2.1   实验动物数量分析   ①小鼠模型：实验选用小鼠45只，分别作为假手术组和缺血再灌注组，其中缺血再灌注组造模成功的小鼠有21只，成功率为70%。②大鼠模型：实验选用大鼠15只，分别作为假手术组和缺血再灌注组，其中缺血再灌注组造模成功的小鼠有8只，成功率为80%。
2.2   深度测序鉴定心肌缺血再灌注模型中大量piRNA表达水平上调   缺血再灌注模型通常用于临床再灌注损伤的研究。在C57小鼠心脏中构建了缺血再灌注模型及假手术模型，进行RNA深度测序。测序结果显示，小鼠心脏中约表达1 200种piRNA，其中高表达的piRNA有10%左右。筛选出正常和缺血再灌注损伤小鼠心脏中差异表达的422种piRNA，其中约有289条piRNA在缺血再灌注模型中表达水平显著上调，133条piRNA表达水平显著下调。选取了其中18条表达水平显著上调的piRNA，对其丰度进行统计分析，见图1。经过筛选，最终以表达水平显著上调的AB350089.1(piRNA-5938)作为研究对象。



2.3   心肌缺血再灌注动物模型中piRNA-5938表达水平均显著上调    为验证测序结果，分别在C57小鼠和SD大鼠心脏中构建缺血再灌注模型及其假手术模型，实时荧光定量PCR实验检测piRNA-5938表达水平。结果显示，相对于假手术组，缺血再灌注组小鼠心脏组织中piRNA-5938的表达水平上调约3.5倍(P < 0.01)，见图2A。相对于假手术组，缺血再灌注组大鼠心脏组织中piRNA-5938的表达水平上调超过6倍(P < 0.01)，见图2B。



2.4   双氧水诱导心肌细胞凋亡模型中piRNA-5938表达水平显著上调   缺血再灌注损伤发生后，损伤部位会有活性氧自由基释放，引起细胞凋亡。为模拟再灌注损伤中氧化自由基引起的细胞凋亡，使用双氧水诱导SD大鼠乳鼠原代心肌细胞凋亡，实时荧光定量PCR实验结果表明，相较于空白对照组，100 μmol/L双氧水处理后，piRNA-5938的表达水平无显著变化。加大双氧水浓度后，200 μmol/L双氧水处理组中，piRNA的表达水平上调约1.8倍(P < 0.05)，500 μmol/L双氧水处理组中，piRNA-5938上调超过4倍(P < 0.01)，表明原代心肌细胞中piRNA-5938的上调程度呈与双氧水浓度呈正相关，即具有浓度依赖性，见图3。



2.5   缺氧再复氧诱导心肌细胞凋亡模型中piRNA-5938表达水平显著上调   缺血再灌注时心肌细胞缺氧再复氧，往往发生氧反常，心肌细胞发生凋亡。因此构建缺氧再复氧诱导心肌细胞凋亡模型，以探究piRNA-5938的表达情况。结果显示，随着缺氧时间的增加，原代心肌细胞中piRNA-5938的表达水平逐渐上调(10 min组上调约1.5倍，30 min组约2.5倍，60 min组3 倍多)，见图4A。相较于空白对照组，缺氧再复氧心肌细胞中piRNA-5938的表达水平上调超过3倍(P < 0.01)，见图4B。



2.6   piRNA-5938拮抗剂显著抑制内源性piRNA-5938的表达   为研究piRNA-5938在心肌损伤中的作用，合成了piRNA-5938特异性拮抗剂(antagomir)及其阴性对照(antagomir NC)，转染原代心肌细胞后，实时荧光定量PCR法检测抑制效果。实验结果显示，转染了piRNA-5938拮抗剂的心肌细胞中，piRNA-5938的表达水平较阴性对照组下调约50%(P < 0.05)，证实piRNA-5938拮抗剂对内源性piRNA-5938的抑制作用，见图5。



