聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥对肺癌细胞毒性作用的体外实验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.005

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥：是一种重要的可塑性高分子材料，具有较好的透明性、化学稳定性、较高的抗张强度和可塑性，与人体组织有适应性，已广泛应用于骨科手术中，是椎体成形术中填充材料的主要成分。
细胞毒性：是由细胞或化学物质导致的细胞杀伤事件，是不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡。实验采用的量化细胞毒性评价方法是cck-8比色法，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞增殖越慢，则颜色越浅。通过测定细胞的吸光度(A)值计算细胞相对增殖率(RGR)来评价细胞毒性。

背景：经皮椎体成形是治疗脊柱转移瘤的一种微创手术方法，但术中注射的聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)骨水泥对肿瘤的治疗机制目前尚不明确。
目的：分析PMMA骨水泥及其单体对肿瘤细胞的细胞毒作用。
方法：将固化期、拉丝期PMMA骨水泥的浸提液及不同质量浓度单体的稀释液与人肺腺癌细胞spc-A1接触培养1，3 d后，采用细胞形态直接观察法和CCK-8比色法测定细胞吸光度(A)值，计算细胞相对增殖率(RGR)，评价PMMA骨水泥及其单体对肿瘤细胞的毒性。
结果与结论：①1 d 1 g/L组、10 g/L组的A值明显小于阴性对照组(P < 0.01)；3 d 1 g/L组、10 g/L组及拉丝期浸提液A值明显小于阴性对照组(P < 0.05)；②结果显示培养1 d 1 g/L组、10 g/L组的A值明显小于阴性对照组(P < 0.01)，细胞相对增殖率为26%-29%，毒性评价为4级；3 d 1 g/L组、10 g/L组的A值明显小于阴性对照组，细胞相对增殖率12%-16%，毒性评价为4至5级；3 d 100 mg/L组、拉丝期PMMA浸提液组的A值明显小于阴性对照组，毒性评价为2级。③结果表明，拉丝期PMMA骨水泥浸提液及PMMA单体质量浓度为100 mg/L-10 g/L时对肿瘤细胞有明显的毒性，说明经皮椎体成形过程中拉丝期PMMA骨水泥注入椎体后其释放的单体可能对肿瘤细胞存在细胞毒作用。

ORCID: 0000-0002-7606-4997(潘元星)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 经皮椎体成形术, 聚甲基丙烯酸甲酯, 骨水泥, 细胞毒, 肺癌细胞, 体外试验, 脊柱转移瘤

Abstract:

BACKGROUND: Percutaneous vertebroplasty is a minimally invasive treatment for spinal metastasis tumor, but the mechanism of the injected polymethylmethacrylate (PMMA) bone cement in the treatment of tumor is not fully understood.
OBJECTIVE: To explore the cytotoxicity of PMMA bone cement and its monomers on tumor cells.
METHODS: PMMA extracts in the wire drawing and curing periods and different mass concentrations of monomer dilutions were co-cultured with human lung cancer cells spc-A1. The cell morphology was observed using inverted microscope, the absorbance (A) values were detected by cell counting kit- 8 assay, the relative growth rate was calculated, and the toxicity of PMAA bone cement and its monomers was evaluated at 1 and 3 days of culture, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: At 1 day of culture, the absorbance values in the 1 and 10 g/L groups were significantly lower than that in the negative control group (P < 0.01). The absorbance values in the 1 g/L, 10 g/L, 100 mg/L and wire drawing extract groups were significantly lower than those in the negative control group at 3 days of culture (P < 0.05). The relative growth rate in the 1 and 10 g/L groups was 26%-29%, and the level of toxicity was grade 4 after 1-day culture; at 3 days, the relative growth rate was decreased to 12%-16%, and the level of toxicity was grades 4-5. After 3-day culture, the level of toxicity reached to grade 2 in the 100 mg/L and wire drawing extract groups. These results indicate that PMMA bone cement in wiredrawing period and its monomers exert toxic effects on tumor cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Polymethacrylic Acids, Vertebroplasty, Neoplasms, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

潘元星，米川，施学东，王冰，崔云鹏，林云飞. 聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥对肺癌细胞毒性作用的体外实验[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(2): 187-191.

