不同前负荷条件下去神经平滑肌的应力松弛与膜电流特征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.24.014

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (24): 3588-3594.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.24.014

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

不同前负荷条件下去神经平滑肌的应力松弛与膜电流特征

倪志展1，李洁垚1，张培1，夏莉1，2，叶思琪1，2，Annie Christel Bell1，2，樊守艳3，朴伶华3，陈志斌1，高凌峰2，3，王杨2，3

1海南医学院临床学院，海南省海口市 570102；2海南医学院特殊环境生理学实验室，海南省海口市 571101；3海南医学院生理学教研室，海南省海口市 571101

出版日期:2016-06-10 发布日期:2016-06-10
通讯作者: 王杨，博士，副教授，副研究员，海南医学院特殊环境生理学实验室，海南省海口市 571101
作者简介:倪志展，男，1995年生，上海市人，汉族，海南医学院卓越医师在读生，技术助理，主要参与心血管组织及细胞膜片钳技术工作。
基金资助:
2013年海南省高等学校科学研究项目(Hjkj2013-33)；2014年海南省大学生创新创业训练计划项目(20140111，HYCX2014073)

Preload-induced stress relaxation and membrane current changes in the denervated intact smooth muscle

Ni Zhi-zhan1, Li Jie-yao1, Zhang Pei1, Xia Li1, 2, Ye Si-qi1, 2, Annie Christel Bell1, 2, Fan Shou-yan3, Piao Ling-hua3, Chen Zhi-bin1, Gao Ling-feng2, 3, Wang Yang2, 3

1School of Clinical Medicine, Hainan Medical University, Haikou 571102, Hainan Province, China; 2Laboratory of Offshore Medical Physiology, Hainan Medical University, Haikou 571101, Hainan Province, China; 3Department of Medical Physiology, Hainan Medical University, Haikou 571101, Hainan Province, China

Online:2016-06-10 Published:2016-06-10
Contact: Wang Yang, M.D., Associate professor, Associate researcher, Laboratory of Offshore Medical Physiology, Hainan Medical University, Haikou 571101, Hainan Province, China; Department of Medical Physiology, Hainan Medical University, Haikou 571101, Hainan Province, China
About author:Ni Zhi-zhan, Assistant technician, School of Clinical Medicine, Hainan Medical University, Haikou 571102, Hainan Province, China
Supported by:
the Major Scientific Research Project of Hannan Provincial Higher Education Schools in 2013, No. Hjkj2013-33; the Training Program of Innovation and Entrepreneurship for Undergraduates of Hannan Province in 2014, No. 20140111, HYCX2014073

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
被动张力：肌丝标本受牵拉而引起的回缩现象。被动张力与肌丝标本的结构蛋白以及肌细胞外基质成分的关系更为密切；不同程度牵拉，即受负荷程度的不同会导致回缩曲线的不同；不同离子浓度环境下的回缩特性也有所不同。
细胞膜电流：肌细胞膜电位反映了肌丝标本兴奋性的变化，使用膜片钳技术可观察及记录到不同负荷状态下的肌丝膜电位变化；不同离子环境下肌丝，膜电位变化也有所不同，特别是钙离子浓度对牵拉肌丝膜电流变化影响尤为显著。

