电针延缓骨关节炎软骨退变：基于Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路的认识

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.004

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (24): 3790-3795.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.004

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电针延缓骨关节炎软骨退变：基于Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路的认识

付长龙¹，陈后煌¹，朱定钰²，吴追乐¹，徐欣²，郑春松³，李俐²，刘献祥¹，李西海¹，吴明霞²

¹福建中医药大学中西医结合研究院，福建省福州市 350122；²福建中医药大学附属第二人民医院，福建省福州市 350003；³福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建省福州市 350122

修回日期:2017-06-21 出版日期:2017-08-28 发布日期:2017-08-30
通讯作者: 吴明霞，博士，主任医师，教授，博士生导师,福建中医药大学附属第二人民医院，福建省福州市 350003；并列通讯作者：李西海，博士，研究员，硕士生导师，福建中医药大学中西医结合研究院，福建省福州市 350122
作者简介:付长龙，男，1987年生，山东省济宁市人，汉族，福建中医药大学在读博士，主要从事中西医结合骨关节炎研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81373719)

Electroacupuncture delays articular cartilage degeneration in osteoarthritis via Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway

Fu Chang-long¹, Chen Hou-huang¹, Zhu Ding-yu², Wu Zhui-le¹, Xu Xin², Zheng Chun-song³, Li Li², Liu Xian-xiang¹,Li Xi-hai¹, Wu Ming-xia²

¹Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; ²the Second People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; ³the Key Laboratory of Senile Diseases of Integrative Medicine in Fujian Province, Fuzhou 350122, Fujian Province, China

Revised:2017-06-21 Online:2017-08-28 Published:2017-08-30
Contact: Wu Ming-xia, M.D., Chief physician, Doctoral supervisor, the Second People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; Li Xi-hai, M.D., Researcher, Master’s supervisor, Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
About author:Fu Chang-long, Studying for doctorate, Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81373719

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
信号通路：是指能将细胞外的分子信号经细胞膜传入细胞内发挥效应的一系列酶促反应通路。这些细胞外的分子信号(称为配体，ligand)包括激素、生长因子、细胞因子、神经递质以及其他小分子化合物等。当配体特异性地结合到细胞膜或细胞内的受体(receptor)后，在细胞内的信号发生了一系列的变化。
Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路：在细胞因子受体刺激下，RAS可经激活转化为活化型RAS，而与GTP结合的活化的Ras可激活下游靶标Raf，然后使MEK的2个丝氨酸残基磷酸化，并活化其唯一的底物ERK1/2，而活化的ERK形成二聚体，转入细胞核，以此参与调控软骨细胞增殖、分化、炎症反应以及细胞凋亡等。

摘要
背景：前期研究发现，电针可通过影响骨性关节炎软骨细胞JAK-STAT信号通路，并有效增加转化生长因子β1含量及促进关节软骨中STAT3、Smad3、LepR mRNA的表达以延缓关节软骨退变，同时电针后血清能有效抑制凋亡调控基因p38、Fas mRNA，并降低MAPK信号通路的表达，从而抑制软骨细胞凋亡。
目的：从Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路探讨电针对骨关节炎大鼠软骨退变的影响。

方法：选取2月龄健康雄性SD大鼠120只，随机抽取30只为正常组，其余90只大鼠用4%木瓜蛋白酶法进行双侧关节腔注射造模后再用抽签法随机分为3组，即造模组30只、电针15 min组30只、电针30 min组30只。于造模后2周开始给予电针治疗，电针15 min组与电针30 min组均为5次/周，连续干预12周后，苏木精-伊红染色观察软骨形态，ELISA检测滑膜组织中白细胞介素1β表达，Western Blot 检测Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2、C-MYC、C-FOS、C-JUN蛋白含量表达。