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图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞毒性试验，参照GB/T16886.5-2003- ISO 10993-5:1999标准。

1.2 时间及地点实验于2014年6至12月在北京大学肿瘤医院实验室完成。

1.3 材料

细胞株：人肺腺癌细胞株spc-A1(北京肿瘤医院实验室提供)，常规37 ℃，饱和湿度，体积分数5%CO₂环境中培养。

主要试剂及仪器：胎牛血清(BIOCHROM AG公司，经56 ℃、30 min灭活后使用)，含体积分数10%血清DMEM培养液(新鲜配制，pH 7.2)。细胞计数试剂盒CCK-8(Cell Counting Kit-8，日本同仁化学研究所)。CO₂恒温培养箱(Forma Scientific公司，美国)；DL-720超声清洗机(浙江象山石浦海天电子仪器厂)，FLUOstar Omega多功能酶标仪酶联免疫检测仪(德国)；奥林巴斯IX51倒置显微镜(日本)。

试样：美国史塞克公司spineplex不透射线骨水泥(PMMA)，使用前放置于4 ℃冰柜冷藏，每盒包括20 g粉和10 mL单体，无菌条件下按粉∶单体2∶1(g∶mL)并搅拌1.0-2.0 min配置骨水泥。

1.4 实验方法

1.4.1 骨水泥浸提液制备浸提介质为含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液。无菌条件下按浸提介质/骨水泥=10 mL/g比例配制，分别配置拉丝期及固化期PMMA骨水泥的浸提液。将骨水泥单体稀释成0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L、1 g/L及10 g/L 7种质量浓度，用0.22 μm微孔滤器过滤除菌，37 ℃、体积分数5%的CO₂饱和湿度孵箱中浸提72 h。

1.4.2 细胞接种培养取1块消毒好的新96孔板，每块分为10组，每组3孔，各加入生长旺盛的人肺腺癌细胞spc-A1 5×10⁴个，第1组为加入DMEM的传代细胞培养液的阴性对照组。第2-8组分别测定不同浓度骨水泥单体毒性，第9-10组测定拉丝期及固化期骨水泥浸提液的毒性。实验开始后等各孔细胞贴壁24 h后，移去上清，按上述分组每孔分别加入上述浸提液及单体稀释液200 μL置37 ℃、体积分数5%CO₂环境中培养。设置加入相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

1.5 主要观察指标

1.5.1 倒置显微镜观察观察各组人肺腺癌细胞spc-A1的细胞形态。

1.5.2 cck-8测定吸光度值(A值) 实验采用的量化细胞毒性评价方法是cck-8比色法，当细胞与浸提液及单体稀释液作用1和3 d后，分别行cck-8检测，每孔加入cck-8溶液5 μL，常规继续孵育1 h后终止，酶联免疫检测仪450 nm波长下测定各孔A值。

1.5.3 评估材料的细胞毒性各组所测A值标准化后取均值，计算细胞相对增殖率(RGR)并评估PMMA单体毒性^[4]。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件处理数据，所有数据以x(_)±s表示。采用秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

脊柱是骨转移瘤最常发生的部位之一，转移部位的肿瘤细胞产生破骨细胞刺激因子，使破骨细胞活性增强，导致骨质破坏。转移病灶对椎体和附件的侵袭可引起脊柱病理性骨折，是导致胸腰背部疼痛的最常见因素^[5]。

目前治疗脊柱转移瘤的方法很多，包括放疗、化疗、同位素治疗、双膦酸盐治疗、手术治疗等。近年来，经皮椎体成形技术成为微创脊柱外科的热点之一，已广泛用于脊柱转移瘤患者的姑息性治疗。经皮椎体成形手术治疗脊柱转移瘤疗效肯定，但其治疗机制至今仍不明确。有学者认为其可能的机制是：骨水泥能恢复病变椎体的生物力学性能；骨水泥对肿瘤细胞的细胞毒作用，包括PMMA骨水泥聚合时的高温热毒性和PMMA单体的化学毒性^[6-7]。

PMMA骨水泥是由甲基丙烯酸酯与苯乙烯共聚粉及甲基丙烯酸甲酯单体组成的室温自凝固剂。Azhar等^[8]指出长期的暴露于PMMA单体下会对机体造成毒性的不良反应，包括接触性皮炎、口腔炎、肝脏毒性、肺组织坏死等严重并发症。

椎体成形术中应用的为低黏度骨水泥，在拉丝期时即要注入椎体以达到充分弥散的目的，若黏度太稀则会有大量单体释放进入血液循环系统，导致骨水泥植入综合征的发生^[9]。有研究显示，PMMA 单体质量浓度达到2 g/L时会对心肌细胞产生较为明显的活性抑制和凋亡诱导^[10]，并且呈剂量依赖性，单体质量浓度8 g/L时凋亡率达到65%。

