瘢痕疙瘩组织中Livin、Smac、Caspase-3的表达及其相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

瘢痕疙瘩：皮肤组织愈合后所形成的过度生长的异常瘢痕组织，常具有病变超过原皮损范围、呈持续性生长、凸出皮面、质硬、呈条索状或蟹足样生长特点。

相关性研究：对2个或多个具备相关性的变量元素进行分析，从而衡量2个或多个变量因素相关的密切程度。

背景：目前临床治疗瘢痕疙瘩效果较差、常易复发。瘢痕疙瘩的发病机制仍不完全清楚，而关于成纤维细胞增殖及凋亡的研究为研究的热点。

目的：分析瘢痕疙瘩组织中Livin、Smac、Caspase-3的表达的相关性，初步探讨3种因子在瘢痕疙瘩组织发病机制中的作用。

方法：采用RT-PCR和免疫组织化学分别检测Livin、Smac、Caspase-3的mRNA和蛋白在20例瘢痕疙瘩组织和20例正常皮肤组织中的表达，并进行相关性分析

结果与结论：瘢痕疙瘩组织中Livin 的mRNA表达水平和蛋白的阳性表达率显著高于正常皮肤组织(P < 0.05)，瘢痕疙瘩组织中Smac和Caspase-3 的mRNA表达水平和蛋白的阳性表达率低于正常皮肤组织(P < 0.05)。瘢痕疙瘩组织中Livin和Smac、Caspase-3蛋白的表达呈负关联。结果提示Livin基因高表达可能抑制了Smac、Caspase-3基因表达从而导致了瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的失衡，最终导致了瘢痕疙瘩的形成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID:0000-0002-9531-0196(张远贵)

关键词: 组织构建, 组织工程, 瘢痕疙瘩, Livin, Smac, Caspase-3, 相关性

Abstract:

BACKGROUND: Currently, there is no effective treatment for keloids that often recur. Its pathogenesis is still entirely unclear, and fibroblast proliferation and apoptosis have become a research hotspot.
OBJECTIVE: To investigate the expression of Livin, Smac and Caspase-3 in keloids and to analyze their relationship so as to preliminarily explore the significance of Livin, Smac and Caspase-3 in the pathogenesis of keloids.
METHODS: RT-PCR and immunohistochemical methods were used to detect the mRNA and protein expressions of Livin, Smac and Caspase-3 in keloids (n=20) and normal skin tissues (n=20).
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal skin tissue, the mRNA and protein positive expressions of Livin were significantly higher in keloids (P < 0.05), while the mRNA and protein positive expressions of Smac and Caspase-3 were lower in keloids (P < 0.05). There was a negative association between Livin and Smac, Caspase-3 protein expression in keloids. These findings indicate that the high mRNA expression of Livin may cause the imbalance between proliferation and apoptosis of fibroblasts by inhibiting the mRNA expression of Smac and Caspase-3, and eventually lead to the formation of keloid.

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图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计单一样本观察。

1.2 时间及地点实验于2013年7月至2015年7月在徐州医学院附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 标本来源由徐州医学院附属医院烧伤整形外科提供标本。瘢痕疙瘩组织(术后瘢痕疙瘩均经病理证实)及正常皮肤组织各20例。所有标本选取前均未进行过任何放疗及药物治疗。患者及家属对取材均知情同意。

1.3.2 主要试剂兔抗人Livin、Smac、caspase-3多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司, SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Trizol Reagent购自Invitrogen 公司，RT反转录试剂盒、PCR试剂盒购自MBI公司。

1.4 方法

1.4.1 RT-PCR 切取实验标本100 mg，按说明书提取总RNA并反转录合成cDNA。应用Primer Premier5.0并根据GenBank所提供的Livin mRNA、Smac mRNA、Caspase-3 mRNA序列设计引物，并委托上海捷瑞公司合成。

PCR反应体系：PCR Mix 25 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Primer 1 μL、cDNA 1 μL、Water，nuclear-free 22 μL。

PCR反应条件：①Livin，94 ℃预变性3 min，变性：94 ℃，30 s，退火：60 ℃，30 s，延伸：72 ℃，45 s，共32循环；延伸：72 ℃，7 min。②Smac，94 ℃预变性3 min，变性：94 ℃，40 s，退火：58 ℃，30 s，延伸：72 ℃，40s，共32循环；延伸：72 ℃，5 min。③caspase-3，94 ℃预变性3 min，变性：94 ℃，40 s，退火：60 ℃，30 s，延伸：72 ℃，40 s，共32循环；延伸：72 ℃，5 min。④内参基因 β-actin，94 ℃预变性3 min，变性：94 ℃，30 s，退火：65 ℃，30 s，延伸：72 ℃，45 s，共32循环；延伸：72 ℃，7 min。

取5 μLPCR产物经琼脂糖凝胶电泳，上海天能科技有限公司的凝胶成像系统成像并进行半定量分析，结果以目的条带荧光强度值同与之配对的内参照β-actin扩增条带的荧光强度值的比值(即 β-actin校正值)表示。实验重复3次。

1.4.2 免疫组织化学染色按照SP染色试剂盒说明书进行操作。分别按 1∶100和1∶50稀释一抗：兔抗人Livin、Smac、Caspase-3多克隆抗体。采用阳性系数(染色强度×阳性细胞百分比)判定染色结果。采用同一显微镜倍数(40×)观察并随机选择5个高倍视野。

