超微超顺磁性纳米氧化铁标记犬口腔黏膜上皮细胞与磁共振成像实验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.52.006

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (52): 7796-7802.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.52.006

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超微超顺磁性纳米氧化铁标记犬口腔黏膜上皮细胞与磁共振成像实验

周术奎¹，姚婷婷²，张楷乐¹，邹青松¹，傅强¹

上海交通大学附属第六人民医院，¹泌尿外科，²放射科，上海市 200233

收稿日期:2016-09-19 出版日期:2016-12-16 发布日期:2016-12-16
通讯作者: 傅强，教授，博士生导师，主任医师，上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科，上海市 200233
作者简介:周术奎，男，1985 年生，四川省成都市人，汉族，上海交通大学医学院在读博士，医师，主要从事组织工程技术在泌尿系统中的应用研究。并列第一作者：姚婷婷，女，1986年生，上海市人，汉族，2013年上海交通大学医学院毕业，硕士，技师，主要从事放射科基础研究与临床工作。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81270780)；上海市第六人民医院院内课题(院内-1711)

Magnetic resonance imaging of canine oral epithelial cells labeled with ultrasmall superparamagnetic iron oxide

Zhou Shu-kui¹, Yao Ting-ting², Zhang Kai-le¹, Zou Qing-song¹, Fu Qiang¹

¹Department of Urinary Surgery, ²Department of Radiology, Affiliated Sixth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China

Received:2016-09-19 Online:2016-12-16 Published:2016-12-16
Contact: Fu Qiang, Professor, Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Urinary Surgery, Affiliated Sixth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China
About author:Zhou Shu-kui, Studying for doctorate, Physician, Department of Urinary Surgery, Affiliated Sixth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China Yao Ting-ting, Master, Technician, Department of Radiology, Affiliated Sixth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China Zhou Shu-kui and Yao Ting-ting contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81270780; the Subject of Shanghai Sixth People’s Hospital, No. 1711

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
磁共振成像技术：原子核有自旋运动，在恒定的磁场中，自旋的原子核将绕外加磁场作回旋转动，其运动频率与所加磁场的强度成正比，如在此基础上再加一个固定频率的电磁波，并调节外加磁场的强度，使进动频率与电磁波频率相同，这时原子核进动与电磁波产生共振，叫核磁共振。核磁共振时，原子核吸收电磁波的能量，记录下的吸收曲线就是核磁共振谱。由于不同分子中原子核的化学环境不同，将会有不同的共振频率，产生不同的共振谱。记录这种波谱即可判断该原子在分子中所处的位置及相对数目，用以进行定量分析及相对分子质量的测定，并对有机化合物进行结构分析，在医学上可用于研究活体状态下生物分子的功能活动和生理代谢。
超微超顺磁性纳米氧化铁：纳米氧化铁是一种新型的无机纳米材料，当粒径<50 nm时称之为超微超顺磁性纳米氧化铁，由于其粒径很小，容易被细胞吞噬，且代谢水平缓慢，能长期存留在细胞内，在核磁下呈低信号显影，可以作为细胞示踪剂使用，国外有文献报道其示踪时间最长可以达到18周。

