纳米壳聚糖对MC3T3-E1成骨细胞生长的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.006

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (42): 7375-7381.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.006

• 纳米生物材料 nanobiomaterials • 上一篇下一篇

纳米壳聚糖对MC3T3-E1成骨细胞生长的影响

王丽婷^{1, 2}，周钢¹，樊瑜波1

1北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京市 100191
2国家康复辅具研究中心，北京市 100176

收稿日期:2013-04-15 修回日期:2013-05-30 出版日期:2013-10-15 发布日期:2013-10-31
通讯作者: 樊瑜波，教授，北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京市 100191 yubofan@buaa.edu.cn
作者简介:王丽婷☆，女，1978年生，山东省淄博市人，汉族，在读博士，助理研究员，主要从事生物材料研究。 wlt6301@sohu.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(11120101001，10925208)**

Insight into nano chitosan effects on MC3T3-E1 cell growth

Wang Li-ting^{1, 2}, Zhou Gang¹, Fan Yu-bo¹

1School of Biology and Medical Engineering, Beihang University, Beijing 100191, China
2National Research Center for Rehabilitation Technical Aids, Beijing 100176, China

Received:2013-04-15 Revised:2013-05-30 Online:2013-10-15 Published:2013-10-31
Contact: Fan Yu-bo, Professor, School of Biology and Medical Engineering, Beihang University, Beijing 100191, China yubofan@buaa.edu.cn
About author:Wang Li-ting☆, Studying for doctorate, Assistant researcher, School of Biology and Medical Engineering, Beihang University, Beijing 100191, China; National Research Center for Rehabilitation Technical Aids, Beijing 100176, China wlt6301@sohu.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 11120101001*, 10925208*

摘要/Abstract

摘要：

背景：已有体内急性毒理实验证实，壳聚糖纳米微囊的半数致死量高于2 000 mg/kg，但其具体致病机制目前尚不明确。
目的：分析纳米壳聚糖作为骨替代材料对MC3T3-E1成骨细胞生长及大鼠肝、肾等器官生理功能的影响。
方法：将MC3T3-E1成骨细胞分别在含0(对照)、10 mg/L、100 mg/L、1 g/L、10 g/L纳米壳聚糖的DMEM培养液中培养，检测各组细胞A值。透射电镜观察10 g/L纳米壳聚糖溶液培养MC3T3-E1成骨细胞24 h后的细胞形态变化。采用PBS制备10 g/L纳米壳聚糖悬浮液，分别以166.67，16.67 mg/kg经腹腔注射至SD大鼠体内4周，每周3次，正常对照组注射等量生理盐水，血清生化指标分析大鼠肝、肾功能，病理切片观察组织形态学改变、炎症细胞浸润情况。
结果与结论：与对照组比较，10 mg/L、100 mg/L、1 g/L、10 g/L的纳米壳聚糖溶液均抑制MC3T3-E1细胞的生长(P < 0.05)。透射电镜见团聚的壳聚糖存在于MC3T3-E1细胞浆中，细胞表面的伪足形成，细胞膜呈波浪状起伏，细胞核变性、碎裂及固缩。与正常对照组比较，注射纳米壳聚糖悬浮液两组大鼠血尿素氮、Na+水平均有明显升高(P < 0.05)，高剂量组K+水平明显降低(P < 0.01)；肝脏、肾脏均出现组织细胞凋亡现象，高剂量组凋亡更加明显。表明纳米壳聚糖可导致细胞凋亡，超过一定剂量可造成肾功能受损，对机体生理功能造成影响。

关键词: 生物材料, 纳米生物材料, 纳米壳聚糖, 凋亡, 生物相容性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Acute toxicity in vivo experiments in previous studies has been confirmed that the median lethal dose of chitosan microcapsules is higher than 2 000 mg/kg, but the specific pathogenic mechanism is unclear.
OBJECTIVE: To explore the influence of nano chitosan on MC3T3-E1 cell growth as a bone substitute material, as well as the physiological function of rats.
METHODS: MC3T3-E1 cells were respectively cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium with different concentrations of chitosan nanoparticles (0, 10 mg/L, 100 mg/L, 1 g/L, 10 g/L). The absorbance values were determined. Changes in MC3T3-E1 cell morphology were observed by scanning electron microscope after 24 hours culture. 10 g/L nano chitosan suspension was prepared using PBS. Two different doses of nano chitosan suspension (166.67 and 16.67 mg/kg body weight) with PBS were injected intraperitoneally into Sprague-Dawley rats, three times a week, for 4 weeks. The control group was injected with equal volume of physiologic saline. Serum biochemical markers were detected to analyze the functions of liver and kidney of rats. Moreover, histopathology slices were observed to evaluate the morphological changes of tissue and inflammatory infiltration.
RESULTS AND CONCLUSION: 10 mg/L, 100 mg/L, 1 g/L, 10 g/L nano chitosan suspensions were found growth inhibition in MC3T3-E1 cells as compared with the control group (P < 0.05). The reunion of chitosan was observed in the cytoplasm of MC3T3-E1 cells by transmission electron microscopy. On the cell surface, pseudopodia formed, wavy undulating membrane, nucleus degeneration, fragmentation and condensation were found. Compared with the control group, blood urea nitrogen, Na+ levels were significantly increased in rats injected with nano chitosan suspension at two dosages, but the K+ level in the high concentration group was decreased significantly (P < 0.05). Cell apoptosis was found in the liver and renal tissue in a dose-dependent manner. It suggests that apoptosis may be the possible mechanism of nano chitosan toxicity, and normal physiological function may be impacted over a certain dose.

