生物打印在肌肉骨骼界面重建中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2270

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (16): 2585-2591.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2270

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生物打印在肌肉骨骼界面重建中的应用

张君伟¹，崔宇韬²，李祖浩²，王中汉²，刘贺²，雒文彬²

¹甘肃省庆阳市西峰区人民医院骨科，甘肃省庆阳市 745000；²吉林大学第二医院骨科，吉林省长春市 130041

收稿日期:2019-10-21 修回日期:2019-10-24 接受日期:2019-12-05 出版日期:2020-06-08 发布日期:2020-03-26
通讯作者: 雒文彬，博士，吉林大学第二医院骨科，吉林省长春市 130041
作者简介:张君伟，男，1972年生，汉族，甘肃省庆阳市人，副主任医师，主要从事骨外科关节及运动医学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81671804，81772456)

Application of bioprinting in reconstruction of musculoskeletal interface

Zhang Junwei¹, Cui Yutao², Li Zuhao², Wang Zhonghan², Liu He², Luo Wenbin²

¹Department of Orthopedics, Xifeng District People’s Hospital of Qingyang City, Qingyang 745000, Gansu Province, China; ²Department of Orthopedics, the Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin Province, China

Received:2019-10-21 Revised:2019-10-24 Accepted:2019-12-05 Online:2020-06-08 Published:2020-03-26
Contact: Luo Wenbin, MD, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin Province, China
About author:Zhang Junwei, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Xifeng District People’s Hospital of Qingyang City, Qingyang 745000, Gansu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81671804 and 81772456

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

生物打印：是一种能够在数字三维模型辅助下，根据增材制造原理定位装配生物材料或细胞单元，从而制备组织工程支架和组织器官等制品的一种新兴技术。

肌肉骨骼界面：是指肌肉骨骼系统中存在的一系列结构、功能和工程相似的部位，其通过肌肉和骨骼附着实现平滑连接，通常这些界面主要包括骨-肌腱、骨-韧带和骨-软骨等。其工作原理和潜在机制使它们成为组织的独特分支，其在细胞组分上显著不同，但在结构和功能上是一致的。

背景：肌肉骨骼损伤和退行性疾病的手术治疗常涉及肌肉骨骼界面的重建，而实现肌肉骨骼界面与周围宿主组织的生物整合的关键是制造具有精确结构和不同材料的替代物。生物打印技术获得的人工组织可与天然肌肉骨骼界面组织具有相似的物理结构和生物活性。

目的：介绍肌肉骨骼界面组织的结构和生物功能特性，以及生物打印技术在肌肉骨骼界面重建中的应用。

方法：由第一作者以“bioprinting, musculoskeletal interface，生物打印，肌肉骨骼界面”为关键词，检索2005至2019年期间PubMed、Web of Science、Springerlink、Medline、万方、CNKI数据库中的相关文献。初检文章201篇，筛选后对60篇文章进行分析。

结果与结论：理想的生物打印肌肉骨骼界面移植物必须结构上与原界面组织相对应，以维持体内多变的生物力学环境；其次，植入之后必须保持这些植入物的生物活性，以开始修复和替换缺陷区域的功能。生物打印技术的发展为解决肌肉骨骼界面的重建带来了希望，但其仍然存在许多挑战：仿生功能性界面结构机械性能的提高、多个仿生结构的整合、生物打印结构的血管化，以及对力学刺激在界面组织发育和再生中的作用缺乏深入的研究。对于未来界面组织工程的研究方向，可以预料的是将种子细胞、细胞因子和基因治疗，以及生物反应器纳入界面组织工程支架中的一大热点，为解决界面组织整合这一难题提供创新性的解决方案。

ORCID: 0000-0002-6668-5036(张君伟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物打印, 组织工程, 肌肉骨骼界面, 骨-肌腱, 骨-韧带, 骨-软骨, 仿生, 临床应用

Abstract:

BACKGROUND: Reconstruction of musculoskeletal interface is commonly involved in musculoskeletal injuries and degenerative diseases, while the key problem to achieve biological integration with the surrounding host tissues of musculoskeletal interface is fabricating substitution with precisely structural and material distribution. Bioprinting has made it possible to achieve artificial tissues with spatial controlled heterogeneity of physical properties and bioactive composition similar to native musculoskeletal interface tissues.

