血竭对组织工程皮肤移植模型大鼠创伤修复的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.008

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
血竭：又名麒麟竭，为棕榈科植物麒麟竭果实渗出的树脂经加工制成。具有活血定痛，止血，生肌敛疮的功效。主治跌打损伤、瘀血肿痛、金疮出血、溃疡不敛等。其药理活性表现为抗炎、止痛，以及活血与止血的双向调节作用等方面。
组织工程皮肤：是一种较为完善的组织工程化组织，是通过在体外大量培养和扩增功能细胞，将其与细胞外基质及支架材料互相作用，制成的具有生物活性的人工皮肤替代物。组织工程皮肤为皮肤创伤的修复、皮肤功能的重塑提供了新的策略。

摘要
背景：研究显示，血竭治疗皮肤压疮、烧烫伤、溃疡等具有显著疗效。
目的：观察血竭对组织工程皮肤移植大鼠血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子、神经肽P物质和羟脯氨酸的影响，验证血竭促进组织工程皮肤修复创面的作用。
方法：制备组织工程皮肤移植大鼠模型，将大鼠随机分为模型对照组、血竭外用组、血竭内服组、血竭外用加内服组，治疗组分别采用药物外敷、单纯口服[0.1 g/(kg•d)]、外敷加口服治疗，7 d后检测皮肤组织中血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子、P物质和羟脯氨酸的表达。
结果与结论：①与模型对照组比较，血竭治疗组皮肤组织中血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子和羟脯氨酸表达水平显著提高(P < 0.01或P < 0.05)，P物质含量无改变(P > 0.05)。②结果说明，血竭可通过上调组织工程皮肤移植模型大鼠血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子和羟脯氨酸的表达，促进组织工程皮肤对创面的修复作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-4723-3288(俞琦)

关键词: 组织构建, 组织工程, 血竭, 皮肤创伤, 创伤修复作用, 血管内皮细胞生长因子, 表皮生长因子, P物质, 羟脯氨酸

Abstract:

BACKGROUND: Increasing evidence suggests that Sanguis draxonis is of great significance for treating pressure sores, burns and ulcers.
OBJECTIVE: To observe the influences of Sanguis draxonis on vascular endothelial growth factor, epidermal growth factor, substance P and hydroxyproline in rats undergoing tissue-engineered skin transplantation and to verify its promotion of wound repair.
METHODS: The tissue-engineered skin transplantation model of rats were established. Rats in treatment groups were given external application, single oral use of 0.1 g/(kg•d) Sanguis draxonis and combined use, respectively. No treatment was given in control group. After continuous treatment for 7 days, the expression levels of vascular endothelial growth factor, epidermal growth factor, substance P and hydroxyproline in skin tissue were determined.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the levels of vascular endothelial growth factor, epidermal growth factor, and hydroxyproline were significantly increased (P < 0.05 or P < 0.01), while substance P had no change in the treatment groups (P > 0.05). These results demonstrate that Sanguis draxonis can promote tissue-engineered skin to repair skin wound by upregulating the expression levels of vascular endothelial growth factor, epidermal growth factor, and hydroxyproline.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Drugs, Chinese Herbal, Skin, Transplantation

中图分类号:

R318

俞琦，王文佳，王平. 血竭对组织工程皮肤移植模型大鼠创伤修复的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(37): 5524-5529.

Yu Qi, Wang Wen-jia, Wang Ping. Effects of Sanguis draxonis on wound healing in rat models of tissue-engineered skin transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(37): 5524-5529.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年9月至2015年4月在贵阳中医学院形态实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物新生SD乳鼠2只，SPF级雄性成年SD大鼠24只，体质量(200±20) g，由华中科技大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2010-0009。