Key words: biocompatible materials, nanoparticles, chitosan, osteoblasts

中图分类号:

R318

王丽婷，周钢，樊瑜波 . 纳米壳聚糖对MC3T3-E1成骨细胞生长的影响[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(42): 7375-7381.

Wang Li-ting, Zhou Gang, Fan Yu-bo . Insight into nano chitosan effects on MC3T3-E1 cell growth[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(42): 7375-7381.

图/表（结果） 5

2.1 不同质量浓度材料对成骨细胞MC3T3-E1生长的影响 不同浓度梯度(10 mg/L、100 mg/L、1 g/L、10 g/L)的纳米壳聚糖溶液都抑制了MC3T3-E1细胞的生长，当溶液质量浓度在10 mg/L 至1 g/L之间时细胞吸光度明显低于空白对照组(P < 0.01)；当质量浓度大于1 g/L时对细胞的抑制作用更加显著，见图1。

2.2 电镜观察纳米壳聚糖溶液对MC3T3-E1 成骨细胞形态 见图2。

透射电镜被认为是鉴定细胞凋亡的金标准^[20]。由于壳聚糖纳米颗粒存在团聚现象，图中可见团聚的壳聚糖存在于胞浆中，细胞表面的伪足形成，细胞膜呈波浪状起伏；细胞核变性、碎裂及固缩，见图2。正常贴壁生长的成骨细胞MC3T3-E1呈长梭形，细胞核染色质分布均匀，见图2A。

2.3 动物体内注射实验病理切片观察结果各组动物肝肾组织病理变化见图3。

正常肝细胞有正常的多边细胞形状，小叶结构清晰，胞浆染色均匀，汇管区及肝脏细胞周围未见炎细胞浸润；正常肾小体呈球形，细胞核呈卵圆形，细胞浆染色均匀，无明显嗜酸性增强。

在两种不同剂量纳米壳聚糖溶液作用下的大鼠病理组织中观察到有凋亡细胞出现。在低剂量组肝、肾组织中出现了凋亡细胞。高剂量组肝脏凋亡细胞明显增多，肾近曲小管上皮细胞大量凋亡，胞浆水分脱失浓缩，嗜酸性染色增强，细胞核固缩变小，肝小叶汇管区及凋亡细胞周围均无炎症细胞浸润。

2.4 动物体内注射实验血清生化指标结果各组动物血清生化指标比较见图4。

虽然结果显示高剂量组和低剂量组谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平均低于正常对照组，但由于大鼠的正常范围是96-200 U，谷草转氨酶数据变化无临床意义。肾脏指标肌酐变化不明显，但血尿素氮水平，在高剂量组和低剂量组相比于正常对照组却有明显升高(P < 0.01)。反映身体电解质平衡的K⁺、Na⁺离子水平，在两个处理组也有明显变化，见表1。