结果与结论：①经苏木精-伊红染色，模型组关节软骨表面局部粗糙不平，软骨层变薄，４层结构缺失，且潮线不完整，电针15 min组和电针30 min组的软骨表层基本完整，软骨层次清晰可辨，潮线相对完整；②ELISA结果显示，模型组白细胞介素1β表达含量明显高于正常组(P < 0.01)，电针15 min组与电针30 min组的白细胞介素1β含量表达均低于模型组(P < 0.01)；③Western Blot结果显示，与正常组比较，模型组的Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2、C-MYC、C-FOS、C-JUN均表达升高。与模型组比较，电针15 min组与电针30 min组的Ras、Raf、MEK1/2、C-MYC、C-FOS、C-JUN蛋白含量表达显著降低(P < 0.01，P < 0.05)，同时亦降低ERK1/2表达；④结果提示，电针可通过调控Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路的相关指标，下调关节软骨Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2、C-MYC、C-FOS、C-JUN蛋白表达，并降低滑膜组织中白细胞介素1β含量表达，从而延缓骨关节炎软骨退变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-8508-9830(付长龙)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 软骨, 滑膜, 骨关节炎, 电针, Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that electroacupuncture can delay articular cartilage degeneration mediated by JAK-STAT signaling pathway through upregulating the expression level of transforming growth factor β1 as well as mRNA expression levels of STAT3, Smad3 and LepR. In the meanwhile, electroacupuncture can inhibit the mRNA expression of p38 and Fas mRNA mediated by MAPK signaling pathways, further inhibiting the apoptosis of chondrocytes.

OBJECTIVE: To explore the effect of electroacupuncture on the degeneration of articular cartilage in rats with knee osteoarthritis based on Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway.

METHODS: 120 male healthy Sprague-Dawley rats aged 2 months olds were selected and randomly divided into normal, model, 15-minite electroacupuncture and 30-minute electroacupuncture groups (n=30 per group). The rats in the latter three groups received the intra-articular injection of 4% papain bilaterally, and the remaining rats received no intervention. At 2 weeks after modeling, the latter two groups were respectively given 15- and 30-minute electroacupuncture, five times weekly for consecutive 12 weeks. The morphology of the cartilage was observed by hematoxylin-eosin staining, the expression level of interleukin-1β in the synovium was detected by ELISA assay, and the protein expression levels of Ras, Raf, MEK1/2, ERK1/2, C-MYC, C-FOS, and C-JUN were detected by western blot analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that: in the model group, the cartilage surface was rough, the cartilage layer became thinner, and the cartilage structure was damaged with incomplete tidal line; in the 15- and 30-minute electroacupuncture groups, the cartilage structure was complete with clear layers and complete tidal line. ELISA showed that the expression level of interleukin-1β in the model group was significantly higher than that in the normal group (P < 0.01), and the level in the 15- and 30-minute electroacupuncture groups was significantly lower than that in the model group (P < 0.05). Western blot assay found that compared with the normal group, the protein expression levels of Ras, Raf, MEK1/2, ERK1/2, C-MYC, C-FOS, and C-JUN were increased in the model group. However, all above protein levels except ERK1/2 in the 15- and 30-minute electroacupuncture groups were significantly lower than those in the model group (P < 0.01, P < 0.05). To conclude, electroacupuncture inhibits the degeneration of articular cartilage in osteoarthritis via Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway and downregulating the expression level of interleukin-1β.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Cartilage, Synovial Membrane, Osteoarthritis, Electroacupuncture, Signal Transduction, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

付长龙，陈后煌，朱定钰，吴追乐，徐欣，郑春松，李俐，刘献祥，李西海，吴明霞. 电针延缓骨关节炎软骨退变：基于Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路的认识[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(24): 3790-3795.

Fu Chang-long, Chen Hou-huang, Zhu Ding-yu, Wu Zhui-le, Xu Xin, Zheng Chun-song, Li Li, Liu Xian-xiang,Li Xi-hai, Wu Ming-xia. Electroacupuncture delays articular cartilage degeneration in osteoarthritis via Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(24): 3790-3795.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠120只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 软骨组织苏木精-伊红染色结果 苏木精-伊红染色显示，正常组软骨表层平整，胞质和软骨基质着色均匀并染成粉红色，软骨细胞分布均匀且排列整齐，胞核呈蓝色，4层结构(尤其潮线)完整且清晰可辨(图1A)；模型组关节软骨表面局部粗糙不平，软骨层变薄，软骨细胞裸露、簇集生长且排列絮乱，4层结构(尤其潮线)不完整(图1B)；电针15 min组和电针30 min组浅软骨表层基本完整，软骨层次清晰可辨，潮线相对完整(图1C和1D)。

