CSF-1的高表达加重了组织的炎症性损伤并诱发炎症性疼痛[26]。
此次研究结果显示，骨骼肌损伤后Syk、FGF16、CSF-1的表达均上调，而经臭氧治疗后这些基因的表达下调(表3)，表明臭氧通过作用于Syk、FGF16、CSF-1来调控PI3K-Akt 信号通路。已有研究发现PI3K/Akt途径及其下游靶标是巨噬细胞活化表型的中心调节因子[27]。核因子κB通路位于PI3K/Akt通路的下游，在骨骼肌损伤中发挥着重要作用[28]。此次实验数据显示，对共有的194个差异基因的KEGG富集分析结果中也包含了核因子κB信号通路，见图5B。PI3K/Akt可以通过p65和IKK的磷酸化参与核因子κB通路的调节[29]。据报道，非特异性阻断PI3K/AKT后，核因子κB依赖性上调的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6受到强烈抑制[30]，表明臭氧可以通过下调Syk、FGF16、CSF-1的表达进而抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路，发挥其抑制骨骼肌损伤早期炎症反应的作用。MRAS为编码Ras家族的小GTP酶成员，是MAPK信号通路的抑制子基因。经臭氧治疗后，损伤骨骼肌中MRAS的表达上调(表3)，表明臭氧可以抑制MAPK信号通路。FGF16、CSF-1也富集于MAPK信号通路，进一步验证了臭氧能抑制MAPK信号通路。研究表明抑制MAPK和核因子κB信号级联能够显著地抑制脂多糖引发的RAW264.7巨噬细胞的炎症反应[31]。Ras已被证明可以通过多种信号通路抑制骨骼肌生成，MAPK是Ras 的主要下游效应子，在 Ras 成肌细胞的分化缺陷表型中起着发挥着作用；另一个Ras信号转导靶点核因子κB已被证明可以通过刺激细胞周期蛋白D1积累和细胞周期进程来抑制肌发生[32]。表明臭氧可能通过作用于FGF16、CSF1及MRAS抑制Ras/MAPK/NF-κB信号通路，促进损伤骨骼肌修复。

另外，核因子κB信号通路的激活使巨噬细胞极化向 M1 表型倾斜。转录组中的结果显示M1型巨噬细胞标志物相关的基因CD80、CD68、TLR2、TLR4、TNFRSF1B、IL1RL1均在模型组/空白组中上调，而在臭氧组/模型组中下调(表4)。

因此，作者推测臭氧可能作用于Syk、FGF16、CSF-1、MRAS这些关键靶点来调控PI3K/Akt/NF-κB信号通路及Ras/MAPK/NF-κB信号通路抑制巨噬细胞的 M1 极化，进而促进组织损伤修复。此次研究的不足之处在于只取了治疗后第3天的样本，不能连续性观察臭氧对于骨骼肌的损伤修复作用；每组的样本只有3个重复，个体间可能存在差异。未来将扩大样本，多时间点、动态性地观察臭氧对骨骼肌损伤修复的效应，进一步阐明医用臭氧治疗骨骼肌损伤的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

转录组测序与定量蛋白质组学分析医用臭氧治疗兔骨骼肌损伤的分子机制

RNA sequencing and quantitative proteomics analyses of molecular mechanism of medical ozone therapy for rabbit skeletal muscle injury

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