2.7   piRNA-5938调控心肌细胞凋亡   文献报道双氧水可诱导细胞凋亡，TUNEL实验结果也证实，200 μmol/L双氧水处理组后，细胞凋亡率相对空白对照组显著提高，即低浓度的双氧水诱导了原代心肌细胞凋亡，见图6。之前的结果显示，双氧水处理心肌细胞后piRNA-5938的表达水平显著上调，因此猜测piRNA-5938可能调控了双氧水诱导的心肌细胞凋亡。TUNEL法检测心肌细胞凋亡结果显示，与阴性对照组相比，转染piRNA-5938拮抗剂的心肌细胞再经双氧水处理，发生凋亡的细胞数目显著减少，凋亡率由约34%降低到约22%，降低了30%左右(P < 0.05)。以上结果表明，抑制内源性的piRNA-5938显著抑制了双氧水诱导的心肌细胞凋亡，起到心肌保护作用。



2.8   piRNA-5938调控心肌细胞线粒体分裂   文献报道线粒体分裂参与了细胞凋亡的发生，那么piRNA-5938是否调控线粒体分裂。MitoTracker线粒体探针染色结果显示，相对于空白对照组，双氧水处理后，线粒体分裂率显著提高，说明双氧水诱导了心肌细胞线粒体分裂。而抑制内源性piRNA-5938表达后，相对于阴性对照组，线粒体分裂率降低了约34%，线粒体分裂情况显著减少(P < 0.05)，见图7。以上结果表明piRNA-5938调控了双氧水诱导的线粒体分裂，敲低piRNA-5938抑制了线粒体分裂。




2.9   生物信息学方法预测piRNA-5938靶向线粒体网络调控分子miR-324和miR-668   进一步寻找piRNA-5938调控线粒体分裂的下游靶标。RNAhybrid软件分析了piRNA和microRNA序列，结果显示，piRNA-5938分别与miR-324和miR-668序列能够很好地互补配对，提示piRNA-5938在体内可能与miR-324和miR-668相互结合。已有研究表明miR-324和miR-668是线粒体动态网络调控的重要分子，miR-324通过抑制线粒体分裂调控因子Mtfr1进而抑制了线粒体分裂、心肌细胞凋亡和心肌梗死。miR-668通过靶向线粒体分裂蛋白Mtp18进而抑制了缺氧和缺血引起的线粒体分裂。因此，大胆推测piRNA-5938可能通过靶向结合miR-324或miR-668进而参与miR-324/Mtfr或miR-668/Mtp18线粒体分裂调控途径，见图8。

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心血管疾病严重危害人类生命健康，是造成全球范围内患者死亡的主要原因之一，其中以急性心肌梗死为代表的冠状动脉疾病危害最为严重[1]。目前治疗心肌梗死的主要有效手段是使闭塞的冠状动脉再通，心肌得到血液再灌注，然而心肌长时间缺血后，进行再灌注反而造成心肌细胞进一步丢失和不可挽回的损失，即缺血再灌注损伤。缺血再灌注的心脏出现钙反常、氧反常和pH反常现象，自由基增多，大量心肌细胞发生凋亡。由于心肌细胞是终末分化细胞，缺失后不能通过细胞增殖来补偿，因此可导致严重心肌损伤、心功能降低甚至心衰[2]。心脏为血液循环提供动力，富含线粒体[3]，线粒体不断进行着分裂和融合形成动态网状结构，这不仅对于维持线粒体的保真性必不可少，也在细胞凋亡中起到关键调控作用。线粒体融合能够抑制凋亡，而线粒体分裂则促进了凋亡的发生[4-5]，然而线粒体分裂与融合在心肌缺血再灌注损伤中发挥何种作用至今仍有很多疑问。

