P物质对表皮细胞聚集、分化控制及在皮肤创伤修复中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.003

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

P物质：它是一种高活性的神经肽类物质，广泛地分布于神经系统和其他外周组织器官内，具有多种生理功能。在皮肤内，P 物质主要由感觉神经末梢释放，它通过趋化免疫细胞、调节细胞因子的产生以及舒张微血管等参与皮肤局部免疫炎症反应；还可促进皮肤内多种细胞的分裂、增殖以及细胞DNA的合成，参与皮肤创伤的修复。

创伤反应：是一种完整的生物进化的固有应答，即可溶性介质从一个细胞释放最终引起另一些细胞发生一系列的反应，导致基因转录、蛋白翻译，最终修复创口界面，也是一个复杂而有序的生物学过程，涉及炎症反应、细胞增殖、迁移、创面重塑等多个连贯又相互交叉的病理生理学过程。

背景：表皮干细胞是皮肤及其附属器修复的源泉细胞，研究其分化、迁移的调控机制是实现其完美愈合的关键。

目的：探讨P物质在皮肤创伤修复中的应用效果。

方法：采用随机对照方法将30只Wistar大鼠分为P物质组、辣椒素组和对照组，每组10只。建立皮肤缺损模型后分别于创面局部注射外源性神经肽P物质、辣椒素、生理盐水，均连续注射5 d。用药不同时间点检测3组大鼠皮肤厚度、皮肤创伤面积、BrdU阳性细胞率。

结果与结论：①用药第14天3组大鼠皮肤厚度差异无显著性意义(P > 0.05)；随着用药时间的不断延长，表皮厚度开始变薄；用药第42天，P物质组表皮厚度明显缩小，对照组表皮厚度变化不明显，辣椒素组表皮厚度有所缩小。②皮肤创伤3，5，7 d时P物质组皮肤创伤面积显著小于对照组和辣椒素组(P < 0.05)，辣椒素组和对照组的创伤面积差异无显著性意义(P > 0.05)。③P物质组在用药第3，5，7，12天时BrdU细胞阳性率显著高于辣椒素组和对照组(P < 0.05)；辣椒素组在第3，5，7，12天时BrdU细胞阳性率显著低于对照组(P < 0.05)。④结果提示P物质能够促进表皮细胞增殖，加速创面部位愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0003-3920-1283(彭希亮)

关键词: 组织构建, 组织工程, 表皮细胞, P物质, 聚集, 皮肤创伤, 辣椒素

Abstract:

BACKGROUND: Epidermal stem cells are the source of cells for repairing the skin and its appendages. To study differentiation and migration of epidermal stem cells is crucial for perfect healing.
Objective: To investigate the effects of substance P in skin wound repair.
METHODS: Thirty Wistar rats were randomized into groups of substance P, capsaicin and control (n=10 per group). After the establishment of skin defect models, exogenous neuropeptide substance P, capsaicin, and normal saline were daily injected at the wound for continuous 5 days. Skin thickness, skin wound area, BrdU-positive cells were detected in the three groups at different time after injection.
Results and conclusions: No difference n the skin thickness was found in the three groups at 14 days after injection (P > 0.05), but with time, the epidermal thickness was reduced. At 42 days, the epidermal thickness was reduced remarkably in the substance P group and decreased certainly in the capsaicin group, but unchanged in the control group. The wound area of the substance P group was significantly lower than that in the control and capsaicin groups at 3, 5, 7 days after injection (P < 0.05), but there was no difference between the control and capsaicin group (P > 0.05). The BrdU positive rates in the three groups were significantly different at 3, 5, 7, 12 days after injection: the substance P group > the control group > the capsaicin group (P < 0.05). These results show that substance P can promote epidermal cell proliferation and accelerate wound healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

彭希亮，张玉红，倪文琼. P物质对表皮细胞聚集、分化控制及在皮肤创伤修复中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(11): 1538-1543.

Peng Xi-liang, Zhang Yu-hong, Ni Wen-qiong. Substance P effects on aggregation and differentiation control of epidermal stem cells and skin wound repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(11): 1538-1543.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] 朱王刚,蔡青,刘世清,等.早期大剂量应用丹参对急性颈髓损伤患者血液流变性的影响[J].微循环学杂志,2009, 19(4): 61-62.