1.3.2 药物血竭粉购自北京同仁堂(毫州)饮片有限公司(批号：000203164)。

1.3.3 试剂与仪器角质细胞无血清培养基、DMEM(美国Gibco公司)，中性蛋白酶Ⅱ(DiseaseⅡ)、胰酶、EDTA，均购自美国R&D公司，硫酸链霉素、氨苄青霉素(华北制药股份有限公司)，胶原蛋白海绵(广州创尔生物技术有限公司)，戊巴比妥钠(德国Merck公司)，大鼠血管内皮细胞生长因子抗体、表皮生长因子抗体(英国Abcam 公司)，免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，P物质ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)、羟脯氨酸检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；高速低温离心机5804D(德国Eppendorf公司)，细胞培养箱(新加坡ESCO公司)，ELX800全自动酶标仪(美国BioTek公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 角质形成细胞培养无菌取乳鼠背部皮肤，参照文献[12]，制成0.5 cm×0.5 cm大小皮片，放入0.25%中性蛋白酶Ⅱ中18-20 h后，剥取表皮层移入含有0.25%胰酶和0.02% EDTA的消化液中，室温孵育15 min，加胰酶抑制剂终止消化。过滤、离心，收集细胞，加入角质细胞无血清培养基，调整细胞浓度为2×10⁹ L^-1，置 37 ℃细胞培养箱培养。

1.4.2 成纤维细胞培养参照文献[13]将皮片放入消化液，37 ℃水浴震荡2 h，轻轻剥除表皮，将真皮片铺于培养皿底壁，加培养液进行培养，待细胞覆盖培养皿底壁约70%时，取出真皮片，加入混合消化液消化后，离心细胞悬液，调整细胞浓度为2×10⁹L^-1。

1.4.3 组织工程皮肤的构建参照文献[14]方法，将胶原海绵依次放入紫外线交联仪和0.25%戊二醛中交联，将成纤维细胞以2×10⁹L^-1 细胞浓度接种于胶原海绵上，培养7 d后翻转，同样以2×10⁹L^-1细胞浓度接种角质形成细胞，继续培养3-5 d后移至气液界面，7 d后获得组织工程皮肤。

1.4.4 动物造模与分组 SD大鼠24只，造模前以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量35-50 mg/kg。俯卧位固定四肢，备皮，常规消毒，沿背部正中线左右距脊柱0.5 cm处各开直径1.5 cm的圆形创面，深达肌筋膜，将组织工程皮肤轻轻覆盖到全层皮肤缺损面，缝合创面，无菌敷料加压包扎固定，单笼饲养。术后2 d拆除敷料，将动物随机分为4组，每组6只，分别为模型对照组、血竭外用组、血竭内服组、血竭外用加内服组。治疗7 d后取材。

1.4.5 给药方法血竭外用组以血竭粉外敷，隔天换药；血竭内服组按0.1 g/(kg•d)灌胃；血竭外用加内服组按以上方法外敷加内服；模型对照组不用药。

1.4.6 皮肤创面组织的病理学检查大体观察各组动物移植皮肤的愈合情况，治疗结束后24 h，处死大鼠，剪下移植处皮肤，取材范围包含创缘周围肉芽组织及少许正常皮肤。脊柱左侧标本按常规用40 g/L多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片进行苏木精-伊红染色，镜下观察创面情况。

1.4.7 皮肤组织血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子的表达石蜡切片免疫组织化学染色按SABC法进行，参照试剂盒说明书操作，血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子抗体以1∶200稀释，用PBS替代一抗作为阴性对照，封固后镜下观察。以胞浆(膜)出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。随机选取10个高倍视野，观察每个视野下的阳性细胞数，计算阳性表达率。

1.4.8 羟脯氨酸的测定取少量脊柱右侧皮肤标本，精确称取40 mg放入试管中，用碱水解法测羟脯氨酸含量，依据羟脯氨酸试剂盒说明书进行。

1.4.9 P物质的检测将脊柱右侧剩余皮肤在冰生理盐水中漂洗，滤纸擦干、称质量，用眼科剪剪碎组织块，放入玻璃匀浆管，加生理盐水研磨，制成10%的皮肤组织匀浆。以4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，按试剂盒说明书操作，检测P物质含量。

1.5 主要观察指标各组大鼠移植创面组织病理学改变，血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子的表达，羟脯氨酸和P物质的含量。

1.6 统计学分析应用SPSS17.0软件进行数据分析，计算结果以x(_)±s表示，组间采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