研究表明，心肌缺血再灌注损伤涉及广泛的表观遗传学调控机制。其中非编码RNAs是调控心肌缺血再灌注发生发展的一类关键表观遗传学调控分子[6-7]，例如，在再灌注的心脏组织和氧化损伤的心肌细胞中，miR-135b表达水平显著下调；过表达miR-135b激活了核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1/白细胞介素1β信号通路，从而抑制心肌细胞凋亡，抵抗缺血再灌注损伤[8]；长链非编码RNA-TUG1(lncRNA-TUG1)作为miR-9的竞争性内源性RNA，促进了心肌再灌注的发生以及心肌细胞凋亡[9]。

PIWI相互作用RNA(PIWI-Interacting RNA，piRNA)是最新发现的一类长度为26-31 nt的单链非编码小RNA[10]。piRNA最初在生殖系统中被鉴定，对抑制转座子、维持生殖系基因组完整性、生殖细胞发育、性别决定以及生殖系统功能维持都具有极其重要的调控作用[11-14]。随着研究的深入，人们发现piRNA不仅存在于生殖系统，还广泛表达于多种体细胞中，调控了神经退行性疾病以及多种肿瘤的发生发展[15-18]。最新研究报道piRNA参与了心脏病理过程调控[19-20]。piRNA-CHAPIR通过形成CHAPIR-PIWIL4 复合物与 METTL3 相互作用，并阻断 Parp10 mRNA 转录物的 m6A 甲基化，从而上调 PARP10 表达，促进病理性肥大和心脏重塑[19]。YANG等[20]对心力衰竭患者和健康志愿者的血清外泌体进行RNA测序，发现585个piRNA在心力衰竭患者中上调，4 623个piRNA下调，说明心力衰竭患者血清外泌体中piRNA的表达存在显著差异，piRNA是心力衰竭的潜在生物标志物。然而piRNA在心脏病理性过程中的功能并不明确，具体分子机制尚不清楚，尤其涉及线粒体网络调控机制的相关研究未见报道。因而，此次研究将探索piRNA-5938在心肌细胞凋亡和线粒体分裂中的作用，旨在揭示心肌损伤的致病机制，为心肌缺血再灌注损伤及其他心血管疾病的防治提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   细胞生物学实验、动物实验与生物信息学分析，两组间比较采用t检验，多组(两组以上)间比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年9月至2021年11月在山西医科大学基础医学院细胞生理学教育部重点实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   8-10周龄的C57BL/6J雄性SPF级小鼠45只，体质量20-22 g；SD雄性SPF级大鼠15只，体质量250-280 g，均购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。所有动物饲养于SPF级洁净动物房，温度(22±1) ℃，湿度50%-60%，12 h/12 h明暗交替，给予专用饲料及纯净饮用水。
1.3.2   实验动物随机分组   将小鼠编号为1-45，用计算机生成15个随机数字，对应编号的小鼠进行只开胸不结扎的假手术组，剩余30只小鼠进行缺血再灌注手术。

将大鼠编号为1-15，用计算机生成5个随机数字，对应编号的大鼠分到假手术组，剩余10只大鼠分到缺血再灌注组。

实验方案经山西医科大学伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.3   实验试剂   H2O2(南京试剂)，anta-5938(上海吉玛制药技术有限公司)，anta-5938 NC(上海吉玛制药技术有限公司)，DMEM高糖培养基(Hyclone公司，F12)，胎牛血清(Cellmax细胞技术有限公司，SA112.02)，胰蛋白酶消化液(博士德生物工程有限公司，PYG0014)，PBS(博士德生物工程有限公司，PYG0021)，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(翌圣生物科技股份有限公司，40307ES20)，Mito Tracker线粒体红色荧光探针试剂盒(翌圣生物科技股份有限公司，40741ES50)。
1.3.4   实验仪器   细胞培养箱(Forma Scientific公司)，超净工作台(苏净安泰)，低速离心机(Eppendorf公司)，低温高速离心机(Beckman公司)，QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪(Thermo公司)，倒置荧光显微镜(Olympus公司)，激光共聚焦荧光显微镜(Olympus公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   原代心肌细胞分离及培养   将SD大鼠乳鼠(一二日龄)颈椎脱臼处死后，在超净工作台内取出心脏组织，置于预冷的1×PBS中，洗净心脏表面血液。洗净后，将心脏组织浸泡在洁净的PBS中，用无菌刀片切细切碎。加入细胞消化液(含胰液素和Ⅱ型胶原酶)，置于37 ℃水浴锅中水浴消化5 min左右，待组织固状物大量溶解后，添加胎牛血清以终止消化。重复消化步骤，直至组织块大体观察几乎看不见为止，离心去除上清液，用PBS重悬细胞沉淀，再次离心去除上清液，用完全培养基重悬细胞，将浓度调整为1×109 L-1的细胞悬液接种于培养瓶中，置于细胞培养箱中，静置1 h进行差速贴壁去除成纤维细胞。轻轻吸出细胞悬液进行离心，去除上清，用含体积分数5%胎牛血清和10-4 mol/L Brdu的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于培养瓶中。
1.4.2   细胞药物处理及缺氧再复氧处理   

