细胞膜片技术在组织工程中的应用与研究进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.017

摘要/Abstract

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文题释义：

细胞膜片技术：细胞膜片技术是通过物理的方法将扩增融合的细胞从培养皿底壁分离，获得膜片状细胞结构的一种技术。与传统胰酶消化收集细胞的方法相比，运用该技术收集到的细胞保留了体外培养过程中分泌的胞外基质、建立的细胞-基质连接以及细胞间连接等结构。

组织工程基本原理：从机体获取少量的活体组织，用特殊的酶或其他方法将细胞(又称种子细胞)从组织中分离出来在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(支架)按一定的比例混合，使细胞黏附在生物材料(支架)上形成细胞-材料复合物；将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的。

背景：细胞膜片技术无须支架材料和酶消化，通过刺激细胞外基质分泌形成致密膜片组织，能有效地修复组织缺损和改善器官功能。

目的：回顾近年来国内外细胞膜片技术应用于组织工程领域的新技术和新进展，为相关基础和临床研究提供新的思路。

方法：由第一作者检索CNKI全文数据库、万方数据库及PubMed数据库2010年1月至2015年7月的相关文献，检索关键词为“细胞膜片，组织工程；cell sheet，tissue engineering”。

结果与结论：与传统细胞膜片技术相比，支架材料与细胞膜片技术相整合用于重建和修复坚韧组织器官，多层细胞膜片相互层叠形成三维组织修复软组织器官等新技术不断涌现。与单层细胞膜片相比，通过相同或不同的细胞片层叠而成的3D细胞膜片具有更强组织再生功能，而且在体外就能构建出理想的靶组织模型。利用支架材料复合细胞膜片技术来提高复合物机械强度和减少细胞流失，并用于牙齿、骨与软骨等机体坚韧组织修复取得较大进展。目前细胞膜片技术仍主要处于实验室研究阶段，临床应用研究不多，期待有更多的创新性手段融入到细胞膜片技术上来。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-6319-723X(周术奎)

关键词: 组织构建, 组织工程, 细胞膜片技术, 再生医学, 血管化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The cell sheet technology that is applied with the absence of scaffolds and enzymatic digestion can effectively repair tissue defects and improve organ function, by stimulating the secretion of extracellular matrix to form a dense membrane tissue.
OBJECTIVE: To review the recent progress in cell sheet technology used in tissue engineering, thereby providing a new idea for relevant basic and clinical research.
METHODS: The first author retrieved CNKI database, Wanfang database and PubMed with the keywords of “cell sheet, tissue engineering” in Chinese and English, respectively. Literature retrieval period was from January 2010 to July 2015.
RESULTS AND CONCLUSION: Cell sheet technology combined with scaffold materials can be used for reconstruction and repair of tissues and organs. With the emerging of new technologies, multi-layer cell sheets are stratified to form a three-dimensional tissue for repair of soft tissues and organs. Compared with the monolayer cell sheet, the three-dimensional cell sheet that is laminated by same or different cell sheets has stronger regenerative ability and can be used to construct the ideal target tissue model in vitro. Cell sheet technology combined with scaffolds can improve the mechanical strength of the composite and reduce cell loss, which has made great progress in the repair of tooth, bone and cartilage tissue. Currently, the cell sheet technology is at the laboratory stage, and little is reported on its clinical applications. We look forward to more innovative technologies that can be integrated into the cell sheet technology.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

周术奎，张楷乐，王营，傅强. 细胞膜片技术在组织工程中的应用与研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(11): 1630-1636.

Zhou Shu-kui, Zhang Kai-le, Wang Ying, Fu Qiang. Application of cell sheet technology in tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(11): 1630-1636.