组织工程皮肤在修复创面、减少瘢痕挛缩和增生，重建外观和提高皮肤生理功能等方面具有重要意义^[15]，为烧伤、创伤、溃疡引起的大面积皮肤缺损提供了新的治疗方向，是较理想的皮肤替代物^[16-18]。然而，由于组织工程皮肤存在组成、结构和功能方面与正常皮肤差距较大，创面愈合后组织较薄易破溃等问题，容易导致移植创面修复缓慢，甚至难以存活^[19-20]。血竭作为祖国医学生肌类中药的典型代表，具有活血化瘀、敛创生肌等功效，能促进皮肤愈合，临床治疗皮肤疮疡、烧烫伤、溃破等疗效确切，但尚未应用于组织工程皮肤移植的创伤修复。

皮肤创伤修复是一个复杂而又高度协调的过程，主要包括组织再生、肉芽组织增生和瘢痕形成等3个阶段，各阶段均通过多种化学物质和生长因子的产生和调控而促进伤口的清洁和愈合，多种生长因子除刺激细胞的增殖外，还参与了创面组织的重建^[21]。其中，血管内皮细胞生长因子是血管内皮细胞特异性的生长因子，是一种有效的血管形成诱导剂，有很强的趋化作用和促分化作用，能够促进血管内皮细胞的增殖和迁移，从而刺激新生血管形成^[22-24]。在创伤修复过程中，炎症刺激、低氧或多种细胞因子的调节均可使皮肤角质形成细胞、成纤维细胞等分泌大量血管内皮细胞生长因子，促进伤口愈合^[25]。

表皮生长因子是从颌下腺分离出的一种多肽，对上皮细胞、成纤维细胞、间质细胞及内皮细胞都有促进增殖的作用。表皮生长因子的高表达可诱导创缘结缔组织的收缩，促进表皮生长从而加速组织的新生^[26-28]。

神经肽P物质是介导机体创伤修复中神经调控的重要物质，其在皮肤中主要分布于感觉神经末梢，在神经系统和创伤组织之间起着重要的桥梁作用，通过神经—免疫通路调节伤口愈合过程，发挥扩张血管、诱导免疫应答、促进真皮成纤维细胞和角质细胞生长的作用^[29-31]。

羟脯氨酸是一种非必需氨基酸，是胶原纤维和胶原蛋白中的一种主要而又相对恒定的氨基酸，约占胶原氨基酸总量的13.4 %。在创伤愈合过程中，胶原的合成和分泌是伤口愈合的决定性因素，为创面修复和结缔组织增生提供了所需的基质材料^[32-33]。当胶原蛋白代谢改变时，羟脯氨酸含量会随之发生变化^[34]。因此，皮肤组织中羟脯氨酸的含量可间接反映创伤愈合的情况。

研究结果显示，经血竭治疗1周后的组织工程皮肤移植大鼠模型，其移植皮肤与正常皮肤创面贴合紧密，伤口愈合良好。与模型对照组比较，血竭治疗组皮肤组织血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子表达水平显著提高，提示血竭可通过上调组织中的血管内皮细胞生长因子和表皮生长因子水平，从而促进新生血管的生成，加速表皮生长，增加结缔组织的收缩，使创面快速愈合。在血竭的干预下，组织工程皮肤移植大鼠皮肤组织内的羟脯氨酸含量明显增加，提示血竭可促进皮肤中羟脯氨酸的产生和分泌，从而增加胶原蛋白的合成与沉淀，有利于组织再生和复原。血竭治疗组与模型组皮肤组织P物质含量无差异，表明血竭对创伤的修复作用与P物质的表达无关。另外，研究结果也提示了血竭治疗效果最好的给药方式是外用加内服。

综上所述，血竭可通过上调组织工程皮肤移植大鼠模型血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子和羟脯氨酸的表达水平，进而促进组织工程皮肤对皮肤创伤的修复，这也与血竭活血化瘀、敛创生肌的功效相吻合。研究提出了利用血竭改善组织工程皮肤移植过程中血管化进程慢、存活率低等问题的可能性，其在临床上的实际应用还有待于进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程