背景：上皮细胞是组织工程常用的种子细胞类型，但如何无创性地对其进行体内示踪仍缺乏有效手段。
目的：探讨超微超顺磁性纳米氧化铁标记犬口腔黏膜上皮细胞及其体外磁共振成像的可行性。
方法：原代培养比格犬口腔黏膜上皮细胞，分别予以0，5，10，25，50，100 mg/L超微超顺磁性纳米氧化铁联合0.75 mg/L多聚赖氨酸标记犬口腔黏膜上皮细胞，普鲁士蓝染色鉴定不同质量浓度梯度下细胞内铁表达情况，CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖情况，确定最佳标记质量浓度。最后，将2×105个标记上皮细胞置于1 mL PBS缓冲液中重悬，行3.0 T MR T2*WI序列扫描，测量不同标记质量浓度下MRI灰度值。
结果与结论：①超微超顺磁性纳米氧化铁联合0.75 mg/L多聚赖氨酸成功标记口腔黏膜上皮细胞，普鲁士蓝染色显示细胞内存在蓝染铁颗粒，且随质量浓度增加，蓝染颗粒增加，至25 mg/L时蓝染率达到饱和；②CCK-8法检测结果表明超微超顺磁性纳米氧化铁质量浓度低于25 mg/L时，细胞增殖不受影响；③磁共振扫描显示，随着转染质量浓度增加，超微超顺磁性纳米氧化铁标记细胞磁共振信号降低；④结果表明，超微超顺磁性纳米氧化铁联合多聚赖氨酸能有效标记犬口腔黏膜细胞，且当转染质量浓度在25 mg/L以下时，不影响细胞增殖，体外磁共振成像显影良好。

ORCID: 0000-0002-6319-723X(周术奎)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 纳米材料, 超微超顺磁性纳米氧化铁, 口腔上皮细胞, 磁共振成像, 组织工程, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Epithelial cells are commonly used as the seed cell in tissue engineering; however, there is still a lack of an effective in vivo noninvasive trace technology.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of labeling canine oral epithelial cells with ultrasmall superparamagnetie iron oxide (USPIO) and magnetic resonance imaging (MRI) in vitro.
METHODS: Oral epithelial cells from beagles were primary cultured, and then labeled by 0.75 mg/L poly-L-lysine combined with USPIO (0, 5, 10, 25, 50 and 100 mg/L), respectively. To determine the optimal dosage, the intracellular iron expression was identified by Prussian blue staining, and the cell viability in different groups was detected by cell counting kit-8. Finally, 2×105 labeled cells were suspended with 1 mL PBS buffer, and were screened using 3.0 T MR on T2*WI sequences in vitro.
RESULTS AND CONCLUSION: USPIO prepared with 0.75 mg/L poly-L-lysine could successfully label dog oral epithelial cells. Prussian blue staining showed intracellular blue spots, and the intracellular blue spots became more with the concentration increasing and saturated at the concentration of 25 mg/L. Cell counting kit-8 indicated that the cell viability did not change when the concentration < 25 mg/L. Among the T2*WI sequences, the MRI signal intensity decreased with the concentration increasing. In conclusion, canine oral epithelial cells can be effectively labeled with USPIO making no impact on cell viability when the concentration < 25 mg/L, and MRI can be used to track these labeled cells in vitro．

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Iron Compounds, Nanostructures, Magnetic Resonance Imaging, Epithelial Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

周术奎，姚婷婷，张楷乐，邹青松，傅强. 超微超顺磁性纳米氧化铁标记犬口腔黏膜上皮细胞与磁共振成像实验[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(52): 7796-7802.

Zhou Shu-kui, Yao Ting-ting, Zhang Kai-le, Zou Qing-song, Fu Qiang.

Magnetic resonance imaging of canine oral epithelial cells labeled with ultrasmall superparamagnetic iron oxide

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(52): 7796-7802.

图/表（结果） 4

2.1 犬口腔黏膜上皮细胞的原代培养细胞接种4-6 h后即可见部分细胞贴壁，镜下见黑色点状分布，形状不统一。48 h后细胞明显增殖，4 d可见克隆细胞团形成，细胞数量明显增多，六七天后，上皮细胞融合80%，成簇生长，呈铺路石样外观(图1)，传代后4 d左右细胞再次融合，但传至第4代后可见细胞老化，细胞边缘毛刺样延展，细胞体积增大，增殖能力显著减弱。

2.2 USPIO标记上皮细胞的普鲁士蓝染色观察结果犬口腔黏膜上皮细胞与纳米氧化铁共孵育12 h，PBS清洗3遍，行普鲁士蓝染色，正置显微镜下观察，细胞内存在蓝染的铁颗粒，随着纳米氧化铁质量浓度梯度升高，细胞蓝染率明显逐级增加。当纳米氧化铁质量浓度为25 mg/L时蓝染率达到饱和，此时细胞标记阳性率为(96.6±2.8)%，即使质量浓度达到100 mg/L也不再增加，而未标记细胞内未见蓝染铁颗粒(图2)。