药物处理：设置浓度梯度为100，200，500 µmol/L的实验组与0 µmol/L对照组，待分离好的原代心肌细胞汇合度到达80%左右时，加入不同浓度的 H2O2，置于37 ℃，体积分数5%的CO2细胞培养箱中进行孵育。

缺氧再复氧处理：取原代心肌细胞，置于37 ℃，N2 体积分数95%、CO2体积分数5%的缺氧培养箱中孵育6 h，然后置于37 ℃，O2体积分数95%、CO2体积分数5%的培养箱中孵育12 h。
1.4.3   缺血再灌注手术   腹腔注射1%戊巴比妥钠50 mg/kg对大鼠和小鼠进行麻醉。麻醉后将动物仰卧位固定，备皮，沿颈部中线切开暴露气管，经口气管插管，连接小动物呼吸机，连接BL-420生物机能系统，记录心电图。将动物置右侧卧位，进行左侧开胸手术，逐层钝性分离胸肌，使用组织钳及撑开器于左侧第三四肋间打开手术视野，在左心耳下缘处用手术缝线(小鼠7-0规格；大鼠用6-0规格)穿过冠状动脉左前降支，在心脏表面垫一小段直径1.7 mm，长度5 mm的无菌塑料管，缝线连同塑料管一同打结，以阻断左前降支血流，心尖处组织变白及心电图特征性指示表示组织缺血，45 min后解开线结即恢复血供，实现再灌注。关闭胸腔，撤掉气管插管，将动物置于加热垫上等待苏醒。再灌注3 h后，迅速分离存活动物的心脏，收集缺血区域的组织样本，置于-80 ℃冰箱以供后续分析。假手术组仅开胸，并在相同解剖部位穿过缝线，但不做结扎处理。

1.4.4   实时荧光定量PCR法检测piRNA-5938表达变化   缺血再灌注手术后，利用Trizol法提取心肌组织总RNA，使用NanoDrop分光光度计测量RNA浓度和纯度。反转录合成cDNA，使用实时荧光定量PCR法检测小鼠和大鼠心脏组织中piRNA-5938表达的变化；H2O2处理以及缺氧再复氧处理后，利用Trizol法提取心肌细胞总RNA，使用实时荧光定量PCR法检测原代心肌细胞中piRNA-5938表达变化。