[2] 王茂林,陈世益,李云霞,等.黄芪丹参注射液对大鼠急性骨骼肌钝挫伤后微循环的影响[J].中国运动医学杂志,2009, 28(6):651-653.

[3] 宋少华,郭闻渊,傅志仁,等.丹参多酚酸盐负性调节小鼠骨髓来源树突状细胞成熟及其部分免疫功能[J].第二军医大学学报,2009,30(12):1333-1337.

[4] 张雷,郑芙林,李珊珊,等.隐丹参酮对淋巴细胞增殖反应的影响[J].时珍国医国药,2010,21(1):92-93.

[5] 曾煦欣,王春霞,王芳,等.丹参对大鼠粘连成纤维细胞增殖与胶原合成的作用研究 [J].中华中医药杂志,2011,26(8): 1839-1841.

[6] Spaas JH, Gomiero C, Broeckx SY, et al. Wound- healing markers after autologous and allogeneic epithelial-like stem cell treatment. Cytotherapy. 2016; 18(4):562-569.

[7] Zhou T, Yang Z, Chen Y, et al. Estrogen Accelerates Cutaneous Wound Healing by Promoting Proliferation of Epidermal Keratinocytes via Erk/Akt Signaling Pathway. Cell Physiol Biochem. 2016;38(3):959-968.

[8] Saldanha SN, Royston KJ, Udayakumar N, et al. Epigenetic Regulation of Epidermal Stem Cell Biomarkers and Their Role in Wound Healing. Int J Mol Sci. 2015;17(1). pii: E16.

[9] ardien KL, Marck RE, Bloemen MC, et al. Outcome of Burns Treated With Autologous Cultured Proliferating Epidermal Cells: A Prospective Randomized Multicenter Intrapatient Comparative Trial. Cell Transplant. 2016;25(3):437-448.

[10] Vagnozzi AN, Reiter JF, Wong SY. Hair follicle and interfollicular epidermal stem cells make varying contributions to wound regeneration. Cell Cycle. 2015;14(21):3408-3417.

[11] Guo R, Chai L, Chen L, et al. Stromal cell-derived factor 1 (SDF-1) accelerated skin wound healing by promoting the migration and proliferation of epidermal stem cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2015;51(6): 578-585.

[12] Bourke CD, Prendergast CT, Sanin DE, et al. Epidermal keratinocytes initiate wound healing and pro-inflammatory immune responses following percutaneous schistosome infection. Int J Parasitol. 2015;45(4):215-224.

[13] Wikramanayake TC, Stojadinovic O, Tomic-Canic M. Epidermal Differentiation in Barrier Maintenance and Wound Healing. Adv Wound Care (New Rochelle). 2014;3(3):272-280.

[14] Xiong B, Cheng Y, Ma L, et al. MiR-21 regulates biological behavior through the PTEN/PI-3 K/Akt signaling pathway in human colorectal cancer cells.Int J Oncol. 2013;42(1):219-228.

[15] Ribas J, Ni X, Castanares M, et al. A novel source for miR-21 expression through the alternative polyadenylation of VMP1 gene transcripts.Nucleic Acids Res. 2012;40(14):6821-6833.

[16] Li J, Huang H, Sun L,et al. MiR-21 indicates poor prognosis in tongue squamous cell carcinomas as an apoptosis inhibitor.Clin Cancer Res. 2009;15(12): 3998-4008.

[17] Wang T, Feng Y, Sun H, et al. miR-21 regulates skin wound healing by targeting multiple aspects of the healing process.Am J Pathol. 2012;181(6):1911-1920.

[18] Madhyastha R, Madhyastha H, Nakajima Y, et al. MicroRNA signature in diabetic wound healing: promotive role of miR-21 in fibroblast migration. Int Wound J. 2012;9(4):355-361.

[19] Zhang Z, Zha Y, Hu W, et al. The autoregulatory feedback loop of microRNA-21/programmed cell death protein 4/activation protein-1 (MiR-21/PDCD4/AP-1) as a driving force for hepatic fibrosis development. J Biol Chem. 2013;288(52):37082-37093.

[20] Philandrianos C, Andrac-Meyer L, Mordon S, et al. Comparison of five dermal substitutes in full-thickness skin wound healing in a porcine model. Burns. 2012; 38(6):820-829.

[21] 曾煦欣,王芳,蒋泓,等.丹参抑制人粘连成纤维细胞增殖的作用研究[J].中国药房,2011,22(27):2514-2516.