图/表（结果） 1

2.1 细胞膜片分离技术在目前的文献报道中，多数细胞膜片在特殊培养皿中形成，其中以温度培养皿最常见。研究表明，在温度培养皿中形成的细胞膜片，由于未经过胰酶消化，能完整的保留细胞外基质和细胞间连接，细胞损伤小，早期凋亡率低，移植体内能保留细胞活力达12个月^[3]。

温度培养皿主要由聚N-异丙基丙烯酰胺(poly N-isopropylacrylamide，PIPAAm)材料共价结合于培养皿基底部，在培养温度> 32 ℃时，接种细胞能正常贴壁增殖，而随着温度降低(< 32 ℃)，铺板材料从疏水状态变为亲水状态，细胞膜片也由黏附状态转为解离状态，从而无须酶消化即可获得完整的细胞膜片。然而，这种单纯由PIPAAm材料包被的温度培养皿至少需要 30 min的20 ℃低温条件来获取膜片，可能会影响细胞功能，因而有学者对PIPAAm材料进行相应修饰以缩短膜片分离时间。

Madathil等^[4]利用自由基聚合PIPAAm和甲基丙烯酸组成新型温皿材料，将其包被直径35 mm普通培养皿，60 ℃风干，环氧乙烷灭菌，培养兔角质内皮细胞4周至膜片形成，当从培养皿基底部分离细胞膜片时，依次在10 ℃下保存1 min，20-23 ℃保存5 min即可分离细胞膜片，这种复合材料与传统PIPAAm材料相比，具有分离时间短，获得细胞膜片致密完整的优点。Tang等^[5]将IPAAm单体和PIPAAm大分子单体共同溶于2-异丙醇中并均匀覆盖于聚苯乙烯材料表面，经0.25 MGy电子束辐射后可形成梳状PIPAAm水凝胶，使用该材料包被的培养皿诱导牛主动脉内皮细胞1周即可形成细胞膜片，当培养液温度降低至20 ℃时，细胞膜片脱离速度(25 min)明显快于普通温度培养皿(50 min)，作者推测这种表面修饰提高了PIPAAm材料的亲水性作用，从而导致细胞膜片的快速分离。

除PIPAAm外，近年来新的细胞膜片分离技术不断涌现，具有操作简便，价格低廉的特点，有助于实现细胞膜片的大量获取。Lee等^[6]报道了一种新型的电活性导电聚合物-聚吡咯用于构建复层C2C12细胞膜片，他们利用生物素-链霉亲和素交联剂将聚吡咯偶联于生物素化的骨形态生成蛋白2中，缓释的骨形态发生蛋白具有高效的成骨细胞活性从而诱导C2C12细胞成骨分化，然后将其包被培养皿并常规接种C2C12细胞培养5 d即可成膜，当置于大小约 -0.8 V的电场中作用30 s便可有效地将细胞膜片从培养皿底部完整分离。赖氨酸短肽A6K(Ac-AAAAAAK- NH2)是一种阳离子表面活性剂，由天然氨基酸组成，能够与云母表面阴性极偶联形成单分子疏水膜，吸引细胞黏附和增殖，当细胞生长并融合后，这层疏水膜能被细胞逐渐释放出的蛋白酶所降解，最后露出亲水性的云母表面导致细胞膜片脱落。

Qiu等^[7]将0.2 g/L A6K溶液均匀覆盖于大小约 2.0 cm×1.5 cm云母片表面，然后接种成骨细胞MC3T3-E1置于12孔板中培养，当细胞膜片融合成形且边缘卷起时，无须降低培养液温度，即可用镊子将细胞膜片迅速而完整地撕开，这种细胞膜片分离方式与其他分离技术相比更为简便，且无毒副材料添加，具有高度的生物安全性。另外，Zahn等^[8]报道利用离子溶解技术诱导C2C12成肌细胞膜片分离，他们首先合成聚电解质多层膜并以200 000个/cm²接种C2C12成肌细胞至膜片形成，这种聚电解质多层膜由底层的多聚赖氨酸/透明质酸和上层的纤连蛋白组成，然后在培养基中加入无毒性的多价阳离子-亚铁氰化物以分解破坏聚电解质多层膜，从而引起细胞膜片迅速地从培养皿中脱离。

