3 研究目的 Study purpose
3.1 主要目的 ①明确TPM4在大鼠脊髓全横断损伤中的作用；②阐明其作用的可能分子机制。
3.2 次要目的 观察TPM4敲除对脊髓损伤大鼠运动功能恢复的作用。
4 动物的选择 Animal selection
选择雌性SD大鼠，体质量220-250 g，由四川大学实验动物中心提供。所有大鼠体型正常，健康状况良好，没有处于妊娠或哺乳期，排除健康状况不良，不活泼，有发烧、腹泻等症状者。
5 实验方法 Experimental methods
5.1 脊髓全横断损伤大鼠损伤脊髓TPM4表达变化 5.1.1 脊髓全横断损伤大鼠模型建立 大鼠腹膜内注射3.6%的水和氯醛(10 mL/kg)麻醉，麻醉成功后将大鼠俯卧固定于手术台上，沿背部正中线行一纵行皮肤切口，咬骨钳咬除T10-12椎板显露脊髓，完全横断脊髓。术后，大鼠自由饮食饮水，每天人工挤压膀胱协助排尿，持续两三天，肌注青霉素16×104 IU/(kg.d)直至损伤后3 d。
5.1.2 分组及取材 将SD大鼠随机分为4组：假手术组不横断脊髓；术后3 d组、术后14 d组和术后28 d组建立脊髓全横断损伤模型，分别在损伤后3，14和28 d处死大鼠，获取损伤头侧的脊髓组织并储存于-80 ℃备用。
5.1.3 二维凝胶电泳和蛋白质组学分析(TOF/TOFTM)
二维凝胶电泳和图像分析：0.2 g脊髓组织溶解于 1 mL裂解缓冲液，4 ℃下12 000 r/min离心，然后充分匀浆或裂解并在4 ℃下孵育15 min。收集上清，上清液中蛋白的总量用Bradford分析进行测定。然后，总蛋白(1.2 mg，580 μL)与DTT(0.02 g/mL)和Biolyte一起在室温下孵育1 h，接着在25 000 r/min下于4 ℃孵育10 min。用一维等电聚焦方法(IEF)进行分离后干燥，行固定的pH梯度(IPG)分带(17 cm，pH3-10)实验操作。二维电泳在12%SDS-PAGE凝胶上进行，然后凝胶块用考马斯亮蓝G-250进行染色。蛋白条带染色图像用Bio-Rad图像扫描仪进行扫描，差异蛋白的表达用PDQuest 7.4软件(Bio-Rad)进行识别。只有存在显著变化(1.5倍)的蛋白点才被选择行TOF/TOFTM分析。在同一条件下进行2D电泳2次以确保每批标本实验数据的一致性。
蛋白点的酶消化实验：凝胶蛋白点在50%乙腈和 50 mmol/L NH4HCO3的混合液中脱色2次，每次20 min，接着用100%的乙腈脱水反应10 min。蛋白点凝胶块在37 ℃下孵育5-10 min。干的凝胶块用胰蛋白酶在4 ℃下酶解30 min，然后于37 ℃下过夜。通过加入50%乙腈和0.1%三氟乙酸后反应30 min对蛋白标本中的肽进行提取，然后用N2进行干燥。最后，全部干燥的肽被重新溶解于0.8 μL质量浓度为0.5 g/L的基质溶液，然后在MALDI金属板上进行打点。
蛋白质组学分析(TOF/TOFTM)：蛋白质标本用质谱分析法进行分析。差异变化蛋白质的识别通过GPS(3.6版，应用生物系统)-MASCO(2，1版，Matrix Science, London，UK)数据库搜索引擎证实。在蛋白质数据库中5个最大的报道的采样数中，带有独特的肽的最高Mowse分数(至少25%范围)得到Western blot 验证，以此消除与多种蛋白质家族的匹配蛋白质的重复。
5.1.4 实时定量PCR(qPCR)检测TPM4基因的变化 总RNA用TRIzol试剂(Invitrogen)进行提取，然后根据说明书反应行反转录反应。qPCR应用TaqMan® One-Step PCR Master Mix (Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA)进行。qPCR分析用Step One Plus序列电测系统重复检测3次。引物序列如下：TPM4正义链 5’-GGA GAT GCA GCT CAA AGA-3’; 反义链5’-CAG CCT CCA GTG ATT TCA GAT-3’; TM：5’-CTC ACC CTC CAG GAT GAC C-3’。PCR循环条件为：95 ℃反应 10 min，95 ℃反应15 s，51 ℃反应1 min，共40个循环。所有的PCR反应都在热循环系统(ABI 7300)中进行。阈值设定在非模板对照背景之上，并在靶基因线性相扩增范围内，此时转录本的循环次数被检测(denoted Ct)。