OBJECTIVE: To introduce the structural and biofunctional properties of musculoskeletal interface tissues, as well as the application of bioprinting in the reconstruction of musculoskeletal interface.

METHODS: The first author retrieved PubMed, Web of Science, Springerlink, Medline, WanFang and CNKI databases with “bioprinting, musculoskeletal interface” as English and Chinese search terms for relevant articles published from 2005 to 2019. Initially, 201 articles were retrieved, and finally 60 eligible articles were selected for further analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: Ideal bioprinted musculoskeletal interface grafts must be anisotropic as their native counterparts to sustain the changeful biomechanical environment in vivo. In addition, bioactivities of these implants must be preserved to initiate repair and replace the functions of defect area. The development of bioprinting approaches has brought promising prospect for the reconstruction of musculoskeletal interface, but there are still many challenges, such as the improvement of mechanical properties of bionic functional interface structure, the integration of multiple bionic structures, the vascularization of bioprinting structure, and the lack of in-depth research on the role of mechanical stimulation in the development and regeneration of interface tissue. For the future research direction of interface tissue engineering, it can be expected that seed cells, cytokines and gene therapy, as well as bioreactors will be included in the interface tissue engineering scaffolds, which will provide innovative solutions to solve the problem of interface tissue integration.

Key words: bioprinting, tissue engineering, musculoskeletal interface, bone-tendon, bone-ligament, bone-cartilage, biomimics, clinical application

中图分类号:

张君伟, 崔宇韬, 李祖浩, 王中汉, 刘贺, 雒文彬. 生物打印在肌肉骨骼界面重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(16): 2585-2591.

Zhang Junwei, Cui Yutao, Li Zuhao, Wang Zhonghan, Liu He, Luo Wenbin. Application of bioprinting in reconstruction of musculoskeletal interface[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(16): 2585-2591.

图/表（结果） 3

2.1 生物打印方法用搭载细胞的水凝胶作为生物墨水，使用喷墨打印、激光辅助生物打印和微挤压式生物打印的方法成为制备界面组织工程支架的主流选择^[28-30]。

喷墨打印是目前最为常用的打印类型，工作原理与普通的2D打印机相似，由生物材料和相应细胞成分组成的生物墨水通过打印机喷头在垂直方向上运动，从而打印出3D组织工程支架^[31]。喷墨打印虽然具有打印速度快、成本低、操作便捷、应用广泛等优势，但热喷墨技术使生物材料和细胞在打印过程中需要承受较大的热和机械应力，同时存在喷头堵塞、细胞密度不理想和液滴尺寸难以控制等缺点。而声控喷墨技术虽解决了热喷墨技术的一些缺点，但其对打印材料的黏度具有较高的要求，这些缺点限制了喷墨打印技术在生物界面组织制备领域的应用^[32]。

激光辅助生物打印是将激光聚焦于吸收性底物，底物吸收激光后为打印提供驱动力，并将生物材料挤压出打印喷口。激光辅助生物打印的喷头为开放式结构，同时对细胞产生的伤害较小，细胞存活率可达95%以上，确保生物支架中细胞具有良好的活性^[33]。同时该技术还具有高分辨率和较高的打印精度，但是设备价格昂贵、打印过程耗时长及潜在的金属感染风险限制了其广泛应用^[34]。