Dahl等^[11]通过体外实验证实0.1-1 mg/L的单体可影响凝血功能，其在细胞培养中发现PMMA单体对粒细胞及内皮细胞存在细胞毒作用^[12]。Nishimiya等^[13]认为活性氧的产生会导致细胞组分的破坏及氧负荷的增加，诱导细胞的凋亡及坏死。PMMA单体基因毒性的机制仍未明确。Drozdz等^[14]研究BisGMA(双甲基丙烯酸缩水甘油酯)的毒性发现其对人体淋巴细胞存在基因毒性，并且通过微核测试发现PMMA单体对人体的粒细胞同样存在基因毒性，通过损害DNA，致使哺乳动物的细胞周期在G₁期和G₂/M期被延长，从而干扰细胞周期。

Radin等^[15]发现PMMA在体内产生的单体具有毒副作用，可引起周围神经末梢和肿瘤细胞的坏死，其效应与酒精相似。San等^[16]通过1例椎体成形术后6个月尸检结果发现骨水泥填充处肿瘤细胞几乎全部坏死，骨水泥周缘有3-11 mm宽的肿瘤细胞坏死区。Togawao等^[17]也发现经皮椎体成形术后，在骨水泥周围可见不同程度的骨质坏死，推测其原因可能为热损伤、单体毒性及局部缺血。Razuin等^[18]通过1例死亡患者尸检发现肺、肾等器官中存在PMMA单体微粒，认为大量单体进入血液循环系统与低氧血症、低血压、心律失常及心脏骤停等并发症密切相关。Pikis等^[19]发现头颅骨水泥成形术中，少数患者出现一过性或长期的神经系统症状，排除神经系统手术原因，考虑与注射骨水泥过程中单体的暴露有关。

为了验证经皮椎体成形术中注射PMMA骨水泥是否具有抗肿瘤作用，国内陈珑等^[20]经过CT引导下经皮穿刺接种VX2瘤块建立兔椎体动物模型，研究经皮椎体成形术中注射PMMA骨水泥对活体椎体肿瘤细胞的影响，研究发现PMMA骨水泥对活体椎体肿瘤细胞有明显的细胞毒作用，并通过诱导Bax与Bd-2的表达肿瘤细胞凋亡起到调控作用，但是该研究未进行测温工作，而且不能直接证明PMMA单体对肿瘤细胞的细胞毒作用。

为了排除高温引起的肿瘤细胞坏死，验证PMMA骨水泥及其单体是否对肿瘤细胞具有化学毒性，通过体外细胞培养实验，评估PMMA骨水泥及其单体对肺癌细胞的毒性作用。研究根据PMMA骨水泥及单体的形态采用了浸提液方式和直接接触方式进行试验。采取浸提液方式可使PMMA经过长时间的浸提，其残留的单体充分地浸提出来，而且浸提液能与培养细胞广泛接触，做到尽量客观地反映PMMA在应用时的真实情况。

实验中，PMMA单体质量浓度为100 mg/L在3 d时的毒性评价为2级；1 g/L及10 g/L组在1 d及3 d时的毒性评价为4至5级。说明单体质量浓度在100 mg/L时就对肿瘤细胞存在毒性作用，且随着单体质量浓度增加其毒性有增大的趋势。PMMA拉丝期浸提液组在1 d时毒性评价为2级，说明拉丝期PMMA接触培养液后可能释放出未聚合之单体，分析实验数据考虑按培养液/骨水泥=10 mL/1 g配制浸提液中单体质量浓度可能介于100 mg/L-1 g/L之间。

实验证实PMMA骨水泥浸提液及其单体对肿瘤细胞具有毒性作用，能抑制肿瘤细胞的生长，为探索经皮椎体成形手术治疗脊柱转移瘤的机制提供部分理论依据。但是，由于细胞培养实验为体外实验，与人体内的生理环境相差较大，且细胞培养时间较短，因此说明PMMA对肿瘤细胞具有细胞毒作用力度不够，尚需通过动物实验或者人体研究进一步说明。而且PMMA骨水泥在注入人体的过程中，大量单体会与粉剂发生聚合反应，残留单体非常有限，由于无法得知单体的确切残余剂量及其进入肿瘤组织的浓度，因此临床操作中骨水泥单体能否具有细胞毒作用，尚需进一步的研究验证。

孙强等^[21]报道混入唑来膦酸的PMMA骨水泥缓释液能有效抑制乳腺癌细胞的生长。有研究表明，混合甲氨蝶呤(MTX)的PMMA骨水泥具有填充及抗肿瘤的作用，而加入羧甲基壳聚糖能增强MTX-PMMA骨水泥的抗肿瘤效果^[22]。随着技术研究的进步，载药的PMMA材料有望为椎体成形术提供更多的填充物选择。

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