2.2 细胞膜片与组织工程应用创新

2.2.1 细胞膜片与3D组织构建细胞膜片具有丰富的细胞外基质和紧密的细胞间连接，无须缝合就能较紧密地附着于其他细胞膜片、器官组织、生物材料表面，且靶细胞被外基质固定很少流失，上述特性为以多层细胞膜片复合为基础构建3D组织提供了可能性^[9]。与单层细胞膜片相比，通过相同或不同的细胞片层叠而成的3D细胞膜片具有更强组织再生功能，而且在体外就能构建出理想的靶组织模型，因此在组织工程领域具有广阔的应用前景。

Haraguchi等^[9]利用细胞膜片堆栈技术在自动化流程下体外构建3D组织器官，他们首先用温度培养皿培养细胞膜片，然后用一种活塞式层叠装置转运细胞膜片，这种装置表面涂有水凝胶材料便于吸附细胞膜片，从而快速简便地在体外叠加数层细胞膜片构建各类型组织。Komae等^[10]将人类多能干细胞诱导分化成心肌细胞并培养心肌细胞膜片，然后将3层心肌细胞膜片叠加并植入裸鼠腹股沟处，24 h后再继续叠加3层细胞膜片构建复合膜片状心肌组织，这样间隔地依次叠加方式既可以增加移植膜片厚度，同时有助于细胞膜片新生血管形成和保证其后续营养供给。2周后，移植物连同周围组织及股动静脉一并切除，移植于异体裸鼠颈部，同时行股动静脉与颈动静脉吻合，上述腹股沟移植物及异体异位移植颈部1周均可触及明显搏动并检测到同步电位，从而证实这种单纯依赖细胞膜片构建的3D心肌组织具有治疗心衰的潜在应用价值。

Cerqueira等^[11]构建一种由不同类型细胞膜片复合组成的3D组织工程皮肤，其中皮肤角质形成细胞膜片促移植物表皮形成，皮肤成纤维细胞膜片提供移植物生长基质和微环境，血管内皮细胞膜片则促进移植物新血管生成，将其移植治疗小鼠皮肤全层缺损，移植7 d后即可见组织工程皮肤中血管密度明显增加，14 d后发现皮损创面愈合完整且表皮形成。

Na等^[12]首先提取牙源性干细胞并培养2周成膜，然后将数层重叠形成3D细胞膜片并移植于裸鼠背部皮下，6周后，组织学分析见移植物内部牙髓/牙本质样组织分布，并表达牙本质涎蛋白、碱性磷酸酶、骨唾液蛋白等多种牙髓标志性蛋白，随后重新种植于空洞的牙根管中，可见新的牙髓/牙本质复合物形成，从而为根管治疗提供一种新的方法。

Kawamura等^[13]利用Wnt信号分子诱导多能干细胞向心肌分化并培养成细胞膜片，超顺磁性纳米氧化铁标记，层叠膜片形成复层3D组织，再复合于带蒂大网膜皮瓣表面以保证复层膜片血供，实验共设计为两组，分别为细胞膜片+带蒂大网膜组和单纯细胞膜片组，当移植至心脏8周后，MRI检测发现带蒂细胞膜片存活率(78±10)%较单纯细胞膜片(42±9)%明显更高，两组移植组织内血管内皮生长因子含量分别为(1.94±0.38) μg/L和(1.35±0.26) μg/L。总之，这种无支架材料填入、具有良好的3-D结构的复合细胞膜片有望能进一步加快创面的愈合速度和能力，降低创面愈合时间，对于全层软组织器官修复具有重要意义。

2.2.2 细胞膜片与坚韧组织重建早前多数学者利用干细胞成骨诱导细胞膜片及自体骨膜/软骨细胞构建组织工程骨，然而这种无支架材料支撑的膜片状骨性组织的强度和韧性尚不能满足临床实际需要，易发生塌陷或形变，培养时间长且难以精确控制膜片生长形态，因此有学者利用支架材料复合细胞膜片技术来提高复合物机械强度和减少细胞流失，并用于牙齿、骨与软骨等机体坚韧组织修复取得较大进展。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)由单体乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的高分子有机化合物，具有良好的生物相容性和成膜的性能。