参考文献

[1] 蒋挺大.甲壳素[M].北京:化学工业出版社,2001: 15-19.
[2] Synowiecki J,Al-Khateeb NA.Production, properties, and some new applications of chitin and its derivatives .Crit Rev Food Sci Nutr.2003; 43: 145-171.
[3] Enríquez de Salamanca A,Diebold Y,Calonge M,et al. Chitosan nanoparticles as a potential drug delivery system for the ocular surface toxicity, uptake mechanism and in vivo tolerance.Invest Ophth Vis Sci.2006;47(4): 1416-1425.
[4] Zheng LY,Zhu JF.Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weights.Carbohyd Polym.2003;54: 527-530.
[5] Yasunori M,Yoshiyuki K. Antitumor effects of various low-molecular-weight chitosans are due to increased natural killer activity of intestinal intraepithelial lymphocytes in sarcoma 180-bearing mice.J Nutr.2004; 134(4):945-950.
[6] Xie Y,Zhou NJ,Gong YF,et al.Th immune response induced by H pylori vaccine with chitosan as adjuvant and its relation to immune protection.World J Gastroenterol.2007;13(10): 1547-1553.
[7] Yuan XB,Yuan YB,Jiang W,et al.Preparation of rapamycin-loaded chitosan/PLA nanoparticles for immunosuppression in corneal transplantation.Int J Pharm. 2008;349(1-2): 241-248.
[8] Khatri K,Goyal AK,Gupta PN,et al.Plasmid DNA loaded chitosan nanoparticles for nasal mucosal immunization against hepatitis B.Int J Pharm.2008; 354(1-2): 235-241.
[9] Dailey RA,Chavez MR,Choi D.Use of a chitosan-based hemostatic dressing in dacryocystorhinostomy. Ophthal Plast Reconstr Surg.2009; 25(5): 350-353.
[10] 刘昊,张永刚,郭全义,等.新型脱细胞骨基质-壳聚糖骨组织工程支架的制备及性能评价[J].军医进修学院学报,2011,32(6): 616-619.
[11] 刘巍,朱新辉,张洁,等.Matrigel凝胶和壳聚糖/磷酸甘油凝胶两种支架体外构建组织工程软骨的比较[J].江苏医药,2011,37(6): 627-629.
[12] Madhumathi K,Shalumon KT,Rani VV,et al. Wet chemical synthesis of chitosan hydrogel-hydroxyapatite composite membranes for tissue engineering applications.Int J Biol Macromol.2009;45(1):12-15.
[13] Christenson EM,Anseth KS,van den Beucken JJ,et al. Nanobiomaterial applications in orthopedics.J Orthop Res.2007;25(1):11-22.
[14] Qin F,Ye Y,Yao X,et al.Effects of nano-selenium on the capability of learning memory and the activity of Se-protein of mice. Wei Sheng Yan Jiu. 2008; 37(4):502-504.
[15] Song S,Zhou F,Nordquist RE,et al.Glycated chitosan as a new non-toxic immunological stimulant.Immunopharmacol Immunotoxicol.2009;31(2):202-208.
[16] Zhang C,Qu G,Sun Y,et al.Biological evaluation of N-octyl-O-sulfate chitosan as a new nano-carrier of intravenous drugs. Eur J Pharm Sci.2008;33 (4-5):415-423.
[17] Nasti A,Zaki NM,de Leonardis P,et al.Chitosan/TPP and chitosan/TPP-hyaluronic acid nanoparticles: systematic optimisation of the preparative process and preliminary biological evaluation. Pharm Res. 2009; 26(8):1918-1930.
[18] Kashiwazaki H,Kishiya Y,Matsuda A,et al.Fabrication of porous chitosan/hydroxyapatite nanocomposites: Their mechanical and biological properties. Biomed Mater Eng. 2009;19 (2):133-140.
[19] Yoksan R,Chirachanchai S.Amphiphilic chitosan nanosphere: Studies on formation, toxicity, and guest molecule incorporation. Bioorg Med Chem. 2008; 16(5):2687-2696.
[20] Elmore S.Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol. 2007;35: 4495-516.
[21] Mao HQ,Roy K,Troung-Le VL,et al.Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers:synthesis, characterization and transfection efficiency.J Controlled Release.2001; 70(3): 399-421.
[22] Qi LF,Xu ZR,Jiang X,et al.Cytotoxic activities of chitosan nano particles and copper- loaded nanoparticles.Bioorg Med Chem Lett.2005;15(5):1397-1399.
[23] 汪冰,丰伟悦,赵字亮,等.纳米材料生物效应及其毒理学研究进展[J].中国科学B辑,2005,35(1): 1-10．
[24] Wang B,Feng WY,Zhu MT,et al.Neurotoxicity of low-dose repeatedly intranasal instillation of nano- and submicron-sized ferric oxide particles in mice.J Nanopart Res.2009;11: 41-53.
[25] Inoue K,Takano H,Yanagisawa R,et al.Size effects of latex nanomaterials on lung inflammation in mice.Toxicol Appl Pharmacol.2009;234 (1):68-76.
[26] Inoue K,Takano H,Koike E,et al.Effects of pulmonary exposure to carbon nanotubes on lung and systemic inflammation with coagulatory disturbance induced by lipopolysaccharide in mice.Exp Biol Med.2008;233(12): 1583-1590.
[27] Wang B,Feng WY,Wang TC,et al.Acute toxicity of nano- and micro-scale zinc powder in healthy adult mice.Toxicol Lett. 2006;161(2):115-123.
[28] Wei SL,Yi X,Chuan CH,et al.Toxicity of nano- and micro-sized ZnO particles in human lung epithelial cells.J Nanopart Res. 2009;11: 25-39.
[29] Meirelles L,Melin L,Peltola T.Effect of hydroxyapatite and titania nanostructures on early in vivo bone response.Clin Implant Dent Relat Res. 2008; 10(4):245-54.
[30] 彭黎明,王曾里.细胞凋亡的基础与临床[M].北京:人民卫生出版社,2003:363.
[31] Awasthi KK,John PJ,Awasthi A,et al. Multi walled carbon nano tubes induced hepatotoxicity in Swiss albino mice. Micron. 2013;44: 359-364.
[32] 陈伙德,贾振斌,邱敏,等.纳米材料在医药领域中的应用与展望[J].广东化工,2008,35(10):93-95.
[33] Griffitt RJ,Hyndman K,Denslow ND,et al.Comparison of Molecular and Histological Changes in Zebrafish Gills Exposed to Metallic Nanoparticles. Toxicol Sci.2009;107(2): 404-415.
[34] Watari F,Abe S,Koyama C,et al.Behavior of in vitro, in vivo and internal motion of micro/nano particles of titanium, titanium oxides and others.J Ceram Soc Jpn.2008; 116(1349): 1-5.
[35] Nel A,Xia T,Madler L,et al.Toxic Potential of Materials at the Nanolevel. Science. 2006;(311):622-627.
[36] Khang D,Liu-Snyder P,Pareta R,et al.Reduced responses of macrophages on nanometer surface features of altered alumina crystalline phases.Acta Biomater. 2009; 5(5): 1425-1432.
[37] Waters KM,Masiello LM,Zangar RC,et al.Macrophage Responses to Silica Nanoparticles are Highly Conserved Across Particle Sizes.Toxicol Sci.2009; 107(2):553-569.
[38] Jin CH,Jin YH,Wang J,et al.Comparative study of the effect on oxidative damage in rats inhaled by nano-sized and micro-sized silicon dioxide. Wei Sheng Yan Jiu.2008;37(1): 16-8,36.
[39] Li R,Ning Z,Cui J,et al.Ultrafine particles from diesel engines induce vascular oxidative stress via JNK activation.Free Radic Biol Med.2009; 46(6):775-782.
[40] Barmo C,Ciacci C,Canonico B,et al.In vivo effects of n-TiO(2) on digestive gland and immune function of the marine bivalve Mytilus galloprovincialis. Aquat Toxicol.2013;132-133C:9-18.
[41] Min KY,Se WP.Exposing Zebrafish to Silver Nanoparticles during Caudal Fin Regeneration Disrupts Caudal Fin Growth and p53 Signaling.Mol Cell Toxicol.2008;4(4):311-317.
[42] Park MR,Gurunathan S,Choi YJ,et al.Chitosan nanoparticles cause pre- and postimplantation embryo complications in mice.Biol Reprod.2013;88(4):88.
[43] Yin N,Liu Q,Liu J,et al.Silver Nanoparticle Exposure Attenuates the Viability of Rat Cerebellum Granule Cells through Apoptosis Coupled to Oxidative Stress. Small. 2013; 9(9-10):1831-1841.
[44] Xu P,Xu J,Liu S,et al.Nano copper induced apoptosis in podocytes via increasing oxidative stress.J Hazard Mater. 2012;30 (241):279-286.
[45] 胡瑜兰,王淇,高建青,等.壳聚糖纳米粒的斑马鱼胚胎毒性及其机制研究[C].2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集
[46] 黄琴琴,王永禄,李学明.纳米载体材料毒理学效应及其作用机制研究进展[J].中国药房,2011,22(21): 2004-2007.
[47] 纪宗斐,张丹瑛,沈锡,等.碳纳米管的毒性研究进展[J].复旦学报:医学版,2011; 38(6): 556-559.
[48] Klaus U,Catrin A,Lars-0liver K,et al.Cellular response to nanoparticles: target structures and mechanisms. Nanotoxicology. 2007;1(1): 52-71．
[49] 周国强,陈春英,李玉锋,等.纳米材料生物效应研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2008,35(9): 998-1006．
[50] 韩雁,崔国权,董淑英,等.纳米氧化锌诱导血管内皮细胞凋亡及氧化应激[J].中国公共卫生,2012,28(4):94-96.