摘要
背景：肌丝牵拉实验是检验去神经后的肌丝标本在不同受力负荷状态下的肌肉自身力学变化的实验方法。
目的：探讨不同前负荷平滑肌组织在肌动图上产生的自主性舒缩波形特点以及自主性舒缩时的膜电流特点。
方法：平滑肌肌丝取自昆明小鼠主动脉平滑肌层及膀胱壁肌层。肌丝标本松弛状态下在任氏液中稳定 5 min后将两端固定，微量步进定位器调整标本长度，使前负荷至1 g。以此作为标本初长度(L0)。微量器快速牵拉标本1次(L0+1)即低前负荷，每间隔5min快速牵拉标本1次，第10次为高负荷(L0+10)，在快速牵拉前滴加3%CaCl2及0.05% Nitrendipine干预，观察L0+1及L0+10后标本的自主舒缩。制备2 μm玻璃微电极，显微镜下贴附平滑肌组织并高阻封接，测量L0+1及L0+10两种前负荷后应力松弛时间相的膜电位变化。
结果与结论：①平滑肌标本应力松弛期随前负荷上升而变短，且膀胱平滑肌张力松弛期短于主动脉平滑肌，显示两种组织在顺应性上存在差异；②应力松弛期自主舒缩幅度随前负荷的增加而加大；③主动脉平滑肌膜电流波动随前负荷的增加而显著；④高钙环境显著提高了主动脉平滑肌膜电流的幅度及频率，这可被L-型钙通道阻断剂(0.05% Nitrendipine)抑制而减弱；⑤结果提示，前负荷的增长会引起应力松弛期肌源性自主收缩加强，这种顺应性变化与机械性牵拉引起的跨膜离子流动有关。高负荷状态下的高钙环境引起平滑肌膜电流的加强，这种变化可被L-型钙通道阻断剂所抑制。从而说明快速牵拉不仅直接作用于平滑肌机械门控通道，同时也影响到L-型钙通道的激活。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-4512-1821(倪志展)

关键词: 组织构建, 组织工程, 去神经平滑肌, 快速牵拉, 高负荷状态, 自主性舒缩, 膜电流

Abstract:

BACKGROUND: Muscle stretch test is a method for testing mechanical properties of denervated muscle under diverse loads.
OBJECTIVE: To observe changes of spontaneous tension wave in myography and membrane electric current in aorta smooth muscle samples under several preload conditions.
METHODS: Denervated intact smooth muscle samples were taken from the Kunming mouse aorta and urinary bladder wall. Smooth muscle samples were fixed on a micro positioning device and the first stretch was induced for a passive tension up to 1 g, this position was determined as the initial length (L0). Intermittently, with increasing sample length from L0 every 5 minutes, the 1st and 10th stretch were recorded as low- (L0+1) and high-preload (L0+10). 3% CaCl2 and 0.05% nitrendipine were dropped on the samples before L0+1 and L0+10 stretch were recorded. Membrane current changes were evaluated by glass microelectrodes and MultiClamp 700B Amplifier and pClamp 10 analyzer software. The membrane current changes after L0+1 and L0+10 were analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: Prolonged stress relaxation phase was shortened with increasing preload in smooth muscle preparations. The stress relaxation phase in smooth muscle samples from urinary bladder wall was shorter than aorta samples. It was revealed that there were compliance differences between two kinds of smooth muscle samples. In aorta samples, myogenic spontaneous contraction amplitude during stress relaxation and membrane current were significantly increased with increasing preload. Increased amplitude and frequency of membrane current in aorta smooth muscle samples under high calcium concentration (3% CaCl2) were inhibited by L-type calcium channel blockade (0.05% nitrendipine). Collectively, increased preload in smooth muscle samples induced a directly decrease of compliance with an enlargement of myogenic spontaneous contraction amplitude. It appeared vital in particular in aorta samples. Membrane current significantly enhanced in spontaneous contraction period suggested the mechanical stretching ionic inward flow involved in this period. Membrane current amplitude was increased by high-preload under elevated calcium conditions; however, this change was suppressed by L-type calcium channel blockade. This study indicates quick stretching influences not only mechanically-gated channels in smooth muscle, but also the activation of L-type calcium channel.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Muscle, Smooth, Denervation, Stress, Mechanical

中图分类号:

R318

倪志展，李洁垚，张培，夏莉，叶思琪，Annie Christel Bell，樊守艳，朴伶华，陈志斌，高凌峰，王杨. 不同前负荷条件下去神经平滑肌的应力松弛与膜电流特征[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(24): 3588-3594.

Ni Zhi-zhan, Li Jie-yao, Zhang Pei, Xia Li, Ye Si-qi, Annie Christel Bell, Fan Shou-yan, Piao Ling-hua, Chen Zhi-bin, Gao Ling-feng, Wang Yang. Preload-induced stress relaxation and membrane current changes in the denervated intact smooth muscle[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(24): 3588-3594.