微挤压式生物打印是这些生物打印方法中最有前景的一种技术，因为其具有梯度打印的能力和与生物材料良好的兼容性^[32]。在微挤压式生物打印中，生物墨水通过气动(高压)或机械力(活塞)连续地通过喷嘴以细丝状的形式从针状喷头中挤出，层层堆积，最终形成三维结构。与喷墨打印技术相比，微挤压式打印可更广泛的利用多种生物材料，具有更多样化的生物交联机制。同时，打印环境的温度适宜，避免持续高温影响细胞的活性^[35]。以细胞球体作为基本的打印单位，可使得打印区域具有较高的细胞密度，也使得不同种类细胞的均匀分布成为可能^[36-37]。提高生物打印的分辨率和细胞存活率是微挤压式生物打印面临的重大挑战^[38]。

2.2 骨-软骨界面的生物打印骨-软骨界面广泛存在于各种骨末端的关节部位，原生骨-软骨界面组织在胶原纤维结构、力学性能、细胞力学和生物化学成分方面存在显著差异^[39]。在结构上，骨-软骨界面由3层结构组成，即关节软骨层、钙化软骨层和软骨下骨，这些复杂的结构使得这种界面组织在应力分布、滑动力学和负荷转移方面具有独特的性能^[40]。

针对骨-软骨界面的梯度性质结构和组成特征，为更好地模拟自然微环境和这种异质性组织的机械特性，界面支架需具备以下特征：①合适的多孔性变化的结构，为不同界面层中的多种类型细胞提供理想的生存坏境。此外，需要充分考虑支架的内部几何结构，从而理想地模拟自然组织的结构和特性，多孔的互连结构支持氧气、营养和代谢废物的运输与交换^[41-42]。②模仿与天然骨和软骨区域相似的机械性能梯度，通过矿化和内部结构的梯度分布为骨区域提供合适的硬度梯度，并向软骨区逐渐降低硬度和增加耐磨性能^[43]。③生物打印骨-软骨各层结构的比例应与原生骨-软骨组织相匹配。成人骨-软骨组织的整体厚度约为3 mm，其组成约为90%的关节软骨、5%的钙化软骨和5%的软骨下骨^[41]。钙化软骨是关节软骨和软骨下骨中间厚度为20-250 μm一层。在任何成人中，钙化软骨的平均厚度和矿物质密度随年龄、关节面积和机械负荷而变化，而钙化软骨层的浅层与关节软骨通过一条约5 μm潮痕形成融合。考虑到患者之间变化范围广，不同层的厚度对界面精确重建至关重要，这也对生物打印分辨率提出了很高的要求^[44-45]。④生物墨水材料应具有可生物降解性，适当的降解速率应与细胞外基质的生成速率相匹配，以补偿生物降解过程中强度的损失^[45]。

由于水凝胶作为生物墨水的机械强度较差，生物打印骨-软骨界面的早期尝试主要集中在概念验证研究上。在一项比较研究中，利用生物打印技术制备了一个模拟的双层骨-软骨组织结构，对软骨细胞和成骨细胞在由透明质酸和Ⅰ型胶原组成的水凝胶中进行行为研究。结果表明与非天然细胞外基质水凝胶相比，细胞在由天然胞外基质组成的水凝胶上具有良好的增殖能力和维持活跃的细胞功能，从而证明了仿生组件设计对细胞活性具有重要意义^[46]。为了模拟天然骨-软骨组织的带状成分，另一项研究应用了生物打印和微载体技术相结合的新策略制备了一种生物活性结构，即将间充质干细胞搭载于聚乳酸微载体中，然后用明胶-甲基丙烯酰胺凝胶作为生物墨水进行封装。该研究探讨了仿生结构设计，获得了含/不含搭载细胞的微载体的凝胶层的带状结构，通过整合搭载细胞的微载体，生物墨水的机械强度也得到了提高^[47]。为了快速转化、应用于临床，研究者开发了一种新型手持生物打印装置，允许在单次手术中同时将生物支架和封装的细胞同轴挤压到体内软骨缺损中。将间充质干细胞包裹在明胶-甲基丙烯酰胺和透明质酸-甲基丙烯酸水凝胶中作为生物墨水，通过该装置打印的结构在绵羊全层厚度软骨缺损模型中显示出与宿主更好的整合效果^[48]。此外，人类脂肪源性间充质干细胞是未来临床应用的一大细胞来源，在相关研究中的应用揭示了该装置应用于人体软骨生物制造的可行性^[49]。各骨-软骨界面的相关研究见表1。