Mouthuy等^[14]利用PLGA制成静电纺丝膜片，同时加入羟磷灰石和胶原蛋白I型以提高组织相容性，人骨髓间充质干细胞在成骨诱导液中诱导培养21 d成膜，温度培养皿收集细胞膜片复合于上述静电纺丝材料中共培养7 d，结果证实该细胞膜片-支架材料复合体表现出钙化软骨特点，机械强度和韧性均较单纯骨髓间充质干细胞明显提高，适用于体内关节软骨重建。

Ueha等^[15]利用磷酸三钙作为基质材料，分别与骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞/成骨诱导细胞膜片复合共培养，观察其成骨情况，并用于兔股骨缺损治疗，移植裸鼠皮下4周后鉴定结果表明磷酸三钙/骨髓间充质干细胞/成骨诱导细胞膜片复合物成骨能力最强，骨密度大，碱性磷酸酶活性高，其抗压刚度约为磷酸三钙/骨髓间充质干细胞复合培养的7倍，并能形成全层骨连接修复股骨缺损。

Qi等^[16]用温度培养基收获了完整的兔骨髓干细胞膜片，以PLGA为支架材料，复合构建组织工程软骨并移植修复兔关节软骨缺损收获满意效果，与骨髓干细胞悬液复合PLGA材料组及单纯PLGA材料组相比，在移植12周检测细胞膜片/PLGA复合物中透明质酸含量显著提高，软骨新生面积达到(84.5±7.6)%，国际软骨修复协会ICRS评分达到(14.1±0.4)。

Liu等^[17]利用牛煅烧骨复合骨髓间充质干细胞膜片构建3D组织工程材料用于修复SD大鼠大面积骨缺损收获满意疗效，体内外结果均证实这种骨/细胞膜片复合物比单纯细胞悬液接种成骨能力更强，骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、OSX、Runx-2等成骨标志物表达水平更高，体内移植8周后micro-CT重建显示颅骨缺损已被完整修复，而单纯细胞悬液接种只见颅骨骨缘有新生骨组织存在，至12周仍未见骨缺损闭合。

Tsumanuma等^[18]将β-磷酸三钙/胶原材料分别与牙周膜细胞膜片、骨髓间充质干细胞膜片和牙骨膜细胞复合后用于牙周再生修复，移植后8周对比观察，牙周膜细胞膜片复合材料无论在牙骨质再生还是牙周韧带修复方面均较其他两种细胞膜片优势明显，而且仅牙周膜细胞膜片材料移植才能观察到神经再生现象，证实自体牙周膜细胞膜片复合β-磷酸三钙/胶原是一种良好的牙周修复组织工程材料。

国内黄辉等^[19]将体外培养扩增的骨髓基质细胞悬液与同一供体来源的富血小板血浆混合，滴加到六孔培养板上，再滴加牛凝血酶溶液，形成凝胶样混合物，后包裹珊瑚支架，植入供体兔颅骨直径15 mm的圆形缺损内，观察16周后发现细胞-膜片/珊瑚组修复兔颅骨缺损效果明显优于单纯珊瑚修复组，在16周时颅骨缺损得到完全的骨修复，与自体骨类似(见图1)。当然，这种组织工程重建方式需要外源性支架材料提供支持，但目前为止仍未发现一种完全理想的支架材料。

2.2.3 细胞膜片技术与组织工程应用新领域细胞膜片技术自诞生以来，在心脏、皮肤、角膜、骨/软骨、牙周、食道等组织工程应用研究报道较多，甚至在心脏、食管和角膜修复方面积累了相应临床经验，取得的相关进展也最为迅速。除此之外，作者也观察到细胞膜片技术应用领域不断拓展，近年来已被应用于某些较少见组织器官修复。