图/表（结果） 2

2.1 平滑肌标本前负荷任氏液预处理后主动脉血管环标本固定于钩具间，微调标本长度并使初始前负荷上升至1g，此时为肌丝初长度(L₀；图2A)。瞬间牵拉主动脉血管环标本(+0.5 mm，L₀₊₁)时，前负荷快速上升相(PT)表现为瞬间上升，及随后的应力松弛期(SR phase)，期中的肌源性舒缩幅度显著，应力松弛时程较长，如图2B所示。10次牵拉后钩具间距加大，前负荷快速上升相(PT)、肌源性舒缩幅度增大，应力松弛时程显著延长(图2C)。

为比较不同平滑肌组织间的不同，以上述相同条件快速牵拉排尿肌丝，在L₀₊₁₀及L₀₊₁₀两种不同前负荷状态时的肌源性舒缩幅度均小于主动脉标本，而应力松弛时程在两种前负荷状态时则均长于主动脉标本(图2D，E)。

滴加3%CaCl₂的高钙溶液干预标本(任氏液+ 3%CaCl₂)后与任氏液组相比，在L₀₊₁及L₀₊₁₀阶段表现各有不同(表1)，具体表现为：① L₀₊₁快速牵拉阶段前负荷快速上升相(PT)幅度显著高于相同牵拉阶段的任氏液组，应力松弛期间的肌源性舒缩幅度增大但无统计学差异；应力松弛时程显著长于任氏液组。②L₀₊₁₀快速牵拉阶段前负荷快速上升相(PT)幅度显著高于相同牵拉阶段的任氏液组，应力松弛期间的肌源性舒缩幅度显著增大，应力松弛时程无显著变化(图3A，B)。

滴加0.05% Nitrendipine干预后的L₀₊₁及L₀₊₁₀状态时前负荷快速上升相(PT)幅度、肌源性舒缩幅度均低于高钙溶液干预组(图3C，D)。

2.2 平滑肌细胞膜电流变化特点玻璃微电极在贴细胞膜之前，首先进入PBS(pH 7.4)，此时记录到玻璃微电极的第1次电变化，当玻璃微电极尖端接触并贴附至主动脉平滑肌细胞膜并形成密闭封接状态时，可记录到第2次电变化，调整电极电容补偿后可记录到较为稳定的电流信号。当玻璃微电极尖端接触并贴附至任氏液预处理后的主动脉平滑肌标本时(处于L₀状态)在获得较稳定电信号后，一次L₀₊₁快速牵拉可引起内向电流的增加(图4A)，L₀₊₁₀状态的内向电流变化更加显著(图4B)，提示机械门控离子通道参与了应力松弛期的正电荷离子的跨膜离子流动。

滴加3%CaCl₂干预而处于高钙环境下的主动脉平滑肌标本在L₀₊₁₀状态时的膜电流变化幅度及频率均显著增长(图4C)，显示在高度前负荷状态下的应力松弛初期钙离子通道更加活跃。而0.05% Nitrendipine干预显著降低了该阶段的膜电流变化幅度及频率(图4D)。它表明处于高度前负荷的主动脉平滑肌在应力松弛阶段的自主性舒缩除了与机械门控离子通道有关外还与L-型钙通道的激活及失活关系密切。

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引言

去神经后的平滑肌组织在快速牵拉引起肌丝前负荷的瞬间上升后会出现应力松弛，应力松弛过程中会产生自主性张力变化也即肌源性收缩和舒张，这其中的自主性张力变化与平滑肌所承受的前负荷状态组织外液的离子变化关系密切^[1]。平滑肌组织前负荷可通过张力换能器经信号转换获取肌动波形，即时地记录到在应力舒张过程中的肌源性自主性舒张变化，进而解读不同静态超负荷下的信号转导蛋白调节特点^[2-3]。