[22] 王得胜,刘莉.丹参对胆道损伤修复过程中转化生长因子 β1表达的影响及其意义[J].广东医学,2011,32(12): 1535-1537.

[23] 蒙晓,王成蹊,蔡洪福,等.丹参酮ⅡA 对腹部术后粘连大鼠成纤维细胞增殖及其相关基因表达的影响[J].中草药, 2012,43(7):1381-1384.

[24] 支文煜.脑缺血再灌注损伤引起的线粒体功能障碍及丹参酮ⅡA的保护作用研究[J].实用心脑肺血管病杂志, 2010, 18(10):1389-1391.

[25] 黄震亚,陈天鹏,梁宇,等.丹参对重度烧伤器官缺血再灌注损伤保护作用的临床观察[J].现代预防医学,2011,38(5): 968-970.

[26] 李玉娟,韩冬,徐想顺,等.丹参素对脂多糖引起的小鼠脑微循环障碍的改善作用[J]. 微循环学杂志,2010,20(2): 62-63.

[27] 蔡青,张伯礼,黄淑芸,等. 丹参酮 B 钠盐对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠海马神经递质含量的影响[J].天津中医药,2010,27(6):486-489.

[28] Yin X, Yin Y, Cao FL, et al. Tanshinone IIA attenuates the inflammatory response and apoptosis after traumatic injury of the spinal cord in adult rats. PLoS One. 2012;7(6):e38381.

[29] 辛霞,金鲜珍,阮瑞霞,等.负压吸引技术在外科延迟愈合伤口护理中的应用[J].护理研究,2014,28(3): 837.

[30] Jiang L, Liu T, Song K. Growth characteristics of human adipose-derived stem cells during long time culture regulated by cyclin a and cyclin D1. Appl Biochem Biotechnol. 2012;168(8):2230-2244.

[31] 杨世茂,王明国,李静,等.复合 ADSCs/β-TCP组织工程骨与PRF修复下颌骨缺损的实验研究[J]. 实用口腔医学杂志,2012,28(6): 686-690.

[32] Herreros MD, Garcia-Arranz M, Guadalajara H, et al. Autologous expanded adipose-derived stem cells for the treatment of complex cryptoglandular perianal fistulas: a phase III randomized clinical trial (FATT 1: fistula Advanced Therapy Trial 1) and long-term evaluation. Dis Colon Rectum. 2012;55(7):762-772.

[33] 杨超,邢新,徐达圆,等.脂肪干细胞-透明质酸复合物促进放射性复合损伤创面愈合的初步研究[J].中国修复重建外科杂志,2011,25(12): 1499-1503.

[34] Kajiyama H, Hamazaki TS, Tokuhara M, et al. Pdx1-transfected adipose tissue-derived stem cells differentiate into insulin-producing cells in vivo and reduce hyperglycemia in diabetic mice. Int J Dev Biol. 2010;54(4):699-705.

[35] Zhang X, Liu L, Wei X, et al. Impaired angiogenesis and mobilization of circulating angiogenic cells in HIF-1alpha heterozygous-null mice after burn wounding. Wound Repair Regen. 2010;18(2):193-201.

[36] Mansilla E, Spretz R, Larsen G, et al. Outstanding survival and regeneration process by the use of intelligent acellular dermal matrices and mesenchymal stem cells in a burn pig model. Transplant Proc. 2010; 42(10):4275-4278.

[37] 张华.敛痔散在肛肠病术后伤口换药中的疗效观察[J].中医外治杂志,2009,18(4):28-29.

[38] 孔焕宇,孔繁飞,黄清怡,等.大鼠创面愈合过程中表皮干细胞增殖分化与玉红膏的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,46(11):9400-9403.

[39] 吕国忠,周红梅,赵朋,等.体外培养表皮干细胞复合高分子支架原位修复深度烧伤创面的研究[J].中华损伤与修复杂志:电子版,2011,6(1):14-19

[40] 钟清玲,刘德伍,刘繁荣,等.羊膜负载表皮干细胞促进糖尿病大鼠创面的愈合[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010,14(32):6010-6014.

[41] 李澄,吕红莉,李燕,等.皮肤干细胞体外培养与诱导分化[J].中国现代医学杂志,2010,20(19):2950-2952.

[42] 王秀卿,王志玲,刘会敏.人表皮干细胞的培养技术[J].白求恩军医学院学报,2009,7(5):342-343.