然而骨-软骨组织的组成和机械性能随深度变化很大，尽管在实用性和结构复杂性方面取得了令人欣喜的结果，但在水凝胶基的“纯”生物打印方法中，提供与其原生骨-软骨组织相近的适当的机械性能仍然没有得到解决。此外，利用生物打印技术对带状软骨组织进行仿生支架的制备也有待进一步研究。

2.3 骨-韧带/肌腱界面的生物打印肌腱或韧带通过一种称为“附着”的特殊界面组织插入骨骼，该界面组织是不同生化和机械性能组织之间的过渡区域，对于肌肉骨骼运动中软组织和硬组织之间的相互作用是必不可少的^[53]。骨-韧带/肌腱界面是一种多相过渡结构，由4个组成不同但结构互相连续的区域组成，即韧带/肌腱、纤维软骨、钙化纤维软骨和骨4部分，但是各个区域的细胞类型和细胞外基质具有显著区别。韧带区域主要存在的细胞是纤维母细胞，而细胞外基质以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主；纤维软骨区域细胞为卵圆形的软骨细胞，而细胞外基质以蛋白聚糖、Ⅲ型胶原为主；钙化纤维软骨区域细胞为肥大的软骨细胞，而细胞外基质以X型胶原为主；骨区域的细胞为骨母细胞、成骨细胞和破骨细胞，钙化

的细胞外基质以Ⅰ型胶原为主。这样的多相过渡界面结构对于负荷在韧带/肌腱和骨组织间的传导非常重要，不仅能够有效避免应力集中，同时也有利于增强韧带插入骨组织的牢固程度，防止肌腱/韧带撕脱^[54]。

骨-韧带/肌腱界面允许刚度逐渐增加，从而使应力集中最小化，并允许从韧带到骨的有效载荷转移。这些区域涉及2种不同成分的异质组织，即肌腱/韧带和骨。肌腱/韧带表现出承受张力的能力，而骨骼负责压缩负荷。骨-肌腱/韧带界面在结构组成和生物力学特性方面表现出相应的梯度，从而有效地转移不同材料之间的应力，并维持界面功能和稳态所需的异型细胞通信。这种特殊界面结构和独特的生物环境导致其在极为脆弱且易发生损伤^[5]。在骨科重建手术中，实现肌腱/韧带移植与软骨下骨的完全的功能性整合仍面临巨大挑战^[55]。

SPALAZZI等^[50]制备了一种3相支架用于前交叉韧带-骨界面的重建，A相由搭载成纤维细胞的聚乳酸形成，用于促进软组织形成；B相由聚乳酸-羟基乙酸共聚物组成，利于纤维软骨细胞和纤维软骨形成；C相由搭载成骨细胞的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和生物活性玻璃组成，用于促进骨形成(图3)。为了促进附着体的再生，LIU等^[15]开发了一种具有分级矿物涂层纳米纤维支架，以模拟自然肌腱到骨插入界面的矿物成分，这种支架具有诱导脂肪来源间充质干细胞分级成骨的能力。肌腱/韧带与骨界面的再生对于损伤后移植物的功能性整合至关重要。该研究目的是利用一站式静电纺丝制备的梯度支架来重建肌腱-骨界面，在聚-ε-己内酯纳米纤维支架上生长了2种细胞，该支架具有从随机到规律排列纳米纤维模式的逐渐转变，分别将骨肉瘤细胞和成纤维细胞接种在支架上培养96 h后，创造了一个随机的、一致的共培养组织界面，模拟了附着体成分的自然转变。结果表明，微结构梯度影响了细胞形态、组织拓扑结构，促进了细胞的生长^[51]。设计一种多相结构、通过趋化间充质干细胞群的分化来模拟骨-韧带界面，这些间充质干细胞混合在纤维-海藻酸水凝胶中，通过在一个定制的双腔室培养系统中根据生长因子的空间分布呈现不同的分化结果，沿着软骨内、纤维软骨或韧带路径向下生长。这些间充质干细胞表现出在不同空间上的差异性分化，根据其所处的局部环境表现出软骨或韧带表型。这种方法为骨-韧带界面的制备提供了一种全新的工程策略^[52]。