引言

甲壳质是一种普遍存在于虾、蟹等低等动物及昆虫等节肢动物外壳中的天然多糖^[1]，目前已成为骨组织工程材料研究的热点之一。壳聚糖是甲壳质经脱乙酰化后的衍生物，生物相容性良好，在生物医学及制药等方面的应用极其广泛^[2]。作为一种天然多糖，壳聚糖被认为对人体无毒无害^[3]，而且具有抗菌^[4]、抑制肿瘤^[5]、免疫调节等作用^[6]，已引起国内外相关学者的广泛重视。在生物制药方面常被用作药物缓释剂、药物载体^[7-8]；因具有良好的止血、抑菌、抗菌性，促进伤口愈合，易于形成凝胶的性质，使它可用作止血敷料或止血剂^[9]，如止血棉、止血剂、可吸收性缝合线等，也可用于骨组织工程支架材料，促进细胞的分化及增殖^[10-11]。但由于壳聚糖的机械强度差，在矫形应用方面受到了限制，而羟基磷灰石是骨骼和牙齿的天然组成部分，具有良好的力学特性和骨诱导性。利用不同性质材料复合而成的生物医用复合材料，不仅兼具组分材料的性质，而且可以得到单组分材料不具备的新性能，因此，壳聚糖常与羟基磷灰石等材料联合使用^[12]，兼具羟基磷灰石和壳聚糖的生物活性，促进细胞与组织的生长，成为目前骨修复替代复合材料中研究应用最为广泛的材料之一。