Yaguchi等^[20]利用温度培养皿连续培养新西兰大白兔中耳黏膜细胞2周即可成膜，然后收集自体中耳黏膜细胞膜片以修补中耳炎手术中造成的黏膜缺损和骨暴露，该方法除了能恢复中耳黏膜组织连续性外，还能有效抑制术后肉芽组织生长和骨质增生，减少手术并发症。

Kawanishi等^[21]建立成年雄性Wistar大鼠盲肠烧灼刮伤手术模型，术后将单层腹腔间皮细胞膜片和成纤维细胞膜片组成的复合膜片覆盖于创面，其中间皮细胞膜片在上层，成纤维细胞膜片在下层，免疫组织化学结果证实该复层细胞膜片能有效减少移植处纤维素沉积和巨噬细胞浸润，抑制淋巴管及血管再生，从而防止术后腹腔粘连。相似的是，Kuramoto等^[22]将兔口腔黏膜上皮细胞膜片移植修复子宫内膜缺陷，证实能有效防止子宫损伤后形成的宫腔粘连。另外，有学者研究表明细胞膜片具有修复内分泌腺功能低下的潜在价值。

Sekiya等^[23]利用免疫组织化学分析发现猪肾上皮细胞膜片具有肾小管样结构，且存在类似于自体肾脏的内分泌功能，比如分泌1，25-二羟维生素D3和促红细胞生成素，将其移植至裸鼠背部皮下后，可在裸鼠血清中检测到1，25-二羟维生素D3和促红细胞生成素水平较对照组明显升高。同样，Saito等^[24]发现移植胰岛细胞膜片至糖尿病小鼠背部皮下能反转小鼠高血糖状态至正常水平。

Suzuki等^[25]将细胞膜片技术创新性地应用于构建肿瘤模型，与传统的单纯癌细胞悬液皮下注射成瘤相比，细胞膜片移植成瘤速度更快，同等时间内成瘤体积更大，且细胞排列规则，组织结构清晰，从而为肿瘤研究模型构造提供了新的思路。

国内李剑等^[26]提取白癜风患者正常表皮角质上皮细胞与3T3滋养细胞共培养3周形成细胞膜片，随后移植至患者皮损处，移植后1，3，6，12个月见患者复色面积逐渐扩大，皮肤颜色趋于均匀，且手术部位无自发性脱色及皮疹复发，无感染、水疱等严重不良反应。

2.3 细胞膜片技术缺陷尽管细胞膜片技术具有保持移植细胞活性和无须支架材料等优势，但目前尚存在一些不足之处，首先，单层细胞膜片机械性能欠佳，相对薄弱和易碎，转移和运输较困难，难以直接移植使用，因此有必要使用一定的运载工具辅助转运。其次，细胞膜片培养周期较长，文献报道从7 d-28 d不等，在培养过程中只需换液而不传代，容易污染，细胞膜片形成与细胞状态密切相关，培养过程中难以质量控制，且培养成本较高，难以大规模生产和满足临床应用；最后，单纯细胞膜片组织通常不会自行生成血管，对于多层细胞膜片用于修复较大或较深缺损组织则更难以保证其移植后营养供给，血管内皮细胞对于促进3D组织中新血管再生起着关键作用，因此有必要研究如何促进细胞膜片中血管再生以提高移植存活率，比如复合血管生长因子或者混合内皮细胞共培养促血管再生。

有学者报道利用血管内皮生长因子促3D心肌细胞膜片中的多能干细胞向内皮细胞分化，从而促血管再生，提高心脏移植膜片存活率和维持再生心脏功能^[27]。另外有文献报道将血管内皮细胞接种于细胞膜片上或“三明治”法复合细胞膜片与内皮细胞膜片共培养均可促进细胞膜片新毛细血管再生，这种血管再生能力被证实与细胞膜片中肝细胞生长因子、胎盘生长因子及基质金属蛋白酶9高表达密切相关^[28-29]。

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