5.1.5 Western blotting检测TPM4蛋白的变化 获取的脊髓标本在RIPA裂解缓冲液中消化。首先用BCA法进行蛋白定量，然后含100 μg总蛋白的标本通过15%SDS-PAGE进行分离并转到PVDF膜上。在室温下被TBST阻滞1 h后，膜分别与兔抗TPM4(1∶500)和 β-actin的Ⅰ抗反应过夜。用TBST液洗涤3次，每次 10 min后，膜与Ⅱ抗(1∶500，羊抗兔IgG)偶联的辣根过氧化物酶在室温下一起孵育2 h，然后用增强-化学发光试剂ECL进行显影。β-actin用作内对照。每个TPM4和β-actin蛋白条带的吸光度值分别被计算，然后获得其比值用于最后的统计学分析。
5.1.6 免疫荧光染色检测TPM4蛋白的定位 为了描绘TPM4在脊髓的细胞定位，大鼠麻醉后用冰的生理盐水及4%冰低聚甲醛进行灌注。然后脊髓组织用冰冻切片机切成15 µm厚的切片，用PBS冲洗3次。加入含体积分数5%羊血清的PBS在37 ℃孵育30 min以消除非特异性结合，然后与Ⅰ抗(兔TPM4抗体，1∶400)和体积分数5%羊血清一起于4 ℃孵育过夜。随后，组织切片用PBS清洗3次后与Ⅱ抗(羊抗兔，1∶200)于37 ℃下反应2 h。经PBS冲洗3次后，切片用DAPI荧光标记核，盖上盖玻片。最后，Leica AF6000用于获得细胞荧光图像。为了验证Ⅰ抗的免疫荧光特异性，在阴性对照组中，Ⅰ抗用PBS代替。
5.2 体外慢病毒重组体SiRNA干扰技术方法敲除TPM4
5.2.1 TPMS慢病毒ORF/SH RNA重组体的构建 实验首次构建了编码TPM4的质粒与樱桃荧光蛋白的融合体。TPM4 cDNA序列通过RT-PCR获得，使用的引物序列为：TPM4，正义链5’-ATC CAC GCT GTT TTG ACC- 3’, 反义链 5’-CCG GAC ACG CTG AAC TTG T -3’。TPM4 cDNAs被插入XhoI和EcoRI间的限制性酶切位点- pReceiver-Lv127。
此外，设计了4个系列的潜能性shRNS序列以一种特别的方式沉默TPM4的表达。每个shRNA序列包含一个选择的siRNA序列对应的包括正义和反义方向的TPM4 mRNA靶点(NCBI Accession Number NM_ 001001491.1)，通过一个发夹环序列(5’-TCA AGA G-3’)而分离。XhoI和EcoRI限制性酶切位点分别结合到5’和3’末端。潜能性的siRNA序列依据实验经验进行选择，是在siRNA设计工具的帮助下完成的。编码每个shRNA的DNA片段通过2个互补寡核苷酸的退火产生，接着将双链DNA片段插入psiHIV-U6(HIV为基础的)XhoI和EcoRI酶切位点之间。通过加入U6启动子从GeneCopoeiaTM中获得了psiHIV-U6。还在每个shRNA 序列设计了SV40 polyA以填满人造病毒。对于慢病毒载体的生成，TPM4在U6启动子控制下的有效表达在OS286704- HIVU6中得到恢复，OS286704-HIVU6插入慢病毒载体前体质粒ps 2 μL ORF iHIV-U6-eGFP中。
5.2.2 双酶切反应 将2 μL含有TPM4的ORF质粒加入18 μL不含核酸酶的水中，使反应体系总体积达到 20 μL；另一个含有1 μg空载体，2 μL 10×的缓冲液， 1 μL XhoI，1 μL EcoRI，加入不含核酸酶的水使反应总体积达到20 μL，作为对照。在37 ℃反应45 min和70 ℃反应5 min后，进行电泳检测，用Alpha Innotech (Bio-Rad)照相系统进行摄片。
5.2.3 C6细胞培养 C6细胞在37 ℃，饱和湿度，体积分数5% CO2，95%的空气下，以及在DMEM培养液添加体积分数10%胎牛血清、1%抗生素溶液(10 U/mL青霉素G和10 g/L链霉素的混合液)中培养。
5.2.4 有效的干扰片段筛选HIV 行短暂转染C6细胞的shRNA筛选。C6细胞被接种于6孔培养板中，每孔与总量为2 mg的DNA应用SuperFectinTMII在体外DNA转染试剂进行转染。转染后8 h更换新鲜细胞培养液。细胞培养48 h，SuPerfecTRITM总RNA分离试剂用于提取mRNA，然后继续合成用于PCR反应的cDNA。最后，PCR产物行10%琼脂糖凝胶电泳，用Alpha Innotech (Bio-Rad)系统进行显微照相。β-actin作为内对照。最后用Image J软件进行TPM4和β-actin的每个条带的灰度值分析。TPM4和β-actin的灰度值比值用于统计学分析。