[43] 廖立新,陈刚泉,李国辉,等.应用表皮干细胞构建组织工程皮肤及移植实验[J].中国组织工程研究与临床康复,2007, 11(14):2661-2664.

[44] 张彦刚,胡大海,张战凤,等.人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建[J].中国美容医学,2011,20(1):79-82.

[45] 高志雄,王威,吕恩基,等.针刺上巨虚穴缓解慢性内脏痛敏的作用及机理[J].山西大同大学学报:自然科学版,2010, 26(3):42-44.

[46] 吴玉芳,刘浩,郝建军,等. 针刺镇痛对结肠镜检查患者疼痛程度及体内β-内啡肽、P物质水平的影响[J].中西医结合研究,2012,4(2):57-60.

[47] 王振宇,李淑莲,王希文,等.脊髓背角P物质在电针调控炎性痛大鼠神经-免疫网络中的作用研究[J].中医药学报, 2012,40(3):88-90.

[48] 孙卫兵,杨帆,齐清会.电针次髎穴对慢性膀胱过度活动症模型大鼠尿动力学及脊髓背角SP和CGRP影响[J].大连医科大学学报,2012,34(3):220-224.

引言

创伤愈合是一个复杂而有序的生物学过程，涉及炎症反应、细胞增殖、迁移、创面重塑等多个连贯又相互交叉的病理生理学过程，一般可分为3个阶段：炎性反应期、增殖期以及组织重构期^[1]。肉芽组织形成是真皮或皮下组织损伤后修复的主要方式，肉芽组织内含有丰富的毛细血管和成纤维细胞，可为组织修复提供氧和必要的营养物质，促进创伤愈合^[2-3]。目前，临床上用于创伤修复的方法相对较多，如植皮、创面覆盖等，这些方法虽然能短期促进创面修复，但是修复周期较长，愈合较差，容易形成瘢痕^[4-5]。研究显示：表皮细胞分化、迁移的调控机制是实现创面完美愈合的关键^[6-13]，也是表皮干细胞走向临床的关键。但是，该结论尚未得到进一步证实。

研究发现，感觉神经末梢分泌的感觉神经肽类物质(如P物质、降钙素基因相关肽等)可促进伤口愈合，其机制可能和启动神经源性炎症反应、调控免疫细胞功能、促使修复细胞增殖等有关^[14-16]。前期实验发现，在正常皮肤伤口愈合过程中，外源性神经肽P物质可以促进大量表皮干细胞募集于创缘及肉芽组织中，加速伤口愈合，但是这些结论并没有获得充分的肯定和认可。国外学者研究显示，在皮肤创伤修复中机体内的成纤维细胞能够分泌P物质^[17-18]，对单核-巨噬细胞、中性粒细胞等具有趋化作用，能够促进人外周血细胞分泌白细胞介

素^[19]，进一步促进滑膜细胞分泌氧自由基等，诱导氧化爆发，释放自由基。部分学者甚至对P物质在创面修复中的作用产生较大的争议，其争议的焦点在于P物质是直接参与创面修复还是能转化为其他物质促进创面修复^[20]。为此，实验探讨P物质在皮肤创伤修复中的应用效果，为临床提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2015年1至8月在郑州大学附属郑州中心医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 30只Wistar大鼠，3-6周龄，体质量为0.15-0.53 kg，平均(0.31±0.04) kg，雌雄不限，由郑州大学附属郑州中心医院动物实验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为SCXK(豫)2007- 0010。对大鼠的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则。

采用随机对照方法将30只大鼠分为P物质组、辣椒素组和对照组，每组10只。

1.3.2 主要药物辣椒素(eapsaieine)由美国Sigma公司提供，它是辣椒的活性成分，对哺乳动物及人类能够产生一定烧灼感，具有消炎、止痛作用。P物质(Substance P，SP)由美国Sigma公司提供，属于一种神经肽，能够促进谷氨酸释放并参与痛觉的传递，是经脉信息传递的重要物质^[21]。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠建模及皮肤创伤修复^[22-23] 将3组所需要的材料等进行辐射消毒，备用。将入选大鼠采用3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾，将大鼠俯卧固定在手术台上，用手术刀在大鼠背部正中做一个长为3 cm的纵行切口，制备皮肤创伤模型(图1)。止血彻底后P物质物组在创面局部每天注入25 mL外源性神经肽P物质，1次/d，连续注射5 d，辣椒组每天注射20 mL辣椒素，1次/d，连续注射5 d，对照组每天注射30 mL生理盐水，2次/d，连续注射5 d。

