生长激素和胰岛素样生长因子1在Lewis侏儒模型大鼠颞叶皮质中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.51.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
生长因子、胰岛素样生长因子1：除了垂体分泌生长因子生长激素外，大脑的其他部位如中脑、皮质、海马、下丘脑、纹状体、嗅球和小脑等脑区均检测到生长激素。实验中在垂体生长激素分泌缺乏的Lewis侏儒大鼠颞叶皮质中检测到了生长激素、胰岛素样生长因子1，进一步证实了大脑某些区域能独立于脑垂体的生长激素和外周血胰岛素样生长因子1而产生生长激素、胰岛素样生长因子1。
海马神经元干细胞：胎鼠的小脑半、中脑、海马、皮质、纹状体均可分离神经干细胞。成年大鼠中枢神经系统的广泛区域存在具有多项分化潜能的神经干细胞。实验中从成年SD大鼠海马分离神经元干细胞，在加入不同浓度生长激素共培养后发现生长激素能促进海马神经元干细胞向神经元细胞分化。

摘要
背景：胰岛素样生长因子1作为生长激素中的主要活性分子，发挥着多种生物学功能，其中便包括对认知功能改善和抗细胞凋亡作用。
目的：检测Lewis侏儒大鼠颞叶皮质中生长激素、胰岛素样生长因子1的表达，观察不同浓度生长激素对海马神经干细胞分化的影响。
方法：将11月龄(成年)、20 月龄(老年)Lewis侏儒及正常野生型大鼠断头处死，迅速开颅，在预冷过的生理盐水中分离出颞叶皮质，Western blot检测生长激素、胰岛素样生长因子1表达。在分离、纯化和鉴定了大鼠海马神经干细胞后，观察用不同浓度(10，30，90 μg/L)的生长激素培养96 h 后对海马神经干细胞分化的影响。
结果与结论：①成年、老年Lewis侏儒大鼠颞叶皮质中生长激素的表达量与正常同龄野生型大鼠相比，差异均无显著性意义(P > 0.05)；成年、老年Lewis侏儒大鼠颞叶皮质中胰岛素样生长因子1较野生型大鼠明显升高(P < 0.05)；成年雌性侏儒大鼠生长激素的表达量显著低于成年雄性侏儒大鼠(P < 0.05)；②荧光免疫组化结果显示分散的SD大鼠海马神经干细胞和前体细胞，在加入30 μg/L生长激素培养96 h 后，β Ⅲ-tubulin 阳性的神经元比例较对照组显著升高(P < 0.05)，但10 μg/L和90 μg/L生长激素处理组β Ⅲ-tubulin 阳性神经元的比例与对照组差异无显著性意义；③结果表明，Lewis 侏儒大鼠和野生大鼠颞叶皮质中均有生长激素、胰岛素样生长因子1的表达，这种表达独立于垂体生长激素和循环性胰岛素样生长因子1；生长激素具有促进海马神经干细胞和前体细胞向神经元分化的功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-5809-5020(蔡奕琪)

关键词: 组织构建, 组织工程, 胰岛素样生长因子1, Lewis侏儒大鼠, 生长激素, 颞叶皮质, 神经干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Insulin-like growth factor-1(IGF-1), a main active factor in growth hormone (GH), plays various biological functions, such as improving cognitive ability and anti-apoptotic action.
OBJECTIVE: To detect the expressions of GH and IGF-1 in the temporal cortex of Lewis dwarf rats, and to explore the effect of different concentrations of GH on the differentiation of hippocampal nerve stem cells (NSCs).
METHODS: Lewis dwarf rats aged 11(adult) and 20 (senile) month olds and normal wild-type rats were euthanized by decapitation, underwent the craniotomy quickly, and the temporal cortex in the cold saline was extracted. GH and IGF-1 levels were detected using western blotting. After isolation, purification and identification of the rat hippocampal NSCs, the effect of GH in different concentrations (10, 30, 90 μg/L) on the NSCs differentiation was determined at 96 hours after culture.
RESULTS AND CONCLUSION: The GH level in the temporal cortex did not differ significantly among rats (P > 0.05). While the IGF-I level in the temporal cortex of Lewis dwarf rats was significantly higher than that of the wild-type rats (P < 0.05). The GH level in the temporal cortex of adult female Lewis dwarf rats was significantly lower than that of the male rats (P < 0.05). Immunofluorescence showed that the proportion of β III-tubulin-positive neurons was significantly higher than that in the control group (P < 0.05) after the hippocampal NSCs and precursor cells cultured for 96 hours with GH (30 μg/L), but there was no significant difference between the control group and treatment group with GH of 10 or 90 μg/L. These results suggest that GH and IGF-I are expressed in the temporal cortex of both Lewis dwarf and wild-type rats which are independent from pituitary GH and the peripheral circulating IGF-1. Additionally, GH can promote the differentiation of hippocampal NSCs and precursor cells into neurons.