2.3 USPIO标记对上皮细胞增殖影响 CCK-8试剂盒检测USPIO转染上皮细胞后增殖情况(图3)，结果显示，在不同时间点，5，10，25 mg/L USPIO标记上皮细胞吸光度值与空白组(0 mg/L)比较差异均无显著性意义，而50，100 mg/L标记组与空白组吸光度值比较差异有显著性意义(50 mg/L，P < 0.05；100 mg/L，P < 0.01)，表明当USPIO质量浓度在25 mg/L及以下时，上皮细胞增殖不受影响。

2.4 USPIO标记上皮细胞核磁显影观察不同质量浓度USPIO标记相同数量级犬口腔黏膜上皮细胞MRI扫描结果显示，T2*WI序列均见信号降低，且随着USPIO质量浓度的增加，图像灰度值逐渐降低，呈低信号表达(图4)；图像灰度分析显示，PBS组和空白组 (0 mg/L)MRI扫描图像灰度值分别为212.1±4.06，207.6±5.35；5，10，25，50，100 mg/L USPIO转染上皮细胞MRI扫描灰度值分别为189.60±9.35，127.90±4.91，81.60±4.89，48.30±6.13，9.70±1.17，相同序列下各组信号值差异有非常显著性意义(P < 0.001)，通过观察发现，当USPIO质量浓度在25 mg/L时，肉眼便可对图像差异进行有效识别，因此USPIO可作为一种良好的细胞示踪剂。

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引言

材料方法

1.1 设计 USPIO标记上皮细胞与MRI显影。

1.2 时间及地点实验于2015年6至12月在上海市第九人民医院组织工程实验室和上海市第六人民医院放射科完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物雄性健康比格犬3只，8个月龄，体质量8-12 kg，由上海市第六人民医院动物房提供。实验过程中对动物的处置符合2009 年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

1.3.2 实验试剂及仪器设备 USPIO，粒径约15 nm，分散性好(上海交通大学纳米生物医学工程研究所)；多聚赖氨酸(Sigma公司，美国)；Defined-KSFM培养基、胎牛血清、三抗(Gibco公司，美国)；小鼠单克隆角蛋白抗体(Abcam公司，英国)；普鲁士蓝染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)；自动CO₂培养箱(Forma Scientific，美国)；超净工作台(上海博迅实验器材公司)；倒置显微镜(Olympus，日本)；MR扫描仪Magnetom Avanto 3.0 T(Siemens公司，德国)。

1.4 实验方法

1.4.1 犬口腔黏膜上皮细胞的培养上皮细胞培养参照课题组既往报道原代培养方法^[13]，首先3%戊巴比妥钠静脉麻醉比格犬，碘伏反复擦拭消毒口腔颊黏膜3遍，剪取约1.0 cm×1.0 cm大小黏膜组织，尽量用眼科剪去除多余黏膜下组织，1%庆大霉素浸泡45 min，剪成 2 mm×2 mm大小，放入盛有0.25%Dispase Ⅱ的Defined-KSFM培养基中4 ℃消化过夜，用镊子分离表皮，分离后的上皮组织置于0.05%胰酶+0.004%EDTA中，37 ℃消化10 min，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中和胰酶，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入Defined-KSFM重悬细胞，以1×10⁴/cm²接种于60 mm培养皿，37 ℃，体积分数为5%CO₂细胞培养箱中培养，第2天换液，吸弃未贴壁细胞及培养液，更换新鲜培养液。以后每隔2 d换液1次。