由于纳米生物材料的表面特征不同于常规微米尺度的生物材料，生物活性发生改变^[13]。但同时由于纳米材料结构上的特殊性，除了具有比微米材料更优异的性能外^[14]，对组织器官的负面作用也逐渐成为人们关注的问题之一。Song等^[15]发现壳聚糖能刺激免疫反应，合成糖基化壳聚糖，刺激巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α，用于肿瘤的治疗，在细胞培养和动物实验中没有发现毒性作用。随着纳米科技的发展，纳米壳聚糖逐渐成为一种应用广泛的生物替代材料，除了被用于药物微囊系统中^[16]，还常被作为骨替代复合材料的重要组成成分。

Nasti等^[17]发现用羟基磷灰石包被后的壳聚糖/ triphosphate(TPP)纳米颗粒对巨噬细胞和成纤维细胞的毒性作用减小。但随着进入体内时间的逐渐延长，人体频繁活动所致的应力环境及生理环境的腐蚀、磨损，复合材料植入体表面会不断降解，磨损粒子向周围组织扩散及在体内逐渐沉积增多，沉积的纳米颗粒对局部及全身的细胞和组织带来何种影响，还需进一步的实验证实。将多孔结构的壳聚糖/羟基磷灰石纳米复合材料植入SD大鼠背部皮下3周后发现有轻微炎症，新生血管和巨细胞出现^[18]。已有体内急性毒理实验证实，壳聚糖纳米微囊的半数致死量高于2 000 mg/kg，但其具体致病机制目前尚不明确^[19]。实验探讨纳米壳聚糖对MC3T3-E1成骨细胞生长的作用，以及对大鼠体内肝、肾等器官生理功能的影响，分析并探讨其可能的作用机制。

材料方法

设计：细胞学观察实验。

时间及地点：实验于2009年7月至2011年6月在北京航天航空大学完成。

材料：

实验动物：6周龄雄性SD大鼠24只，体质量150- 200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2006-2009，分为3组，每组8只。

纳米壳聚糖对MC3T3-E1细胞生长影响实验的试剂与仪器：

实验方法：

MTT法观察纳米壳聚糖材料对MC3T3-E1细胞的生长抑制作用：将成骨细胞系MC3T3-E1置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，加入1%青链霉素，37 ℃、体积分数5%CO₂孵育。以培养液配成单个细胞悬液，按每孔10³-10⁴个细胞接种到96孔板，每孔体积200 µL。

培养24 h后，加入不同浓度梯度的纳米壳聚糖材料，0(空白对照)、10 mg/L、100 mg/L、1 g/L、10 g/L(各种材料粉末照紫外线12 h，用PBS稀释)。继续37 ℃、体积分数5%CO₂孵育24 h，每孔加MTT溶液(5 g/L，用PBS配制，pH=7.4)20 µL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150 µL DMSO，振荡 10 min，使结晶物充分融解。选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度值，记录结果，以时间为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
电镜观察：根据MTT实验结果选择用10 g/L的纳米壳聚糖悬液与MC3T3-E1细胞在37 ℃、体积分数5%CO₂环境下共培养24 h，吸出培养液，PBS清洗2遍，用胰蛋白酶消化，加入培养基吹打为细胞悬液浓度为 10×10⁹L^-1，移入离心管进行离心4 000 r/min，10 min，离心半径85 mm。离心完毕倒出培养液，2.5%戊二醛固定，用0.1 mol/L PBS漂洗3次，1%锇酸后固定1 h，再次漂洗。1%醋酸铀块染2 h，丙酮梯度脱水，丙酮浸透，包埋聚合。冷冻干燥，镀膜后透射电镜下观察。

动物体内注射实验：用PBS制备10 g/L的纳米壳聚糖悬浮液，经充分分散之后，按照166.67 mg/kg和 16.67 mg/kg，分别在两组SD大鼠腹腔注射两种不同剂量的纳米悬液，3次/周，连续注射4周，每周3次，观察纳米颗粒对动物饮食等身体一般状况的变化。给药4周后处死动物，血清生化指标分析实验动物的肝、肾功能；病理切片观察组织形态学改变、炎症细胞浸润情况。正常对照注射等量生理盐水。