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Key words: Growth Hormone, Insulin-Like Growth Factor-1, Neural Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

蔡奕琪，王开飞，王盈盈，张苏华. 生长激素和胰岛素样生长因子1在Lewis侏儒模型大鼠颞叶皮质中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(51): 7690-7696.

Cai Yi-qi, Wang Kai-fei, Wang Ying-ying, Zhang Su-hua . Expression of growth hormone and insulin-like growth factor-1 in the temporal cortex of a Lewis dwarf model rat[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(51): 7690-7696.

图/表（结果） 4

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引言

生长激素是由脑垂体前叶嗜酸性颗粒的生长激素分泌细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，其分泌具有波动性，夜间变化幅度最大，青春期分泌最旺盛，随后逐渐减少，它肯定的作用是促进生长发育和影响代谢。最近发现，生长激素对神经系统疾病也具有较广泛的生理作用，特别是在神经修复和神经保护方面有比较肯定的作用。胰岛素样生长因子(insulinlike growth factor，IGF)在调节细胞分化增殖、机体生长发育、机体免疫和代谢以及抑制细胞凋亡中均发挥重要作用。IGF-2在出生后几乎不再发挥作用，而IGF-1则继续发挥多种生理作用。IGF-1除了在上述的许多方面有重要作用外，其在认知功能上所起的作用也开始引起关注。有实验表明中老年人多发的认知功能障碍与年龄并无明显的相关性，但与年龄增长过程中生长激素在体内含量的减少十分相关。此外童年开始的垂体功能减退引起的生长激素缺少，在患者成年后表现出认知缺乏，而给予生长激素替代治疗的患者认知功能在一段时间内得到明显的改善和恢复，此外，记忆能力和每日生长激素的平均用药量之间没有明显的相关性，而生长激素诱导的IGF-1的反应性增高比每日生长激素的用药剂量更能反应生长激素治疗的效果，说明IGF-1可能是改善认知功能的直接作用分子。胰岛素生长因子包括IGF-1和IGF-2。生长激素是由脑垂体前段释放，释放后与组织，尤其是肝脏膜表面的生长激素受体相互作用。IGF-1能促进躯体的生长发育，维持正常的新陈代谢等。IGF-1能够增强细胞周期的进展并促进细胞的有丝分裂。同时，IGF-1还是一种存活因子，减少多种细胞的凋亡。血清IGF-1为神经元供给营养且起到保护作用。有实验发现在缺氧缺血发生后24，38 h给予皮下注射IGF-1不仅能够起到神经保护的作用，而且能够明显的改善长期记忆和认知行为。先天性生长激素缺乏症(AO-GHD)患者记忆能力和每日平均生长激素的给予剂量之间没有明显的相关性，但大脑活动和生长激素诱导的血清IGF-1增加之间是存在显著的正相关性，体内IGF-1反应性增高比生长激素替代治疗的剂量更能反映生长激素治疗的效果，说明生长激素的替代治疗可能是通过体内IGF-1的增多而改善认知功能，IGF-1是直接的作用分子。IGF-1作为生长激素中的主要活性分子，发挥着多种生物学功能，其中便包括对认知功能改善和抗细胞凋亡作用。认知的结构基础是海马和大脑皮质^[1]。

文章试图通过检测衰老过程中侏儒大鼠和野生型大鼠颞叶皮质中生长激素、IGF-1的表达水平以及生长激素对海马神经干细胞分化的影响，了解生长激素/ IGF-1与认知功能的关系。

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材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点于2014年7月至2015年8月在福建医科大学基础医学院干细胞与组织工程实验室完成。