piRNA-5938及内参U6的引物序列见表1。

1.4.5   转染piRNA-5938拮抗剂   设计甲氧基修饰的piRNA-5938拮抗剂用于抑制内源性的piRNA-5938表达。piRNA-5938拮抗剂序列为5’-GUG CCG AAU CCU AAC CAC UAG ACC ACC AGG GA-3’，由上海吉玛制药技术有限公司合成。转染piRNA-5938特异性拮抗剂，观察其对双氧水诱导心肌细胞凋亡及线粒体分裂的影响。
1.4.6   TUNEL实验   取正常培养的原代心肌细胞，实验分组为空白对照组、H2O2处理组、piRNA-5938特异性拮抗剂anta-5938转染与H2O2共处理组、piRNA-5938阴性对照anta-5938 NC转染与H2O2共处理组(NC为空载体的阴性对照)。转染步骤如下：配制转染体系，将2 µL anta-5938或 anta-5938 NC(终浓度50 nmol/L)与50 µL opti-MEMⅠ培养基(ThermoFisher)充分混匀(记为混合物1)，将2 µL lipo2000与50 µL opti-MEMⅠ培养基充分混匀(记为混合物2)，室温静置5 min。将混合物2加入混合物1中并且充分混匀，室温静置20 min。将上述转染体系(约100 µL)加入含原代心肌细胞(细胞会合度约80%，体积分数2%血清浓度)的24孔板中，轻轻混匀后置于37 ℃细胞培养箱中孵育24 h。将细胞换成新鲜的完全培养基(体积分数5%血清浓度)，用200 µmol/L双氧水处理12 h。将诱导处理后的细胞用PBS清洗2次，依次进行：40 g/L多聚甲醛固定、0.2%Triton X-100通透、1×Equilibration Buffer孵育、TdT缓冲液避光孵育、PBS室温孵育2次、2 mg/L DAPI溶液避光染色，去离子水室温洗涤3次，立即在荧光显微镜下观察。
1.4.7   线粒体染色   取正常培养的原代心肌细胞种植于玻片上制作细胞爬片，PBS清洗1次，加入0.02 µmol/L线粒体红色探针，37 ℃细胞培养箱中孵育15 min。去除探针，PBS清洗3次，每次5 min。使用含DAPI的防淬灭剂进行封固，激光共聚焦荧光显微镜观察线粒体形态。
1.4.8   生物信息学分析   使用RNAhybrid软件分析piRNA-5938与miRNA的相互作用情况，用于预测piRNA的目标miRNA。
1.5   主要观察指标   ①缺血再灌注手术后，小鼠和大鼠心脏组织中piRNA-5938表达的变化；②H2O2处理后，原代心肌细胞中piRNA-5938表达变化；③缺氧再复氧处理后，原代心肌细胞中piRNA-5938表达变化；④转染piRNA-5938特异性拮抗剂，观察其对双氧水诱导心肌细胞凋亡的影响；⑤转染piRNA-5938特异性拮抗剂，观察其对双氧水诱导心肌细胞线粒体分裂的影响；⑥生物信息学结果分析。
1.6   统计学分析   此文统计学方法已经山西医科大学生物统计学专家审核。使用SPSS 18.0和GraphpadPrism 8.0.2软件进行数据统计学分析及结果绘图。所有结果均以x±s表示，多组间比较用单因素方差分析，P < 0.05表明差异有显著性意义。

心肌缺血再灌注损伤是在心脏缺血的基础上，恢复血流灌注，使缺血所致的心肌损伤进一步加重，甚至发生不可逆性损伤的现象。心肌缺血再灌注发生时伴随着氧反常、钙反常和氧化自由基积累，这些均会导致心肌细胞凋亡的发生。因此，心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中扮演了重要角色[21-22]。此次研究发现缺血再灌注的心肌组织与正常心肌组织相比，piRNA的表达谱发生大规模变化。作者选取了缺血再灌注表达丰度显著增加的piRNA-5938作为研究对象，构建心肌缺血再灌注动物模型，双氧水诱导心肌细胞凋亡模型，以及心肌细胞缺氧再复氧模型，无论是在动物水平还是细胞水平，损伤心肌中piRNA-5938的表达水平均显著上调。作者合成了piRNA-5938特异性拮抗剂成功抑制了内源性piRNA-5938的表达，敲低piRNA-5938后，双氧水诱导的心肌细胞凋亡情况明显改善，同时线粒体分裂也被显著抑制。生物信息学方法预测piRNA-5938可能通过靶向结合线粒体分裂调控分子miR-324和/或miR-668，进而发挥促进线粒体分裂和心肌细胞凋亡的作用。