生化检测：大鼠心脏取血，4 000 r/min离心 10 min，离心半径85 mm，取上清。全自动生化分析仪进行血清生化指标检测，具体指标包括谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、直接胆红素、间接胆红素、血清尿素氮、肌酐，电解质K⁺，Na⁺，Cl^-等。

病理切片：用体积分数10%甲醛溶液固定肝脏、肾脏等组织，常规石蜡块包埋，5.0-6.0 μm切片，用标准的组织切片技术处理，苏木精-伊红染色，光学显微镜观察切片。

主要观察指标：纳米壳聚糖作为骨替代材料对MC3T3-E1成骨细胞生长及大鼠肝、肾等器官生理功能的影响。

统计学分析：使用SPSS 11.5软件进行统计分析，所有的数据用x(_)±s表示。方差分析(ANOVA)和L.S.D. 测试来分析实验组与对照组的差异性。显著差异性被认定为P < 0.05。

讨论

壳聚糖应用于纳米载体的研究，是20世纪90年代末逐渐发展起来的新兴研究领域。作为天然聚阳离子，纳米壳聚糖除了用来制作基因疫苗载体，还作为抗癌药物载体被广泛应用。Mao等^[21]将壳聚糖-DNA纳米粒用于基因疫苗的口服传送和亚细胞转运研究。由于肿瘤细胞表面带负电荷，带正电荷的壳聚糖纳米粒能被吸附到肿瘤细胞表面使电荷中和，而纳米壳聚糖本身具有细胞毒活性，可抑制肿瘤细胞的生长。Qi等^[22]在进行细胞毒活性研究中发现，壳聚糖纳米粒及包裹CU(II)的纳米壳聚糖微球对BEL7402、BGC823、Colo320等肿瘤细胞产生显著的抗增殖作用。纳米壳聚糖材料作为药物载体在体内产生的负面生物效应导致生物毒性^[23]；而材料的剂量、结构、尺寸、表面电荷、表面修饰、表面积、聚集状态、晶型等都可能影响其生物学效应。本身无毒的载体材料在制成纳米级别后可能会变得具有一定毒性作用，而且粒径越小带来的毒性也更强。

纳米材料对机体组织器官可能产生影响，如神经系统^[24]、呼吸系统^[25]、血液系统^[26]、消化系统等^[27]。很多天然材料及以往认为生物相容性好的材料，在尺寸缩小至纳米尺度时由于纳米材料特有的性质，可能导致机体产生一些反应，甚至改变机体正常的生理功能^[28]，如血液酶学指标的改变，诱导细胞毒性和氧化应激反应及刺激免疫活性等。实验观察了两种不同剂量纳米壳聚糖材料对大鼠肝、肾生理功能的改变，以及其对组织细胞的作用。由于支架材料的空间结构利于细胞黏附和生长^[29]，实验为排除空间结构对于细胞生长的作用，故选用粉末状态。另外，在给药方式上，为避免手术对动物组织的损伤及术后炎症反应，选择腹腔注射纳米材料的方法而不是手术植入材料的方式。

实验通过重复、多次给予大鼠纳米壳聚糖材料，使材料在大鼠体内逐渐蓄积。经血液生化指标检测，显示谷草转氨酶与谷丙转氨酶始终在大鼠生理值范围之内，说明肝细胞没有出现明显的坏死和炎症，未影响肝脏功能。但肾功能相关指标却出现明显改变，血尿素氮水平在两个处理组均明显增高，同时反映身体电解质水平的K⁺、Na⁺水平也出现改变，说明肾功能已明显受损，从而引起水电解质的紊乱。同时，组织病理切片的结果与生化指标的结果相一致，在两个处理组中，肝脏和肾脏组织中都没有细胞坏死和炎症浸润表现，只发现了凋亡细胞，而且肾脏组织细胞凋亡的程度明显重于肝脏，尤其是在肾脏近曲小管的区域，结合生化指标结果，说明处理组大鼠的肾脏功能受到了一定程度的影响，大剂量组的功能受损更为严重。由于细胞死亡有两种方式，一种是凋亡，不引起炎症浸润反应，有其独特的形态和生物化学特征^[30]。另一种是细胞坏死，可引起局部严重的炎症反应。虽然有研究发现，纳米材料可导致肝细胞坏死^[31]，这可能是由于不同材料的毒性作用机制不同而导致的。