染色强度标准^[1]：0分(基本不染色)，1分(染色淡)，2分(染色中等)，3分(染色深)。

阳性细胞百分率(表达阳性的病例/总病例数×100%)标准：0分(小于5%)，1分(6-25%)，2分(26-50%)，3分(大于51%)。

阳性系数标准：0-1分为阴性(-)；2-9分为阳性，其中弱阳性(+)：2-3分，中等阳性(++)：4-6分，强阳性(+++)：9分。

1.5 主要观察指标 ①PCR结果。②免疫组织化学染色结果。③瘢痕疙瘩组织中Livin和Smac蛋白表达的关联性。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计学软件处理数据。采用Kuskal-Wallis H 检验、Mann-Whittney U 检验、Spearman等级相关分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

瘢痕疙瘩具有持续性生长、极易复发的特点，虽是良性病变但却具有恶性肿瘤的侵袭性行为。瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞的高增殖和低凋亡的生物学行为被认为是瘢痕疙瘩形成中的重要机制^[1-4]。凋亡抑制蛋白Livin是新近发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)的新成员，又名黑色素细胞瘤凋亡蛋白抑制因子或肾脏凋亡蛋白抑制因子，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子之一^[5]，可通过多种途径抑制细胞的凋亡，Livin在成人的正常组织中低表达或不表达，而在多数肿瘤组织中表达明显上调^[6]。研究表明Livin可以作为一种酶抑制剂通过其特有的BIR 结构域与凋亡过程中激活的核心物质 Caspases蛋白结合并导致 Caspases蛋白的失活和降解来抑制细胞凋亡^[7]。有报道在皮肤常见的恶性肿瘤鳞癌及基底细胞癌中均明显高表达^[8-9]，但对发生在皮肤组织中的瘢痕疙瘩中Livin表达的研究报道较少。此次研究表明，Livin mRNA和蛋白在瘢痕疙瘩组织中阳性表达率高于正常皮肤组，具有显著的统计学差异。Livin基因在瘢痕疙瘩组织中的表达上调，作者推测其可能参与了瘢痕疙瘩的形成、增殖过程，在瘢痕疙瘩的发生发展过程中起了重要作用。

Caspase即含半肤氨酸的天冬氨酸特异水解酶，是一组半胱氨酸蛋白酶家族，其成员在诱导细胞凋亡过程中起重要作用。目前认为Caspase是一切凋亡信号传导的共同通路，各种Caspase呈现“瀑布式”(cascade)层层激活，最终引发细胞凋亡^[10]。目前人们普遍认为诱导细胞凋亡的过程主要有两种途径：一是TNF受体家族成员参与并通过Caspase-8活化的途径，称之为外源性凋亡途径；二是细胞色素C参与并通过Caspase-9活化的途径，称之为内源性凋亡途径。两条途径最后均通过激活下游效应因子(Caspase-3、Caspase-7)使细胞发生凋亡。Caspase-3是已知该家族中最重要的成员，细胞凋亡的核心机制，一般正常情况下以无活性的酶原形式存在，表达于许多正常细胞和肿瘤细胞，各种诱导细胞凋亡的信号可以通过不同的信号传导通路激活Caspase-3从而开启凋亡级联反应，最终诱导细胞发生不可逆的凋亡进程^[11-12]。Caspase-3已被广泛应用于何杰金氏病^[13]、非何杰金氏病^[14]、帕金森病^[15]、结肠癌^[16]、膀胱癌等多种疾病的研究^[17]。但Caspase-3与瘢痕疙瘩关系的研究则相对较少。本实验的研究结果显示，Caspase-3在瘢痕疙瘩组织中低表达，与正常皮肤组织中的表达具有差异性，可能说明了瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞的凋亡水平较低，鉴于Livin在瘢痕组织中的高表达，推测Livin可能直接或间接抑制Caspase-3的活性，进而抑制了细胞凋亡。

Smac(Second mitochondria-derived activator of Caspase)，即第二个线粒体来源的胱氨酸酶激活剂，是新发现的一种促凋亡分子^[18]，也是目前发现的惟一存在于哺乳动物细胞中可直接抑制多个IAPs家族成员活性的蛋白，在细胞凋亡线粒体信号通路中发挥着重要的调节作用。Smac在人体组织中广泛表达，而在肿瘤组织中其表达降低或缺失，且在不同癌组织表达也不相同^[6^，^19]。有研究表明Smac可与IAPs的BIR结构域结合解除其对Caspase-3的抑制作用，从而使Caspase-3活性增强，进细胞凋亡发生^[6^，^20]。目前Smac在瘢痕疙瘩中的表达研究较少。本实验中发现Smac在瘢痕疙瘩组织中低表达，与正常皮肤组织中的表达具有差异性。Smac可能与瘢痕疙瘩组织的低水平凋亡密切相关，参与了瘢痕疙瘩的形成。本实验分别对瘢痕疙瘩组织中Livin和Smac、Caspase-3的表达水平进行相关性分析研究，发现瘢痕疙瘩组织中Livin和Smac、Caspase-3蛋白的表达呈负关联。

综上所述， Livin基因的过度激活和Smac基因、Caspase-3的低表达可能在凋亡信号传导网络通路中起重要的作用。Livin基因的高表达可能抑制了Smac、Caspase-3基因表达，从而导致细胞凋亡不足，导致了瘢痕疙瘩中成纤维细胞增殖和凋亡的失衡，增殖明显大于凋亡，因而成纤维细胞出现了过度增殖，最终导致了瘢痕疙瘩的形成。

Livin、Smac、Caspase-3基因可能在瘢痕疙瘩的发生发展的过程中起了关键性作用。深入探讨三者与瘢痕疙瘩的关系，可能为瘢痕疙瘩发病机制的研究提供新思路、为其临床防治提供新途径。

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