1.3 材料

主要实验试剂：兔源生长激素抗体，Santa Cruza 公司；小鼠源IGF-1抗体，Abcam 公司；羊源nestin 抗体，Santa Cruza 公司；兔源GFAP 抗体，Santa Cruza公司；小鼠源β Ⅲ-tubulin 抗体，Santa Cruza 公司；HRP 标记的羊抗小鼠二抗，Santa Cruza公司；HRP 标记的羊抗兔二抗，Santa Cruza 公司；FITC 标记的抗小鼠二抗，博世德；FITC 标记的抗羊二抗，博世德；Cy3 标记的抗兔二抗，博世德；其余试剂均为国产分析纯。

实验动物：Lewis野生型和侏儒大鼠及SD大鼠用于此实验，动物均由澳大利亚昆士兰大学Michael J.Waters 赠送，本实验室繁育。Lewis 侏儒鼠因垂体生长激素特异性缺乏，所以身体生长延缓，3个月大的幼鼠体质量比正常同龄轻40%。实验动物饲养在专门的动物房内并为它们提供标准实验室食物和水。

实验分为2组进行：成年(11月龄)侏儒和野生型大鼠，每组12只，雌雄各6只；老年(20月龄)侏儒和野生型大鼠，每组12只，雌雄各6只。24 h内新生SD大鼠用于制备神经干细胞。

1.4 方法

1.4.1 Western blot 检测生长激素、IGF-1蛋白表达水平断头处死大鼠，迅速开颅取脑，于颞叶皮质切取合适大小脑组织放于无菌EP管内，制备蛋白标本。随后进行蛋白电泳及转膜。具体操作步骤按照试剂盒说明进行。将目的膜条和内参膜条分别置于抗体孵育盒中，加入相应的一抗(anti-GH 抗体，1∶500，anti-IGF-1抗体1∶400，anti-β-actin1∶3 000，稀释于封闭液中)，保证膜与溶液充分接触。4 ℃过夜。TBST洗膜10 min× 3。使用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗封闭(anti-rabbit 1∶3 000；anti-mouse 1∶3 000)，室温孵育1 h。TBST洗膜10 min×3。显色反应：ECL底物发光液(按照 ECL Western blotting Protocols 说明书)，滤纸吸干膜上的液体，将ECL底物发光液滴加到结合有目的蛋白的PVDF膜上，将膜置于化学发光仪中，点击自动曝光。用Quantity one灰度分析软件得到蛋白条带灰度值。

1.4.2 SD大鼠海马神经干细胞的分离、培养、鉴定取24 h内新生SD大鼠三至四只，断头取脑，分离两侧海马，机械吹打成为单细胞悬液，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12 培养液，置入37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱30 min，去除为成纤维细胞，24 h后弃掉上清液，重新加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12 新鲜培养液培养72 h，离心弃掉上清液，换用神经干细胞培养液(含2%B27、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子及20 μg/L表皮生长因子的DMEM/F12培养液)，三至四天换液，七至八天传代1次。连续纯化培养约21 d，以作实验用材。神经干细胞高度选择性单克隆抗体Nestin(巢蛋白)行免疫细胞化学鉴定。

1.4.3 生长激素诱导大鼠海马神经干细胞的分化共分4组：①对照组：只加培养基(neuralbasal+2%B27+ 0.5%L-glutamine)；②实验组：分别加入10，30，90 μg/L的生长激素及培养基(neuralbasal+2%B27+0.5% L-glutamine)。每组设3个复孔，培养条件同上。加入处

理因素后48 h进行全量换液，按原来相同剂量加入处理因素，加入处理因素后96 h进行免疫组化。分别做βⅢ- tubulin和GFAP免疫荧光染色。

1.4.4 荧光免疫检测神经干细胞的分化荧光免疫检测具体操作步骤按照试剂盒说明进行。共聚焦显微镜下观察和拍照，处理和分析照片。

1.5 主要观察指标不同组别生长激素及IGF-1表达；海马神经元干细胞在不同浓度生长激素培养下βⅢ-tubulin阳性的神经元比例及GFAP 阳性的星形胶质细胞比例。

1.6 统计学分析计量数据以x(_)±s表示，统计分析采用Prism 5.0软件，两样本均数比较采用t 检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)，两两比较采用q 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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