2.3 ELISA结果 电针对骨关节炎大鼠滑膜组织白细胞介素1β表达的影响如图2所示，模型组白细胞介素1β表达明显高于正常组(P < 0.01)，而电针15 min组与电针30 min组的白细胞介素1β表达均低于模型组(P < 0.01)

2.4 Western Blot结果

2.4.1 Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2蛋白表达检测结果Western Blot结果如表1与图3所示，电针作用于骨关节炎大鼠软骨后，可下调Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2蛋白含量表达。与正常组相比，模型组在Ras、Raf、MEK1/2含量均显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05或0.01)，在ERK1/2上有较高表达(P > 0.05)，综上提示软骨在一定程度上发生退变；在Ras、Raf、MEK1/2指标上，与模型组相比，电针15 min组与电针30 min组的蛋白含量均显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)，在ERK1/2指标上表达降低(P > 0.05)，提示电针可通过调控Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2表达，在一定程度上延缓软骨细胞的退变进程。

2.4.2 C-MYC、C-FOS、C-JUN蛋白表达检测结果Western Blot结果如表2与图4所示，电针作用于骨关节炎大鼠软骨后，可下调C-MYC、C-FOS、C-JUN蛋白含量表达。与正常组相比，模型组在C-MYC、C-FOS、C-JUN含量均显著升高，差异有显著性意义(P < 0.01)；与模型组相比，电针15 min组与电针30 min组的蛋白含量表达均显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)，提示电针可通过调控Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2信号通路的下游信号分子C-MYC、C-FOS、C-JUN蛋白含量表达，延缓软骨细胞的退变进程。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年1月至2017年3月在福建中医药大学中西医结合研究院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 2月龄SD雄性大鼠120只(清洁级)；购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[合格证号：SCXK (沪)2012-0002]。实验动物饲养于福建中医药大学实验动物中心，使用许可证号：SYXK(闽)2009-0001，分笼饲养，自由饮水，标准饲料喂养。

1.3.2 试剂及仪器 华佗牌SD-Ⅱ型电子针疗仪(苏州医疗用品厂有限公司)；华佗牌一次性不锈毫针，规格：13 mm× 0.25 mm(苏州医疗用品厂有限公司)；、苏木精-伊红(HE，中国北京索莱宝科技有限公司)；白细胞介素1β酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(美国R＆D Systems公司)；PMSF (蛋白酶抑制剂)；RISF(裂解液)；蛋白上样缓冲液(Thermo)；30%聚丙烯酰胺、Tris(pH 8.8与pH 6.8)、SDS(十二烷基磺酸钠)、10×电泳液、AP(过硫酸铵)、TEMED、50×TAE均购于碧云天；10×TBST (索莱宝)；高效封闭液(康为世纪)；一抗(兔抗)：Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2、C-MYC、C-FOS、C-JUN(Abcam， Cambridge， UK)；二抗(羊抗兔)(Cell Signaling Technology)；1-StepTM Transfer Buffer (批号：PA 196400， Thermo)；ECL发光显影液(碧云天)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组、造模、干预、取材 2月龄SD雄性大鼠120只，随机分为正常组(n=30)和实验组(n=90)。实验组采用4%木瓜蛋白酶0.2 mL双膝关节腔注射复制膝骨关节炎模型^[8]，将造模成功的实验组大鼠随机分为3组，即模型组、电针15 min组与电针30 min组，每组30只。造模后2周开始干预，实验组取双侧膝关节内、外膝眼，采用13 mm×0.25 mm毫针垂直刺入3 mm，华佗牌SD-Ⅱ型电子针疗仪脉冲频率2 Hz，输出脉冲强度2 mA，每周治疗5 d，休息2 d，总共治疗12周。电针15 min组每天电针治疗15 min，电针30 min组每天电针治疗30 min，正常组和模型组正常饲养。治疗时间按人和动物药物等效剂量换算：给药剂量=临床常用量×动物等效面积系数，确定电针干预时间为15 min等效于临床30 min的治疗时间^[9]。各组治疗结束后，水合氯醛麻醉，切取右后肢股骨内髁用于苏木精-伊红染色，外髁软骨组织提取组织蛋白，并将分离后的关节滑膜置于1.5 mL离心管中，迅速置入液氮中，储存备用。