1.4.2 犬口腔黏膜上皮细胞的鉴定细胞培养至第2代后，PBS清洗3遍，40 g/L预冷的多聚甲醛固定15 min，0.2% Triton X-100通透15 min，体积分数为5%羊血清封闭30 min，小鼠单克隆角蛋白抗体(1∶500稀释)4 ℃孵育过夜，PBS洗5遍，兔抗小鼠二抗(1∶500稀释) 37 ℃避光孵育45 min，PBS清洗3遍，DAPI(1∶1 000稀释)染核，免疫荧光镜下观察拍照。

1.4.3 USPIO转染犬口腔黏膜上皮细胞第2代犬口腔黏膜上皮细胞生长融合至80%时，细胞生长状态良好，分别予0，5，10，25，50，100 mg/L纳米氧化铁转染上皮细胞，同时加入阳离子转染剂多聚赖氨酸 0.75 mg/L增加转染效率，转染12 h后，去除转染试剂，PBS清洗3遍，加入Defind-KSFM培养基继续培养。

1.4.4 普鲁士蓝染色观察上皮细胞USPIO标记情况第2代上皮细胞1×10⁵个接种12孔板细胞爬片，按照上述USPIO浓度梯度转染上皮细胞，40 g/L多聚甲醛固定 15 min，自来水冲洗2次，每次2 min，切片入peris stain染色30 min，蒸馏水冲洗2 min，入核固红染色液，淡染细胞核10 min，自来水冲洗5 s，常规脱水透明，中性树胶封固，正置显微镜下观察。

1.4.5 CCK-8检测USPIO标记上皮细胞增殖情况根据CCK-8检测试剂盒说明书操作，取第2代上皮细胞按照5 000个/孔接种96孔板，待细胞贴壁融合80%时，按照上述浓度梯度转染纳米氧化铁，转染12 h后去除上清液，PBS清洗3遍，重新加入Define-KSFM培养基继续培养，两三天换液1次，每隔24 h行CCK-8试剂盒检测，每孔加入CCK-8试剂10 μL，与孔内培养液体积比为1∶10， 37 ℃，体积分数为5% CO₂细胞培养箱中培养2 h。用酶联免疫监测仪测定各孔吸光度值，波长450 nm，参比波长为630 nm。每孔复测3次，取全部结果的平均值。上述方法共检测7 d，观察USPIO转染上皮细胞后细胞增殖情况。

1.4.6 USPIO标记上皮细胞磁共振显影上述各浓度梯度USPIO标记上皮细胞12 h，去除上清液，0.05%胰酶消化离心，以细胞浓度2×10⁸ L^-1重悬于PBS中，取细胞悬液1 mL置于EP管中；同时用同样体积不含细胞的PBS建立阴性对照。采用德国Siemens Magnetom Verio 3.0 T MR扫描仪，小鼠线圈，行轴面T2*WI序列扫描，扫描参数设置为：T2WI快速自旋回波(TSE)序列，层厚1.0 mm，TR 3 000.0 ms，TE68.0 ms；T2*WI GRE序列，层厚 2.5 mm，TR 866.0 ms，TE 19.9 ms。磁共振测取不同氧化铁浓度图像的MR灰度值，实验共重复3次。

1.5 主要观察指标 ①不同质量浓度下USPIO对上皮细胞转染效率；②USPIO标记对上皮细胞增殖影响；③不同质量浓度下USPIO磁共振成像分析。

1.6 统计学分析应用SPSS 17.0统计学软件，结果以x(_)±s表示，采用非参数检验分析比较普鲁士蓝检测不同质量浓度USPIO标记上皮细胞阳性率，单因素多样本方差分析比较不同质量浓度USPIO转染吸光度值和相同序列下不同质量浓度USPIO转染磁共振扫描灰度值，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