机械牵拉在肌动波形上表现为受快速牵拉时的前负荷快速上升相(preload tension phase，PT)以及随后的应力松弛相(stress relaxation phase，SR Phase)应力松弛曲线最终在记录仪上表现为回归基线^[4]。张力换能器及BL420S系统还能够即时反映不同前负荷时的前负荷快速上升相(PT)相及应力松弛相(SR)相这一时期的时程(tension strain time，TST)变化^[5-7]，这些参数为研究去神经平滑肌组织在不同负荷状态下的细胞信号转导表达及组织学变化提供了可能。

应力松弛期的自主张力变化是反映前负荷变化时平滑肌组织顺应性的重要指标^[8-9]。平滑肌作为一种黏弹性体，通过顺应、蠕变、应力松弛、滞后等黏弹性特性来适应高负荷状态，通过改变顺应性而满足高负荷后的生理功能。这一高负荷过程的改变同时也激发了细胞信号转导的调控机制，并通过基因调控而调节平滑肌蛋白表达进而完成平滑肌组织的重建^[9-10]。钙离子作为平滑肌细胞内信号调节系统中的第二信使，参与了自主性收缩及长时间负高负荷后的组织重建。钙离子既是决定平滑肌细胞膜兴奋性的离子流，也是平滑肌兴奋-收缩偶联的主要决定因素^[11]。胞浆Ca²⁺(以[Ca²⁺]i表示)在平滑肌性器官如弹性储器血管收缩过程中起着极为重要的“第二信使”作用主要表现在：与细胞外液其他离子协同通过借助非选择性Na⁺，Ca²⁺通道参与了平滑肌组织的钙触发-钙释放机制。[Ca²⁺]i浓度变化可引发是细胞跨细胞膜转运和细胞内贮钙池(ER/SR)摄取、释放钙等过程的平衡。增加前负荷时应力松弛期的肌源性舒缩肌细胞的收缩活动依赖于[Ca²⁺]i的浓度并与[Ca²⁺]_e的钙瞬变(Ca²⁺ transient)有关。

文章通过观察去神经后的平滑肌组织在不同前负荷状态下的应力松弛期中的变化以及由此产生的膜电流变化，了解不同前负荷导致的平滑肌顺应性变化特点及其中的离子跨膜流动因素。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计实验采用离体平滑肌肌丝标本，任氏液(Ringer’s solution)中稳定5 min后固定于金属钩具上，微量定位仪沿标本长轴方向瞬间增加肌丝长度，BL-420S信号记录仪记录肌丝标本快速牵拉后的前负荷变化以及随后的应力松弛变化曲线。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至2015年6月间在海南医学院特殊环境生理学实验室完成。

1.3 材料昆明小鼠4周龄10只，雌雄不限，购自海南省药物安全性评价研究中心。

1.4 方法

1.4.1 平滑肌肌丝标本制备及预处理昆明小鼠采用颈椎分离法处死后迅速取主动脉血管升支段及膀胱于室温下入任氏液。双目解剖显微镜(PXS-2040型，上海光学仪器厂，中国上海)下清理主动脉外部结缔组织及剥离内膜仅留0.5 mm宽的主动脉平滑肌层；作为不同平滑肌组织间标本对照，同时制备了膀胱平滑肌，方法是沿膀胱出口纵向剪切膀胱壁全层后剥离内膜层仅留平滑肌层并制作0.5 mm宽肌丝。每只小鼠制备出主动脉肌丝及膀胱肌丝标本各3份并置于恒温浴槽(37 ℃)中任氏液备用。

1.4.2 肌丝标本前负荷定量及张力测定系统肌丝标本快速牵拉及限位系统由离体组织器官恒温灌流系统(SV-4微分定位仪，成都泰盟科技有限公司，中国成都)、张力换能器(JZ-100型10 g，北京航天医学工程研究所制造，中国北京)及铸铁稳定架组成，该系统置于隔振平台(DST10-08，江西连胜实验装备有限公司，江西上饶)以避免环境干扰。前负荷信号收集及测量由BL-420S生物信号采集处理系统、BL-420S生物机能实验系统软件(TM_WAVE，Ver 2.1，成都泰盟软件有限公司，中国成都)及台式计算机构成。张力换能器测量范围及参数如下：负荷测量范围0-10 g，非线性≤ 0.5%F.S，迟滞≤0.5%F.S；重复性≤ 0.5%F.S；零位漂移≤ 0.5%h.F.S。