非编码RNA是在表观遗传学层面调控心脏病理过程的一类重要分子，然而目前相关研究主要集中于microRNA、长链非编码RNA以及环状RNA，对于piRNA在心肌损伤和心脏疾病中的研究少之又少。研究表明，piRNA在心脏中高表达，心脏病理模型中piRNA的表达谱发生大幅改变，大量piRNA表达水平上调或下调，而人为控制piRNA的表达减轻了心脏疾病的表型。piRNA在心肌细胞、心脏祖细胞以及心肌成纤维细胞中存在表达差异，piRNA的表达调控与抑制LINE-1并激活AKT信号转导通路、进而减少心脏缺血性损伤有关[23]。肺动脉高压患者细胞外囊泡中的piRNA-DQ593039表达上调，可能作为肺和心脏疾病潜在的生物标志物[24]，提示piRNA在心脏疾病的发生发展中发挥了重要调控作用，相关研究亟待开展。此次研究发现piRNA-5938调控了心肌细胞凋亡和线粒体分裂，丰富了piRNA的功能，拓宽了非编码RNA调控心脏疾病的分子网络，发现了新的心肌损伤调控机制。

piRNA和PIWI蛋白是piRNA调控途径中关键参与者，二者相互作用以实现转座子抑制与DNA甲基化。其中，PIWI蛋白与Argonaute(Ago)蛋白介导的RNA沉默相互独立，是小干扰RNA调控途径的关键成分。piRNAs与miRNAs和小干扰RNAs(siRNAs)具有一定相似性，因此被统称为基因表达的负调节剂[25-26]。PIWI蛋白MIWI2及其相关的piRNA通过SPOCD1引导转座子DNA从头甲基化，piRNA通路对于IAP元件和LINE1的几个亚家族的从头DNA甲基化是必不可少的，也是piRNA参与表观遗传调控的重要途径[27]。

最新研究发现，PIWIL1/piR-DQ593109通过MEG3/miR-330-5p/RUNX3轴调节血肿瘤屏障的通透性：敲低PIWIL1/piR-DQ593109可减少MEG3降解，负调控miR-330-5p靶基因，恢复上调RUNX3并增强血肿瘤屏障的通透性[28]。LIU等[29]研究了PIWIL 3/piR-30188/OIP5-AS1通过miR-367-3p/CEBPA/TRAF4途径内源性调节胶质瘤细胞生物学行为的机制，过表达PIWIL 3/piR-30188显著上调了miR367-3p水平，从而抑制CEBPA和TRAF4的表达，促进胶质瘤细胞凋亡。piR-DQ590027通过靶向MIR17HG，与下游的miR-153和miR-377分别结合，对调节胶质瘤条件性正常血脑屏障通透性具有重要作用[30]。MicroRNAs通过干扰基因转录后表达，在心脏病理过程中发挥了重要的调控作用，形成了广泛而复杂的分子网络[31-33]。作者的工作预测piR-5938能够靶向结合miR-324和miR-668，进而通过microRNA发挥作用，丰富了piRNA的作用方式，同时将piRNA分子网络和microRNA分子网络连接在一起，拓宽了心脏疾病的调控网络。

心肌缺血再灌注损伤发生时，损伤部位心肌细胞的死亡形式有多种，如凋亡、坏死、自噬、焦亡、铁死亡等等[34-36]。此次研究证实低浓度(200 µmol/L)双氧水诱导的心肌细胞凋亡模型中，piRNA-5938的表达水平显著升高，敲低piRNA-5938抑制了双氧水诱导的细胞凋亡和线粒体分裂。在研究过程中，作者还发现高浓度(500 µmol/L)双氧水诱导的细胞坏死模型中，piRNA-5938的表达水平也显著升高(图3)。由此作者猜测piRNA-5938除了调控心肌细胞凋亡，可能还参与了心肌细胞坏死的调控，未来会对piRNA-5938在心肌细胞程序性坏死中的作用展开研究，并探讨piRNA-5938调控的凋亡与坏死之间的关联。