2.4 其他界面在肌肉骨骼界面中除了研究较为广泛的骨-软骨界面和骨-韧带/肌腱界面，还存在着骨-半月板界面和肌肉-肌腱界面，这2个界面的研究相对较少。

半月板是一种位于膝关节股骨和胫骨之间的新月形楔形软骨样组织，为股骨和胫骨提供缓冲的结构。与其他界面组织一样，半月板组织也呈现带状排列的胶原纤维，其主要细胞类型是纤维软骨细胞。干燥的半月板组织约含有80%的Ⅰ型胶原，同时也存在少量的Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型胶原。与骨-软骨界面的生物打印相比，涉及骨-半月板界面生物打印领域的方法很少。近年来的研究方法主要集中在半月板组织本身的生物制备上，骨-半月板界面的重要作用尚未被强调^[56-57]。然而，考虑到与骨-软骨界面成分和结构的相似性，骨-软骨界面生物打印的方法可以借鉴地应用于骨-半月板界面的生物打印。因此，近年来人们对半月板的生物打印越来越重视，这是今后研究的一个重要课题^[58]。

肌肉-肌腱界面的组织学特征是界面处的肌纤维细胞膜过度折叠，通过含有成纤维细胞的结缔组织小桥桥接肌腱和肌肉之间的间隙，该结缔组织将肌腱的致密胶原纤维斜向连接到肌纤维^[59]。考虑到肌肉-肌腱界面在界面组织中作为肌腱/韧带和肌肉之间的桥梁作用，骨-韧带/肌腱界面组织的现有组织工程策略可能适合肌肉-肌腱界面生物制造。多种生物支架已被应用于肌肉-肌腱界面的重建，其中一些可在市场上买到。考虑到肌肉-肌腱界面组织的生物力学环境，最近开发的生物打印方法结合加固结构呈现特定区域的生物和机械特性，使用多种类型的活细胞用于肌肉-肌腱界面工程^[4^，^50]。

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引言

肌肉骨骼界面是指肌肉骨骼系统中存在的一系列结构、功能和工程相似的部位，其通过肌肉和骨骼附着实现平滑连接，工作原理和潜在机制使它们成为组织的独特分支，其在细胞组分上显著不同，但在结构和功能上是一致的。通常这些界面主要包括骨-肌腱、骨-韧带和骨-软骨等，这些区域的组织表现出细胞组成和机械性质的逐渐变化(图1)^[1]。肌肉骨骼界面负责相邻组织之间的功能相互作用，减少应力集中的形成，从而产生承重灵活性和保护作用。独特的生物学功能导致肌肉骨骼界面具有独特的构成和结构，由于它们主要存在于物理化学性质显著变化的区域，因此肌肉骨骼界面在组成上具有多样性，同时结构具有多重梯度变化^[2-3]。