随着纳米科技在生物医学领域的应用越来越广泛^[32]，纳米颗粒及其医学应用的危险评估和毒性分析也变得尤为重要，但有关纳米材料具体的毒性作用机制目前尚不明确。植入物进入机体内可能导致一系列的特异反应。Griffitt等^[33]发现机体暴露在不同种类纳米金属颗粒下通过不同的机制产生生物反应，每种颗粒可能就有一种独特的生物效应。但是也有不同观点，Watari等^[34]认为是由于纳米颗粒特异表面区域的尺寸效应引起了化学反应的增加，导致材料毒性，这个现象是非特异的，物理颗粒和形状的作用是独立于材料的。而且颗粒涂层，表面处理，UV射线和离子聚集都能改变颗粒的毒性作用^[35]。Khang等^[36]实验证明改变Al₂O₃纳米晶体结构的表面特征，可减少巨噬细胞的反应。Waters等^[37]用巨噬细胞模型证实在一个较广的颗粒尺寸范围内(7-500 nm)，非结晶硅颗粒刺激炎症蛋白分泌和诱导巨噬细胞毒性的尺度与给药颗粒的表面积密切相关。因此，有关纳米材料对生物体的毒性作用究竟是由纳米材料的结构特异性导致还是由于材料本身的特性决定，还需要大量的实验来证实。

目前，很多研究已经证实纳米颗粒可通过氧化应激反应(ROS)来诱导炎症的发生^[38]。炎症通过炎症前信号级联(MAPK和NF-kB)的激活而引发。JNK的激活在纳米颗粒诱导的血管内皮氧化应激反应中起着十分重要的作用^[39]。另外，纳米材料还可能通过其他方式对机体产生作用，如蛋白质变性、DNA损伤，免疫反应和异体肉芽肿的形成等^[40]。Min等^[41]发现在纳米银离子(10- 20 nm)作用的斑马鱼中出现了线粒体损伤和炎症诱导。经RNA微序列分析(基因芯片)显示与凋亡相关的P53基因途径的表达发生改变。说明纳米银颗粒改变了斑马鱼基因的表达，促进了凋亡的产生^[42]。其他研究也证实纳米颗粒可经由氧化应激途径导致细胞凋亡^[43-44]。

胡瑜兰等^[45]以斑马鱼为模型，对纳米壳聚糖颗粒的胚胎毒性进行研究，结果表明纳米壳聚糖颗粒增加了斑马鱼卵的细胞死亡水平和活性氧表达水平，并且该毒性具有浓度依赖性。氧化应激在诱导或增强炎症反应过程中起到了重要作用。若体内潜在自由基不易清除并在组织中贮留，纳米载体材料会使得肝、脾等代谢器官成为氧化应激发生的主要靶点，产生肝毒性和脾毒性^[46]。实验结果也显示了纳米壳聚糖颗粒对大鼠肝、肾等代谢器官的毒性。

线粒体和细胞核被认为是纳米载体材料在细胞内产生毒性的主要作用点，可引起细胞程序性死亡、活性氧的生成、脱氧核糖核酸(DNA)的损伤、细胞周期性停滞及遗传突变等一系列改变。线粒体是细胞内最易受损伤的一个敏感的细胞器，参与细胞中氧自由基的生成、细胞程序性死亡、细胞的信号转导、细胞内多种离子的跨膜转运及电解质稳态平衡的调控。纪宗斐等^[47]研究发现，碳纳米管可造成氧化应激，导致各种细胞株发生氧化损伤和细胞毒性，抑制细胞繁殖，细胞存活率下降。同时还发现碳纳米管可穿过细胞膜进入细胞核。编程性细胞死亡可能是毒性发生的一种来源^[48]。中科院研究人员研究证实，各种尺寸和化学组成的纳米粒优先到达线粒体，线粒体是具有氧化还原活性的细胞器，很可能产生大量活性氧引起超载或影响机体抗氧化剂防御机制，它的产生是纳米材料引起炎症和毒性的一个主要因素^[49]。韩雁等^[50]研究发现，纳米氧化锌可通过活性氧途径诱导血管内皮细胞(ECV304)凋亡，产生细胞毒性。不同性质纳米材料引起机体的毒性作用机制可能不同。实验证实纳米壳聚糖对于机体的毒性作用机制是凋亡，但其具体作用机制还需要进一步研究证实。

综上所述，作者认为蓄积在体内到达一定量的纳米壳聚糖能抑制MC3T3-E1成骨细胞的生长，可使SD大鼠肝脏、肾脏等组织细胞发生凋亡，并存在剂量依赖性。当凋亡程度严重时可影响脏器功能，但引起细胞凋亡的途径和机制仍是值得继续研究的问题。正确评估纳米材料的生物安全性，将纳米技术更好地应用到现实生活中去是需要始终努力的方向。