1.4.2 软骨组织苏木精-伊红染色 取股骨内髁进行切片后常规脱蜡，苏木精染色10 min，流水漂洗1 min，迅速返蓝(1%盐酸乙醇溶液)2 s，再用0.5%伊红染液染色5 s，依次经梯度乙醇脱水、梯度二甲苯透明、封固(中性树脂)、观察与鉴定(光学显微镜)。

1.4.3 ELISA检测滑膜白细胞介素1β含量表达 取滑膜组织，精确称量1 g，加入10 mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，置于冰上进行超声粉碎，震荡充分后，调至12 000 r/min进行高速离心，取上清液，依据ELISA试剂盒操作步骤进行加样，完成后使用酶标仪(450 nm波长)进行检测。

1.4.4 Western Blot检测软骨组织Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2、C-MYC、C-FOS、C-JUN表达 取股骨外髁软骨，提取总蛋白，并进行BCA蛋白定量；按配方说明先配制12%分离胶并进行灌板，一边用蒸馏水压平胶面一边用细针赶出气泡，待分离胶凝固后吸干上层水分，按说明配制5%浓缩胶并进行灌板，快速插入梳子，排除气泡后，置于室温下凝固；上样：安装固定电泳装置，待内槽加入新配电泳液后，轻轻拔出梳子，按每孔20 μg量计算上样体积后依次加入，蛋白Marker加入5 μL/孔，开始电泳，电泳条件为：恒流下，以20 V电压先跑10 min，再调制50 V电压跑30 min，最后调整到100 V电压跑至分离胶底部；转膜、封闭及杂交：采用半干式进行转膜，先将与目的胶大小相符的PVDF膜经甲醇活化10 min后，与三层滤纸一起置于高效转膜液中浸泡，以半干转仪盘底为参照从下至上依次为滤纸→膜→胶→滤纸的顺序依次添加，安装完毕后，调整电流为1.3 A、电压25 V进行转膜，转膜完毕后，迅速取出膜并标记蛋白面，后将其置于TBST中漂洗2遍。脱脂牛奶封闭2 h；洗膜：将各条膜放入预先配置好的β-actin、Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2、C-MYC、C-FOS、C-JUN (1∶1 000)的一抗后置于4 ℃冰箱摇床震荡过夜，后用镊子轻柔夹出PVDF膜，用TBST漂洗3遍(10 min/遍)，再加入装有二抗(1∶5 000)封闭袋中后，排出气泡后置于摇床上室温反应1 h，然后置于TBST漂洗专用盒中漂洗3次(10 min/次)，最后配制ECL发光液进行显影，在凝胶成像仪下曝光成像并分析储存。

1.5 主要观察指标 ①大鼠滑膜组织白细胞介素1β表达；②软骨组织、Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2、C-MYC、C-FOS、C-JUN的表达。

1.6 统计学分析 实验数据统计使用SPSS 19.0软件包进行分析，计量资料采用x(_)±s表示；两组间比较选取t 检验与单因素方差分析；各组间比较采用χ²检验，P < 0.05或P < 0.01为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

骨性关节炎又称退行性关节炎或增生性关节炎，是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病。流行病学调查发现，原发性骨关节炎患者最显著的流行病学特点是随着患者年龄增加，发病率不断增高，通常好发于50岁以上人群^[10-12]。伴随年龄增长和全社会人口老龄化进程加剧，骨性关节炎严重影响中老年人的生活质量，给家庭和社会造成了很大负担^[13-14]。因此，世界卫生组织高度重视，并倡导从2000至2010年作为防治“骨关节炎十年”；2002年中国卫生部、中华医学会、医药卫生科技发展研究中心联合宣布2002至2012年作为“中国骨骼与关节健康十年”。防治骨性关节炎成为全世界人民公共健康的一个重大课题，是改善中老年人生活质量，减轻社会负担的一个重要任务。