1.4.2 创伤面积 3组大鼠在用药第1，3，5，7天采用游标卡尺测量创伤面积。

1.4.3 创伤表皮厚度用药第14天及第42天，每组每个时间点随机选取2只大鼠，取创伤部位组织进行石蜡包埋经过5 mm连续切片后，进行苏木精-伊红染色。每组标本观察2张切片，每张切片随机选择3个视野，在400倍光学显微镜下照相，观察创伤表皮厚度^[24-25]。

1.4.4 免疫组织化学染色方法检测BrdU阳性表达用药第3，5，7，12天，每组每个时间点随机选取2只大鼠，取创伤部位组织进行石蜡包埋经过5 mm连续切片后，进行免疫组织化学染色，在显微镜下观察，并利用MIG2000软件计算BrdU阳性细胞率^[26-27]。

1.5 主要观察指标 ①创伤表皮厚度。②皮肤创伤面积。③创伤组织BrdU阳性细胞率。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

皮肤创伤愈合是一个相对比较复杂而又具有规律的过程。研究显示，皮肤创伤修复过程中多种细胞参与了皮肤创伤愈合，它在皮肤更新及再生过程中发挥了重要的作用^[28-30]。神经肽为一大类中枢和周围神经系统的细胞外信使分子，该分子主要存在于肾上腺素以及神经纤维中，能够间接或直接参与伤口愈合^[31-32]。目前，研究发现的能够参与细胞增殖、分化的神经肽主要有P物质、降钙素基因相关肽等^[33-34]。

神经肽能促进成熟细胞的进一步分化，从而能够调节存活干细胞的增殖等^[35-36]；同时，骨髓中的P物质能直接作用于受体，参与机体造血干细胞等一系列相关生物行为^[37-38]。实验结果发现，用药第14天3组大鼠皮肤厚度差异无显著性意义(P > 0.05)；随着用药时间不断延长，表皮厚度开始变薄；用药第42天，P物质组表皮厚度明显缩小，对照组表皮厚度变化不明显，辣椒素组表皮厚度有所缩小。由此看出：P物质能够促进创面早期愈合，增加表皮细胞的分化作用。P物质在皮肤创伤中的修复作用与传统的肉芽组织形成理论相互矛盾^[39]。从大的角度来说：肉芽组织由众多毛细血管以及微小血管及纤维细胞组成，它是对皮肤创伤进行修复的前提和关键步骤之一，皮肤创伤在修复过程中肉芽组织数量的多少将会直接影响创伤修复效果及预后等^[40]。有学者研究显示，间充质干细胞能直接参与创面愈合，并且能促进肉芽组织中血管形成^[41-42]，由此说明皮肤创伤中肉芽组织内的细胞来源可能是多方面的。实验结果发现，在皮肤创伤第1，3，5，7天辣椒素组和对照组创伤面积差异无显著性意义(P > 0.05)；大鼠皮肤创伤第3，5，7天P物质组皮肤创伤面积显著小于对照组和辣椒素组(P < 0.05)，由此看出P物质能有效促进肉芽组织募集，且这些募集的组织直接参与肉芽组织形成，能进一步促进皮肤创面的愈合，缩短创面愈合时间^[43-44]。

P物质对皮肤创面的修复产生直接作用和间接作用^[45-46]，其直接作用主要物质能够结合创面组织表皮干细胞特异受体，从而能够促进表皮干细胞向创面边缘以及肉芽组织募集，充当一种能力较强的表皮趋化因子；间接作用则是P物质能够在皮肤受到创伤后调节机体内的相关表皮细胞相关因子、成纤维细胞生长因子等，诱导组织细胞向皮肤创伤部位移动，促进机体早期恢复^[47-48]。实验结果发现，P物质组在第3，5，7，12天时BrdU细胞阳性率显著高于辣椒素组和对照组(P < 0.05)；辣椒素组在第3，5，7，12天时BrdU细胞阳性率显著低于对照组(P < 0.05)。

综上所述，P物质属于是一种神经源性炎症的一种介质，它可以从多方面促进修复细胞增殖，促进创伤部位愈合，具有重要的临床研究价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程