文章快阅

延伸阅读

纳米材料对机体组织器官可能产生影响，如神经系统、呼吸系统、血液系统、消化系统等。很多天然材料及以往认为生物相容性好的材料，在尺寸缩小至纳米尺度时由于纳米材料特有的性质，可能导致机体产生一些反应，甚至改变机体正常的生理功能，如血液酶学指标的改变，诱导细胞毒性和氧化应激反应及刺激免疫活性等。实验观察了两种不同剂量纳米壳聚糖材料对大鼠肝、肾生理功能的改变，以及其对组织细胞的作用。由于支架材料的空间结构利于细胞黏附和生长，实验为排除空间结构对于细胞生长的作用，故选用粉末状态。另外，在给药方式上，为避免手术对动物组织的损伤及术后炎症反应，选择腹腔注射纳米材料的方法而不是手术植入材料的方式。

实验通过重复、多次给予大鼠纳米壳聚糖材料，使材料在大鼠体内逐渐蓄积。经血液生化指标检测，显示谷草转氨酶与谷丙转氨酶始终在大鼠生理值范围之内，说明肝细胞没有出现明显的坏死和炎症，未影响肝脏功能。但肾功能相关指标却出现明显改变，血BUN水平在两个处理组均明显增高，同时反映身体电解质水平的K⁺、Na⁺离子水平也出现改变，说明肾功能已明显受损，从而引起水电解质的紊乱。同时，组织病理切片的结果与生化指标的结果相一致，在两个处理组中，肝脏和肾脏组织中都没有细胞坏死和炎症浸润表现，只发现了凋亡细胞，而且肾脏组织细胞凋亡的程度明显重于肝脏，尤其是在肾脏近曲小管的区域，结合生化指标结果，说明处理组大鼠的肾脏功能受到了一定程度的影响，大剂量组的功能受损更为严重。由于细胞死亡有两种方式，一种是凋亡，不引起炎症浸润反应，有其独特的形态和生物化学特征。另一种是细胞坏死，可引起局部严重的炎症反应。虽然有研究发现，纳米材料可导致肝细胞坏死，这可能是由于不同材料的毒性作用机制不同而导致的。

纳米壳聚糖对MC3T3-E1成骨细胞生长的影响

Insight into nano chitosan effects on MC3T3-E1 cell growth

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[2]	张玉杰, 杨建东, 蔡俊, 朱守雷, 田原. 大蒜素抑制大鼠血管内皮细胞增殖并诱导其凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1080-1084.
[3]	邓爽, 蒲锐, 陈子扬, 张建超, 袁凌燕. 运动预适应干预压力超负荷心肌重构模型小鼠的心肌功能及细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 717-723.
[4]	乐国平, 张明, 席立成, 罗瀚文. 盐酸万古霉素@聚乳酸-羟基乙酸共聚物-壳聚糖-透明质酸复合缓释微球的制备及体外评价#br#[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 528-534.
[5]	何冠宇, 徐宝山, 杜立龙, 张同星, 霍振鑫, 申力. 天然丝素蛋白构建仿生取向微通道纤维环支架[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 560-566.
[6]	杨峰, 赵骞, 张世轩, 赵铁男, 冯博. 雷帕霉素联合CD133抗体支架预防血管再狭窄的有效性和安全性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 579-584.
[7]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[8]	李安安, 姜涛, 詹敏, 蔡宇宁, 宋敏, 李聪聪, 林文政, 张家媛, 刘文刚. 参苓白术散治疗膝骨关节炎作用机制的网络药理学和分子对接技术分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 197-204.
[9]	魏文悦, 王玉银, 郭敏芳, 张婧, 谷青芳, 宋丽娟, 柴智, 尉杰忠, 马存根. 法舒地尔抑制APP/PS1小鼠神经元凋亡的线粒体动力学作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 232-238.
[10]	黄波, 陈明学, 彭礼庆, 罗旭江, 李获, 王皓, 田沁玉, 鲁晓波, 刘舒云, 郭全义. 可注射性甲基丙烯酸酐改性明胶/软骨源性基质微粒复合水凝胶支架的制备及生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 10(16): 2600-2606.
[11]	于栋, 刘侃, 时宗庭, 杨骁侠, 刘恒平, 张清烽. 动力失衡模型兔颈椎间盘病理改变及终板软骨细胞的迁移凋亡规律[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1675-1679.
[12]	邢宏昶, 曹建平, 朱静, 姚鲲. 依那普利减轻肢体缺血-再灌注模型大鼠心肌损伤的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1747-1751.
[13]	叶翔凌, 夏远军, 王波群, 康正阳, 吴斌. 3D打印聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架复合壳聚糖水凝胶涂层的性能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1574-1581.
[14]	文科, 卢彦青, 侯楠, 马瑞娜, 崔鹏程, 吕蝶, 徐小丽. 生物材料与组织工程技术在鼓膜缺损重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1620-1624.
[15]	蔡胜胜, 梅衡, 张学全, 邓劲, 曹俊, 何斌. 制备HPe6DF复合纳米粒子增强光动力治疗效果[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1566-1573.