种子细胞体内移植后生存状态、位置和转归是组织工程研究的一项重要内容^[14-15]。上皮细胞是一种培养难度较大的细胞类型，需要专门的无血清培养基，体外培养传代后易老化，其细胞生长和生物活性容易受外来机械和理化刺激影响，因此如何在不影响细胞活性的前提下，有效对上皮细胞在体内的移植转归进行示踪是目前面临的主要难题之一。磁共振成像是目前最常用的分子成像方法，具有成像时间长、可动态观察、空间和时间分辨率高、对比度好等优点。临床常用MRI对比剂分为2种，一种是钆类阳性对比剂，在T1WI信号显示为高信号，另一种为含铁阴性对比剂，如USPIO，在T2WI表现为明显的低信号。钆类对比剂维持时间较短，有文献报道其标记的细胞只能在移植后2周内检测到^[16]，因此不能长期监测细胞在体内存活及转归情况。更为重要的是，钆类对比剂具有较大毒性，对肝肾等脏器损害大，无法长期应用^[17]。纳米氧化铁可被机体单核吞噬系统中的巨噬细胞吞噬，经正常的生化代谢途径进入体内铁循环，在合适剂量(≤60 mg/L)下使用对机体和细胞均无毒副作用^[18-19]。另外，MRI能检测USPIO标记的细胞信号时间长达6-18周^[20-22]，故可作为一种长期检测手段用于细胞示踪。

MRI作为一种无创的检测手段，可检测到极少量的细胞甚至单个细胞在体内迁移过程，有助于实现早期诊断^[23-26]。早前报道有多种细胞类型被USPIO成功标记并在磁共振下体内外显影，用于示踪细胞转归和早期病情诊断^{[7, 27-30]}。然而，多数文献选择干细胞或者前体细胞行纳米氧化铁转染示踪，上述细胞活性好，增殖能力强，转染相对容易且转染率高，对于上皮细胞等成体细胞转染和MRI标记则难度更大。USPIO和细胞表面均带负电荷，两者存在排斥反应，直接单纯应用USPlO标记细胞效率不高，而通过转染剂可显著提高标记效率^[31]。研究表明，多聚赖氨酸、硫酸鱼精蛋白及脂质体等多种转染剂均能显著增强细胞吞噬作用，其中阳离子转染剂多聚赖氨酸应用最多，能通过电荷吸附作用结合USPlO，改变其电荷极性，可以有效地被内涵体吞噬，并同等条件下减少USPIO使用剂量^[32-34]。关于多聚赖氨酸使用剂量目前尚未统一，可能与细胞类型和实验目的有关。Jasmin等^[35]利用0.375 mg/L多聚赖氨酸联合25 mg/L菲立磁转染大鼠骨髓间充质干细胞4 h即可成功标记细胞并有效核磁显影，标记率超过95%。Mishra等^[34]在含体积分数为10%胎牛血清的干细胞培养基中添加不同质量浓度多聚赖氨酸/USPIO复合物，实验结果证实，1.5 mg/L多聚赖氨酸+50 mg/L USPIO标记细胞效率最高，在此浓度下单个细胞内平均铁含量为 11.8 pg，且未观察到细胞毒性反应发生。由于实验上皮

细胞来源为原代培养，使用特定无血清培养基，细胞增殖力相对干细胞更弱，转染难度相对更大，作者参照文献资料，应用0.75 mg/L多聚赖氨酸促USPIO转染上皮细胞12 h，收到满意效果，25 mg/L USPIO转染12 h后，普鲁士蓝检测标记率达到(96.6±2.8)%，且体外MRI显影良好。

综上，USPIO联合多聚赖氨酸能有效标记犬口腔黏膜细胞，且当转染质量浓度在25 mg/L以下时，不影响细胞增殖，并可在体外磁共振成像显影良好，因此可作为上皮细胞的理想示踪手段。该实验研究虽在体外成功验证USPIO标记上皮细胞后磁共振示踪的可行性，但体内成像干扰因素更多，且存在自身免疫细胞吞噬清除可能，因此有待于在体内实验中予以进一步证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

超微超顺磁性纳米氧化铁标记犬口腔黏膜上皮细胞与磁共振成像实验

Magnetic resonance imaging of canine oral epithelial cells labeled with ultrasmall superparamagnetic iron oxide

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