1.1 设计 单一样本观察。
1.2 时间及地点 实验于2012年2月至2014年8月在解放军兰州军区乌鲁木齐总医院完成。
1.3 材料
菌株:收集2012年2月至 2014年8月分离自解放军兰州军区乌鲁木齐总医院烧伤病房53株临床金黄色葡萄球菌菌株。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准对照菌株NCTC 10442 (SCCmecⅠ)、 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 N315 (SCCmec Ⅱ)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 85/2082(SCCmec Ⅲ)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 JCSC4744(SCCmec Ⅳ)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 WZ153(SCCmec Ⅴ)由温州医科大学第一附属医院余方友教授提供[4]。
主要仪器及试剂:Bio-Rad 系列的PCR仪、凝胶成像仪及凝胶电泳仪(美国,Bio-rad); VITAK-2 Compact微生物分析仪(法国,梅里埃);TSB培养基(英国,OXOID);细菌基因组提取试剂盒(中国,北京天根);溶菌酶、溶葡萄球菌素(美国,Sigma)。
引物:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌鉴定引物、SCCmec分型引物、 spa分型引物和MLST分型引物见
表1[1],由北京鼎国合成。
1.4 实验方法
1.4.1 细菌纯化培养 细菌常规分离培养按《全国临床检验操作规程》进行培养进行;样本来源包括:静脉导管、创面分泌物、脓液、全血。VITEK2-Compact微生物分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌后,挑取单菌落放置冻存管-80 ℃冻存备用。
1.4.2 基因组提取 取37 ℃过夜TSB液体培养基培养金黄色葡萄球菌产物1mL,离心后取菌体沉淀,用溶菌酶(终浓度20 mg/L)溶葡萄球菌素(终浓度10 mg/L)消化,随后按细菌基因组提取试剂盒说明操作提取基因组,-20 ℃保存备用。
1.4.3 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌鉴定 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌鉴定参照文献[1],以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 N315和ATCC25923为鉴定对照菌,若mecA与femB阳性判为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;若mecA阴性,femB阳性则判为甲氧西林敏感型金葡菌(MSSA);同时对每株菌进行头孢西丁筛选实验,根据CLSI规定判定阳性者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
1.4.4 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株SCCmec分型 利用针对SCCmec耐药岛设计的4对特异性引物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型的SCCmec分型,未检测出特异条带或检出结果不符合判定标准的则定义为未定型别(non-typeable,NT)[1]。对照菌株为NCTC 10442、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 N315、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 85/2082、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌JCSC4744和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 WZ153。
1.4.5 spa 分型 PCR扩增金葡菌spa基因的可变区X区,产物经纯化后送北京鼎国测序,获得的序列提交spa基因分型数据库(http://www.ridom.de/spaserver)进行比对,获得每株金葡菌spa型别[1]。
1.4.6 MLST分型 PCR扩增金黄色葡萄球菌7个看家基因(arcc,aroe,glp,gmk,pta,tpi,yqil),扩增产物纯化后送北京鼎国测序,获得的序列提交金黄色葡萄球菌MLST分型数据库(http://saureus.mlst.net/)进行比对,获得每株金葡菌的ST型别[1]。
1.4.7 药敏实验 药敏实验采用生物梅里埃VITAK-2 Compact全自动微生物分析仪,使用AST-GP67药敏卡对万古霉素等17种抗生素进行药敏测定,以耐药(R)、中介(I)、敏感(S)表示。
1.5 主要观察指标 ①耐甲氧西林金黄色葡萄球菌鉴定;②耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子分型;③药敏实验分析。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程