血清肌钙蛋白目前被用作心肌梗死的临床诊断标志物，但其释放时间的延迟往往导致敏感性较低[37]。血液中循环miRNAs由于其在血浆中的稳定性、特异性和敏感性，近年来已成为潜在的心肌梗死诊断或预后的生物标志物。MiR-423-5p在心力衰竭患者和健康对照组以及其他原因导致呼吸困难的患者之间存在差异表达[38]。在急性心肌梗死中差异表达的miRNA，包括低水平的miR-103-3p、miR-142-3p和高水平的miR‐148b、miR-499都被认为是与心肌梗死患者治疗和预后反应相关的miRNA[39-42]。PiRNA与microRNA类似，也是一类稳定灵敏响应心肌损伤的小分子RNA。对心力衰竭患者和健康志愿者的血清外泌体进行RNA测序，发现585个piRNA在心力衰竭患者中上调，4 623个piRNA下调[20]。此次研究发现缺血再灌注小鼠心脏中，289条piRNA表达水平显著上调，133条piRNA表达水平显著下调；在心肌缺血再灌注损伤大鼠模型、小鼠模型和细胞模型中，piRNA-5938的表达水平均大幅度显著上调。下一步作者将检测piRNA-5938在心脏疾病患者和健康人群血清中的表达水平，揭示血液循环中piRNA-5938表达水平与不同心脏疾病的关系，为将其开发成为心脏疾病的临床诊断标志物做出贡献。同时，对piRNA-5938在心肌缺血再灌注损伤中的功能研究，将为心脏疾病的预防和治疗提供新靶点。

结论：此次研究发现piRNA-5938在缺血再灌注损伤心脏中表达水平显著上调，同时，piRNA-5938在双氧水和缺氧再复氧诱导的心肌细胞凋亡模型中表达水平也大幅度上调。敲低piRNA-5938显著抑制了心肌细胞凋亡和线粒体分裂。在探寻piRNA-5938的下游靶标时，发现piRNA-5938与线粒体分裂调控分子miR-324和miR-668的序列均能够很好地互补配对，由此推测piRNA-5938可能通过靶向结合miR-324或miR-668参与线粒体分裂调控途径，抑制心肌细胞凋亡。此次研究可为心血管疾病的临床诊疗提供重要理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
piRNA：即PIWI相互作用RNA，是一类新发现的长度26-31 nt的单链非编码小RNA，序列5’端具有尿嘧啶偏向性，通过“乒乓机制”产生并成熟。已被证明同时存在于生殖细胞和体细胞中，在生殖系完整性、肿瘤、神经退行性疾病和干细胞发育中发挥作用，最新报道参与了心脏病理过程调控。
线粒体分裂：线粒体不断进行着分裂和融合形成动态网状结构，这不仅对于维持线粒体的保真性必不可少，也在细胞凋亡中起到关键调控作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

PIWI相互作用RNA(PIWI-Interacting RNA，piRNA)是最新发现的一类长度约26-31nt的单链非编码小RNA。piRNA最初在生殖系统中被鉴定，对抑制转座子、维持生殖系基因组完整性、生殖细胞发育、性别决定以及生殖系统功能维持都具有及其重要的调控作用。随着研究的深入，人们发现piRNA不仅存在于生殖系统，还广泛表达于多种体细胞中，调控了神经退行性疾病以及多种肿瘤的发生发展。最新研究报道piRNA参与了心脏病理过程调控。piRNA是心力衰竭的潜在生物标志物。然而piRNA在心脏病理性过程中的功能并不明确，具体分子机制尚不清楚，尤其涉及线粒体网络调控机制的相关研究未见报道。因而，此次研究将探索piRNA-5938在心肌细胞凋亡和线粒体分裂中的作用，旨在揭示心肌损伤的致病机制，为心肌缺血再灌注损伤及其他心血管疾病的防治提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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