1.4.3 加载肌丝标本前负荷将主动脉血管环或膀胱排尿肌丝标本两端分别直接固定于两金属钩具上(图1A)。调整微分定位仪使排尿肌标本首先保持松弛状态，滴加任氏液200 μL稳定5 min。为消除重力对标本长轴方向负荷的影响，肌丝水平放置，定位仪微量牵拉肌丝至BL-420S系统记录到受力为1 g，此时标本悬浮于载玻片任氏液中(酶标笔于载玻片上相应位置作圆圈标记，防止液体溢流)，其肌丝度为初长度(L₀)。稳定5 min后再次快速旋转定位仪5个刻度，标本在初长度的基础上沿标本长轴再次被动拉长一次(+0.5 mm，L₀₊₁)。定位仪每快速旋转5个刻度，两钩具间距则瞬间增加0.5 mm(以+ 0.5 mm表示)。BL-420S系统记录肌丝的前负荷(PT)及随后应力松弛曲线，每5 min逐次拉长标本，记录并计算L₀₊₁及L0+10前负荷状态下应力松弛期的最大肌源性舒缩幅度(Myogenic contraction and relaxation amplitude，MC amplitude)以及应力松弛时程(TST)。

另外肌丝在快速牵拉前滴加3%CaCl₂及0.05% Nitrendipine干预，依上述步骤操作记录并计算L₀₊₁及L₀₊₁₀前负荷状态时的应力松弛期指标。

1.4.4 主动脉平滑肌标本膜电位变化测定拉制硬质玻璃微管尖端呈直径约为2 μm的玻璃微电极并抛光仪处理，电极充灌电极内液(KCl溶液0.03 mol/L)作为导电介质。显微镜下玻璃微电极贴附平滑肌标本并高阻封接(图1B)，观察细胞膜电位变化。当主动脉平滑肌处于两种前负荷(L₀₊₁及L₀₊₁₀)状态时分别观察各前负荷时的膜电流变化。玻璃微电极与微电极放大器连接(MultiClamp 700B Amplifier，Axon Instruments / Molecular Devices Corporation，CA，USA)，pClamp 10分析软件(Molecular Devices Corporation，Orleans Drive Sunnyvale，USA)获取并分析膜电流变化。

1.5 主要观察指标 ①观察肌丝标本前负荷状态时的张力，即：肌丝初长度(L₀)、1次被动牵拉(L₀₊₁)及10次(L₀₊₁₀)时的快速上升相(PT)，随后的应力松弛期(SR phase)及应力松弛时程。②观察肌丝标本处于两种前负荷(L₀₊₁及L₀₊₁₀)状态时的膜电流变化。

1.6 统计学分析应用Microsoft Excel 2010(Ver.14.0)软件处理，student t 检验比较标本的组间差异显著性。

讨论

实验通过观察去神经后的平滑肌标本在高负荷状态下的应力松弛期以及其间发生的肌源型自主舒缩，了解负荷产生后主动脉平滑肌膜电流产生特点以及平滑肌被动张力的顺应性变化。实验显示在高度前负荷的L₀₊₁₀阶段主动脉平滑肌的应力松弛期显著短于低负荷阶段，显示主动脉在其顺应性上受前负荷的影响，高度前负荷导致主动脉平滑肌顺应性的下降。在比较不同平滑肌组织的L₀₊₁₀相对于L₀₊₁的应力松弛期长度(L₀₊₁₀时应力松弛相与L₀₊₁时应力松弛相比值)可发现高度前负荷时的动脉平滑肌顺应性下降幅度显著大于膀胱平滑肌。