当前骨关节炎发病机制尚未完全阐明，现代医学已从分子蛋白、生化代谢及组织形态学等方面对其发病机制进行初步探索，其中软骨退变是导致膝骨性关节炎的重要事件^[15-19]。前期研究发现，电针可通过影响骨性关节炎软骨细胞JAK-STAT信号通路，并有效增加转化生长因子β1含量及促进关节软骨中STAT3、Smad3、LepR mRNA的表达以延缓关节软骨退变^[20]，同时电针后血清能有效抑制凋亡调控基因p38、Fas mRNA，并降低MAPK信号通路的表达，从而抑制软骨细胞凋亡^[21]，由此提示，电针在治疗骨关节炎具有多靶点、多效能的作用。本实验通过进一步研究电针对关节软骨Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路的相关指标影响，以探讨其作用机制。

Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路是由一个小GTP结合蛋白连接激活的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白激酶级联反应。其属于“MAPK”众多通路中的一员。MAPKKK(丝/苏氨酸蛋白激酶)、MAPKK(磷酸化苏/酪氨酸蛋白激酶)、MAPK(丝/苏氨酸蛋白激酶)是组成MAPK信号通路的3种核心蛋白激酶，而Raf、MEK、ERK则分别是构成以上3种蛋白激酶的重要组成部分^[22-24]。

相关研究表明，Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路参与调控骨关节炎软骨退变病理进程，其中ERK信号在骨关节炎中高表达，而其活化始于对RAS的激活，在细胞因子受体刺激下，RAS可经激活转化为活化型RAS，而与GTP结合的活化的Ras可激活下游靶标Raf，然后使MEK的2个丝氨酸残基磷酸化，并活化其唯一的底物ERK1/2，而活化的ERK形成二聚体，转入细胞核，以此参与调控细胞增殖、分化、炎症反应以及细胞凋亡等^[25-26]。C-MYC、C-FOS、C-JUN作为Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路的下游调控蛋白，其主要作用是参与转录，一旦ERK被激活，可磷酸化C-MYC，并依次激活C-FOS、C-JUN，参与细胞的增殖、分化和凋亡，其细胞原癌基因的表达和原位末端标记的阳性细胞与骨关节炎的病损软骨具有密切联系^[27-28]。

此外，白细胞介素1作为加剧软骨退变的主要炎性因子之一，不仅引起关节软骨基质的降解，抑制软骨细胞增殖，还可促进细胞释放其他炎性因子，抑制与软骨细胞表型分化相关的基因表达并诱导软骨细胞凋亡^[29-30]，相关研究发现，白细胞介素1β可以按照剂量依赖方式上调软骨细胞C-MYC表达，并增加软骨细胞凋亡率^[31]，进而提示，白细胞介素1β可通过调控下游信号分子C-MYC等表达，参与Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路对关节软骨的影响。实验结果显示，经苏木精-伊红染色的电针15 min组和电针30 min组浅软骨表层基本完整，软骨层次清晰可辨，潮线相对完整；ELISA结果发现，模型组滑模组织中白细胞介素1β表达明显高于正常组(P < 0.01)，而电针15 min组与电针30 min组的白细胞介素1β表达均低于模型组(P < 0.01)；电针15 min组与电针30 min组作用于骨关节炎大鼠软骨后，其Ras、Raf、MEK1/2、C-MYC、C-FOS、C-JUN蛋白含量均显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)，同时亦降低ERK1/2表达，进而提示电针可通过调控Ras-Raf- MEK1/2-ERK1/2信号通路的相关指标及其下游相关信号分子的蛋白表达，并降低滑膜中白细胞介素1β表达，从而延缓骨关节炎软骨退变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

电针延缓骨关节炎软骨退变：基于Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路的认识

Electroacupuncture delays articular cartilage degeneration in osteoarthritis via Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway

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