5.2.5 慢病毒产物 转染2 d前，将1.5×106浓度的GeneCopoeia 293Ta慢病毒包装细胞接种于一个直径为10 cm的培养皿中，培养皿中有10 mL DMEM和5%热灭活胎牛血清，细胞达70%-80%融合时，于37 ℃，体积分数5% CO2条件下培养。
将2.5 μg慢病毒ORF/SH RNA表达质粒和5.0 μL (0.5 g/L)Lenti-Pac HIV与200 μL Opti-MEM 混合，命名为I液；将15 μL EndoFectinLenti用200 μL Opti-MEM I稀释，命名为Ⅱ液。将一滴Ⅱ液与Ⅰ液 混合，并在室温下孵育25 min，形成DNA-EndoFectin复合物，随后将此复合物直接加入每个细胞培养孔中，轻轻混匀。然后，293Ta细胞与以上混合液在37 ℃，体积分数5% CO2下孵育。培养12 h后，新鲜的DMEM加入10%胎牛血清，并添加青霉素、链霉素更换原培养液。将2.0 μL Titer Boost试剂加入细胞培养液并在培养箱中于37 ℃，体积分数5% CO2条件下培养48 h。最后，包含假病毒的无菌培养液在500×g下离心10 min以去除细胞碎片，从上清液中获取病毒。
5.3 TPM4敲除对脊髓横断损伤大鼠运动功能恢复的作用
5.3.1 干预方法 雌性SD大鼠随机分为4组，假手术组，术后3，14，28 d组。如上述的方法建立脊髓全横断模型，用纤维剪剪开背侧正中皮肤切口，显露脊髓。然后将TPM4 ORF或SH慢性毒(每注射点5 µL)分别注射入损伤脊髓的头侧。慢病毒空载体作为阴性对照。
5.3.2 行为学检测 在注射慢病毒后大鼠后肢的功能恢复用BBB方法经3个实验者用盲法(确保观察者不知道大鼠分组)进行评价。BBB评分在开放的视野进行，每周评估1次。
5.4 TPM4敲除对体外培养的脊髓神经元树突生长长度的作用
5.4.1 脊髓神经元培养和慢病毒体外转染 根据细胞中TPM4定位主要在神经元的实验结果，进行了脊髓神经元的培养，然后用慢病毒对其进行转染。从新生SD大鼠获取脊髓组织，剪成约1 mm3大小的组织块，37 ℃条件下DNAase消化反应30 min。加入等量含体积分数10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM终止消化，制成细胞悬液后，在1 000 r/min于4 ℃下离心10 min。弃上清，细胞重悬于同样的培养液中，轻轻吹匀，将细胞接种于24孔培养板，接种细胞浓度为2×108 L-1。培养24 h后将培养液更换为新鲜的神经基础(GIBCO)培养液+ 1%青霉素/链霉素+2% B27。接种后6 d ，神经元用含慢病毒(10 μL)和聚凝胺(3 μL)的DMEM转染。细胞在 4 ℃下孵育2 h，然后在培养箱中于37 ℃，体积分数5% CO2下培养12 h。然后将培养液更换为N+B27培养液以观察细胞形态。光镜200倍的细胞影像在转染后0，2和 4 d通过应用LEICA DMI6000B获得，分别检测细胞轴突长度、细胞体和细胞数目。
5.4.2 siRNA合成并作用于PC12细胞 siRNA合成参考美国国立生物技术中心NCBI数据库中查找到的编号为NM012678.1的TPM4基因mRNA序列。NCBI的GENE数据库用于设计TPM4的siRNA序列，然后在培养的PC12系统中(高糖培养基加10%FBS)检测siRNA对TPM4表达的作用。
PC12细胞培养系统用于确定TPM4下调对片段活性的作用。Lipo2000 转染随机序列用作对照。PC12细胞和siRNA转染的PC12西北培养于6孔细胞培养板的DMEM/F-12中，并添加10%FBS和1%的青霉素-链霉素。细胞培养于37 ℃，饱和湿度，体积分数5%CO2，95%的空气条件下，隔天更换培养液。正常组，单纯脂质体组，siRNA sh-SCR组和siRNA干扰组都分别加入50，80，100 nmol/L的干扰siRNA。
所有实验操作均严格遵循RNA操作原则并遵照Lipofectamine® Reagent kit(Invitrogen, USA, Lot NO.791053)的说明书进行。