肌肉骨骼界面区域常涉及肌肉骨骼的损伤，而且这些附着界面的强度会随着年龄的增长而退化^[4]。例如，膝关节前交叉韧带断裂是一种典型的附着点损伤，临床上常用自体肌腱或同种异体移植物通过骨隧道机械地固定到骨骼的方法来替换天然韧带，但这种治疗方式仍有15%-40%的失败率^[5]。一系列并发症与自体移植物和同种异体移植组织的使用有关。采集自体组织进行前交叉韧带重建与膝关节前痛和运动范围缩小有关。使用同种异体移植物的并发症包括疾病传播的风险、细菌感染及宿主产生免疫原性反应^[6]。此外，直接将移植的韧带固定在骨面上难以实现附着体的自然再生，最终导致不佳的界面整合。相反，这些手术常导致韧带与骨交界处形成机械性能较差的纤维组织，导致交界处的应力异常集中，移植物继发不稳定，最终导致长期预后不良^[7]。另一方面对于软骨-骨界面，关节软骨的损伤或退化是导致残疾的主要原因，较低的细胞含量和缺乏血液供应限制了软骨的自我修复^[8]。对于这种疾病的早期阶段有多种治疗方法，如灌洗、微骨折和骨软骨移植等，都难以获得理想的软骨再生和恢复周围组织的完整性，其中通过关节炎灌洗方式对骨性关节炎的治疗方是几乎只是暂时的延缓退化，仍有大部分患者需要进行后续的关节置换^[9-10]。

组织工程技术修复上述界面区域存在较大的挑战，同时也具有巨大的潜能去解决这一问题。传统的组织工程策略是制备结构和材料一致的支架，但这种连接2个界面的均质支架常导致不满意的骨整合效果^[11-12]。这主要是由于这些研究缺乏对界面结构特异性的了解。界面组织由复杂的结构和不同性质的成分组成，表现出从一个组织到另一个组织的逐渐变化，这使得人们不能通过使用单一组分和结构的生物材料来制成传统支架用于重建界面结构^[12]。对于肌肉骨骼界面的重建，需要制备各区域结构特异而又无缝连接的支架材料，只有无缝连接的界面支架才可能满足不同再生组织间连接处的力学要求。因此，具有成分和机械性能连续转变的多相或分层支架在界面组织重建中的应用，引起了研究者的极大兴趣^[13-14]。然而多相支架的制备仍是一个挑战，特别是当支架设计用于连接软组织和硬组织时，需要能够模拟多个微米级和纳米级梯度，同时在界面处存在差异性的特征结构和力学性能^[15]。植入支架的尺寸与周围原生组织的差异会引起应力升高，改变周围结构的应力分布，导致退行性改变^[16]。这使得组织工程支架需要与原生组织具有良好结构和力学上的匹配度。此外，一个具有正常功能的工程界面需要一个合适的血管网络运输营养物质，从而利于界面各组织的重建^[17-18]。

传统的组织工程支架制备方法对于制造界面支架具有一定的局限性^[19]。传统组织工程界面支架的制备策略采用了一种“自上而下”的方式，即将细胞植入预制支架中，这自然地限制了细胞的空间分布和支架的梯度结构，导致难以模拟复杂的生物微结构特征；相比之下，天然组织和结构通常是以“自下而上”的方式发展的，这为应用这种生物仿生的生物加工方法制备复杂的层次结构和功能性组织结构提供了理想的生物学条件^[20-22]。上述问题使采用生物打印技术制备界面组织工程支架的策略引起了研究者极大的兴趣。作为一种增材制造技术，生物打印采用“自下而上”的制备方式，使得细胞、生物活性因子和生物材料在支架中能够以类似自然状态的三维空间分布^[23-24]。迄今为止，生物打印已被广泛应用于制造各种功能性组织，如脉管系统、肌肉、软骨和骨骼^[25-26]。然而，通过生物打印制造梯度结构的支架仍然值得研究，以解决目前制备界面组织工程支架遇到的挑战^[27]。

文章探讨了生物打印的常用技术，回顾了肌肉骨骼系统界面的结构、组成和生物力学特点，以及生物制造这些界面结构的方法和挑战，重点讨论索生物打印技术的潜力，以解决生物打印和临床需求的进一步发展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

生物打印在肌肉骨骼界面重建中的应用

Application of bioprinting in reconstruction of musculoskeletal interface

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