平滑肌组织具有较强的延展性，静态负荷的增加可通过细胞内的包括第二信使途径的信号转导^[12-13]，进而提高平滑肌细胞适应负荷过程中的DNA复制^[14-16]，而实现超负荷状态下的组织重建。有报道显示细胞培养环境下1-24 h的机械性牵拉会导致平滑肌抑制性SOCS家族蛋白信号表达变化及细胞骨架蛋白表达的增加^[17-18]。钙离子作为细胞信号转导中重要的第二信使，在重建中起着重要作用。此次实验的高负荷改变而出现的持续性肌源自主舒缩，证明了跨膜离子流动与组织适应及组织重建的密切关系。而实验中的高钙溶液及L-型钙离子通道阻断剂干预实验则显示钙离子通过参与肌源型自主收缩，进而作为细胞内的第二信使影响平滑肌组织适应及组织重建。

对高负荷状态时的跨膜电流测量显示，高钙溶液干预可改变平滑肌细胞膜的正离子的通透性从而提高了膜电流的改变而在膜电流变化上体现为幅度及频率的增加。L-型钙离子通道阻断剂干预能显著减弱高负荷状态时的跨膜离子流动，从而证明钙离子流在自主性舒缩活动中以及在高负荷重建中的重要性。

平滑肌受牵拉时，肌丝标本发生体应变而产生的瞬时前负荷快速上升相(PT)^[19-20]，其上升支主要反映了平滑肌结构蛋白分子参与的力学特性；下降支则反映了平滑肌的应力松弛状态，反映了平滑肌组织黏弹性特征。实验中平滑肌所承受的静态负荷的特点是标本牵拉至L₀₊₅及L₀₊₁₀阶段时，与L₀₊₁相比Ⅱ期Vib波形变化尤其显著(图2D与C，E与D的Ⅱ期相对比)。静态负荷后的平滑肌细胞膜电变化特点显示，采用显著改变[Ca²⁺]_e浓度的方法可了解高[Ca²⁺]_e环境下肌细胞膜电位变化特点，血管平滑肌细胞的钙电流是影响动作电位过程的重要离子电流，也是大部分药物作用的靶点。在高负荷状态下通道激活及随后的缓慢的失活过程，是由于L-型钙离子与多种离子通道电流参与的结果。对于高度牵拉引起的这一方面的现象有待进一步的探讨。

玻璃微电极尖端横截面积极小，其所能吸附并覆盖平滑肌细胞膜的部分仅存在有限的几个离子通道，通过调整细胞外液中钙离子成分，同时观察玻璃微电极的电流及电位变化可了解离子通道状态的大致情况^[21-23]。实验显示主动脉平滑肌丝为平滑肌及间质纤维蛋白组成的肌性结构，其细胞内质网极不发达。细胞内质网膜ATP酶蛋白含量极少，细胞内Ca²⁺集聚能力弱，因此其AT的产生需借助于平滑肌细胞外Ca²⁺内流^[24]。主动脉平滑肌受被动牵拉时，可引起大量细胞膜机械性门控离子通道开放，引起正离子内流，特别是Ca²⁺内流，而导致标本出现自主性舒缩现象，高钙环境(3% CaCl₂)延长了应力松弛期，降低了平滑肌的顺应性。此外，不同阶段的机械牵拉可引起平滑肌内细胞信号转导因子活性改变^[25-26]，通过基因调控在分子水平调节细胞内蛋白质合成过程，而在细胞水平则引起平滑肌组织结构上的适应性改变。特别是对于负荷变化较为敏感的细胞信号转导因子，如JAK-STAT途径或SOCS家族独立途径调节蛋白表达^[27]。

高负荷状态时的肌动波形较直观地反映了平滑肌组织的瞬时前负荷以及之后的应力松弛期的张力变化，这对于了解平滑肌腔性器官在超负荷状态下的顺应性变化、生理功能及组织重建机制，了解细胞内信号转导及表达在适应性变化中的作用均具有一定的意义，是探讨平滑肌组织由生理代偿性变化向病理失代偿性变化研究的一个有用工具。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

不同前负荷条件下去神经平滑肌的应力松弛与膜电流特征

Preload-induced stress relaxation and membrane current changes in the denervated intact smooth muscle

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