对数生长期的细胞被接种于6孔细胞培养板中，转染前1 d将原培养液更换为不含抗菌素的DMEM/F12。细胞长满60%-50%时推荐进行以下操作：①在Opti-MEM®培养液和Opti-MEM®培养液中稀释4份Lipofectamine® Reagent，混合液与Lipofectamine® 2000 Reagent 的体积比为1 000∶5。②将DNA在Opti-MEM®培养液中(无血清OPTI-MEM培养液，且要达到要求的浓度)稀释。③将稀释的DNA加入稀释的Lipofectamine® 2000 Reagent(体积比为1∶1)。④将1滴Lipofectaine® 2000 Reagent和1滴siRNA复合物混合后加入细胞培养体系中，然后在37 ℃，饱和湿度，体积分数95%空气下孵育细胞。细胞培养6 h后，细胞培养液更换为新鲜的包含体积分数10%FBS的全培养液。培养48 h后对每组细胞和突起的数目进行分析。实验重复次数不少于1次。
5.4.3 MTT分析 将细胞接种于96孔细胞培养板，接种密度为104/孔，每孔接种125 μL，细胞生长过夜。在每个时间点的末期，加入20 μL质量浓度为5 g/L的MTT (Sigma，St. Louis，MO)作用10 min，在570 nm波长处确定吸光度。每次实验均重复3次。最后，PC12细胞系统中剩余足够的siRNA用于后续的统计学分析。
6 研究设计 Study protocol
6.1 研究设计概要 蛋白水平、基因水平的基础实验。
6.2 实验计划 实验计划解决2个问题：①明确TPM4在大鼠脊髓全横断损伤中的作用；②阐明其作用的可能分子机制。技术难点在于解决TMP4基因敲除所需要的慢病毒体外重组体SiRNA干扰技术。
6.3 实验步骤
(1)建立大鼠脊髓全横断损伤模型。
(2)采用2-DE双向电泳方法、氨基酸系列分析、q-PCR和Western-Blot、免疫荧光染色等方法研究TPM4在脊髓横断损伤大鼠表达变化。
(3)用体外慢病毒重组体SiRNA干扰技术方法敲除TPM4。
(4)通过BBB评分法评估TPM4敲除对脊髓全横断损伤大鼠运动功能恢复的作用。
(5)研究TPM4敲除对体外培养的脊髓神经元树突生长长度的作用。
6.4 实验动物脱落情况 在手术及实验过程中有死亡脱落者，分析原因，另外重做实验补足动物数量。
6.5 技术路线图 见图1。
7 指标与观察 Outcome measurement
7.1 主要观察指标 ①TPM4蛋白及mRNA的表达变化，包括2-DE双向电泳、氨基酸系列分析、q-PCR和Western-Blot及免疫荧光染色实验结果；②TPM4敲除后体外培养的脊髓神经元树突生长长度变化。
7.2 次要观察指标 BBB评分结果，0分代表完全瘫痪，21分代表功能正常。
7.3 实验观察指标一览表 见表1。
表1 数据观察记录表
Table 1 Schedule for outcome assessment
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|
项目
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假手术组
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术后3 d组
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术后14 d组
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术后28 d组
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2-DE双向电泳
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√
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√
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√
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√
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氨基酸系列
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√
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√
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√
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√
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q-PCR
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√
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Western-Blot
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√
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√
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免疫荧光染色
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√
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√
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√
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√
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8 统计方法 Statistical analysis
8.1 研究假设 所有假设检验均为双侧检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。
8.2 样本量 根据预实验结果每组大鼠的数量定为10只。
8.3 实验分析 应用SPSS 17.0统计学软件完成数据统计分析，计量资料(包括TPM4蛋白及mRNA的表达、神经元树突长度及BBB评分)用x±s表示，所有实验数据都采用ANOVA进行分析。
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文题释义：
原肌球蛋白：相对分子质量为64 000，以大量异构体形式广泛分布于各种真核细胞中，最常见于骨骼肌细胞内，是肌动蛋白结合蛋白的一种。原肌球蛋白与肌动蛋白结合，位于肌动蛋白双螺旋的沟中，主要作用是加强和稳定肌动蛋白丝，抑制肌动蛋白和肌球蛋白结合，哺乳动物中的4个原肌球蛋白基因已被确认，分别命名为TPM1，TPM2，TPM3，TPM4。
原肌球蛋白4(TPM4)的功能：TPM4有稳定F-肌动纤维的作用，在肌肉收缩的调节中发挥重要的作用。此外，TPM4作为一种仅次于其它细胞骨架肌动蛋白的一种有趣的候选蛋白，可在未成熟的神经元中调节转录，并与肌肉相关。TPM4的表达也在肿瘤中和神经系统被发现，不仅如此，据报道TPM4与神经轴突的生长和突触可塑性相关。
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文题释义：
原肌球蛋白：相对分子质量为64 000，以大量异构体形式广泛分布于各种真核细胞中，最常见于骨骼肌细胞内，是肌动蛋白结合蛋白的一种。原肌球蛋白与肌动蛋白结合，位于肌动蛋白双螺旋的沟中，主要作用是加强和稳定肌动蛋白丝，抑制肌动蛋白和肌球蛋白结合，哺乳动物中的4个原肌球蛋白基因已被确认，分别命名为TPM1，TPM2，TPM3，TPM4。
原肌球蛋白4(TPM4)的功能：TPM4有稳定F-肌动纤维的作用，在肌肉收缩的调节中发挥重要的作用。此外，TPM4作为一种仅次于其它细胞骨架肌动蛋白的一种有趣的候选蛋白，可在未成熟的神经元中调节转录，并与肌肉相关。TPM4的表达也在肿瘤中和神经系统被发现，不仅如此，据报道TPM4与神经轴突的生长和突触可塑性相关。