同种异体和异种来源骨髓间充质干细胞诱导成软骨修复喉软骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.07.007

摘要/Abstract

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文题释义：

软骨及软骨组织工程：软骨由软骨组织及其周围的软骨膜构成，软骨组织由软骨细胞、基质及纤维构成。根据软骨组织内所含纤维成分的不同，可将软骨分为透明软骨、弹性软骨和纤维软骨3种，其中以透明软骨的分布较广，结构也较典型。软骨组织工程是将软骨种子细胞种植于可生物降解、组织相容性好的生物材料形成复合物，然后再把该复合物植入软骨缺损处，生物材料自行降解的过程中，种植的细胞形成新的软骨来填充缺损。

骨髓间充质干细胞成软骨分化：骨髓间充质干细胞在特定的条件下，可诱导其向软骨细胞分化。研究报道在单层培养时使用骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、成纤维细胞生长因子2等可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。与骨髓间充质干细胞单独诱导培养相比，软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养可以产生更多的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖等软骨细胞特征性的细胞外基质成分。

背景：由于软骨细胞缺乏再生能力，选择合适的种子细胞是修复软骨缺损需首要解决的问题。

目的：探讨同种异体和异种来源骨髓间充质干细胞成软骨诱导后修复喉软骨缺损的效果。

方法：取第3代人骨髓间充质干细胞和兔骨髓间充质干细胞加入软骨定向诱导液(含转化生长因子β1和骨形态发生蛋白)进行成软骨诱导，并滴加于聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架上。取30只新西兰大白兔随机分为3组：空白对照组、人骨髓间充质干细胞修复组和兔骨髓间充质干细胞修复组，制备喉软骨缺损动物模型，分别植入生理盐水浸湿的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架，人骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架，兔骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架。术后4周和8周，免疫组化法检测喉部组织Ⅱ型胶原的表达。

结果与结论：各组动物均呼吸通畅、正常，未出现喘鸣等，进食和活动情况良好，未出现化脓或者感染现象。术后4周和8周，人骨髓间充质干细胞修复组和兔骨髓间充质干细胞修复组的Ⅱ型胶原阳性率均显著高于空白对照组(P < 0.05)。人骨髓间充质干细胞修复组和兔骨髓间充质干细胞修复组间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明同种异体和异种来源的骨髓间充质干细胞成软骨诱导后进行兔喉软骨缺损修复均可以获得良好的效果，二者修复效果无显著差异。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-0574-1479(刘艺昌)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 软骨缺损, 修复, 骨髓间充质干细胞, 聚乳酸-羟基乙酸共聚物, 定向诱导, 同种异体, 异种

Abstract:

BACKGROUND: Because chondrocytes have no regeneration ability, to select suitable seed cells is the primary problem to repair cartilage defects.
OBJECTIVE: To investigate the effect of allogeneic versus heterologous bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in repairing laryngeal cartilage defects after chondrogenic induction.
METHODS: BMSCs from human and rabbits were isolated and cultured. Passage 3 cells were cultured in chondrogenic induction medium containing transforming transforming growth factor beta 1 and bone morphogenetic protein, and then were dropped onto a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) scaffold. Thirty New Zealand rabbits were randomly assigned into three groups: blank control group, human BMSCs group, rabbit BMSCs group. Animal models of laryngeal cartilage defects were made in the three groups. After modeling, saline-soaked PLGA scaffold, PLAG scaffold with human BMSCs or with rabbit BMSCs were implanted respectively into the rabbits in the normal blank, human BMSCs and rabbit BMSCs groups. The expression of type II collagen in the larynx and its surrounding tissues was detected by immunohistochemistry at 4 and 8 weeks postoperatively.
RESULTS AND CONCLUSION: The animals in each group breathed normally with no presence of wheezing, and their eating and activity were good. Moreover, there was no purulency or infection in the three groups. At 4 and 8 weeks after operation, the positive rates of type II collagen in the two BMSCs groups were significantly higher than that in the blank control group (P < 0.05). There was no significant difference between two BMSCs groups (P > 0.05). These results show that both allogeneic and heterologous BMSCs have good therapeutic effects on the repair of laryngeal cartilage defects in rabbits.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

刘艺昌，周敬. 同种异体和异种来源骨髓间充质干细胞诱导成软骨修复喉软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(7): 966-971.

Liu Yi-chang, Zhou Jing. Allogeneic versus heterogeneous bone marrow mesenchymal stem cells for laryngeal cartilage repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(7): 966-971.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析建模的30只动物均进入结果分析，未出现死亡或者脱落。

2.2 人骨髓间充质干细胞培养结果经分离培养，人骨髓间充质干细胞为大圆形，单核，呈现出均一的形态。培养24 h之后，出现部分细胞贴壁，少量细胞呈短梭形；培养48-72 h之后，贴壁细胞数量显著增加，且大多呈短梭形和圆形。传代培养至第3代，细胞增殖速度显著加快，呈长梭形，几乎全部贴壁，并呈漩涡状盘旋排列(图2)。经流式细胞术鉴定，细胞表面标记物CD34、CD45呈阴性表达，分别为(1.8±0.2)%，(0.8±0.1)%，CD44呈阳性表达，为(94.7±0.5)%，见图3。

2.3 兔骨髓间充质干细胞培养结果原代培养8-10 h之后，可以观察到部分体积较大的单核细胞开始贴壁生长。培养 48 h之后，细胞呈多角形或者圆形，细胞大小、形态不一。培养4 d之后，大多数细胞均呈现出梭形，数量显著增加(图4)。培养11 d之后，可观察到细胞呈现出集落状生长；培养至第3代，细胞生长融合发生滞后现象，呈均一、长梭形，集落样分布，部分发生重叠生长。

第3代兔骨髓间充质干细胞均一性达到90%以上。经流式细胞术鉴定，细胞表面可以稳定表达CD29、CD105、CD166，分别为(71.4±3.3)%，(49.3±2.1)%，(88.7±2.7)%，提示所获得的细胞为实验所需的骨髓间充质干细胞。

2.4 大体观察各组动物均呼吸通畅、正常，未出现喘鸣等，进食和活动情况良好，术后伤口均一期愈合，未出现化脓或者感染现象。人骨髓间充质干细胞修复组与兔骨髓间充质干细胞修复组植入的工程化软骨无移位及排斥反应，与正常软骨对合良好，空白对照组未形成软骨组织。

2.5 Ⅱ型胶原表达人骨髓间充质干细胞修复组(图5A)和兔骨髓间充质干细胞修复组(图5B)Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性，可见棕黄色颗粒分布于细胞质内，而空白对照组未着色(图5C)。术后4周和8周，人骨髓间充质干细胞修复组和兔骨髓间充质干细胞修复组的Ⅱ型胶原阳性率均显著高于空白对照组(P < 0.05)。人骨髓间充质干细胞修复组和兔骨髓间充质干细胞修复组间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

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引言

材料方法

1.1 设计体外观察性实验与随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年5至7月在郑州大学第一附属医院完成。

1.3 材料

实验试剂与仪器：PBS(上海博升生物科技有限公司；孵育箱(苏州市莱顿科学仪器有限公司)；胰酶(北京嘉康源科技发展有限公司)；流式细胞仪(上海天美科学仪器有限公司)；戊巴比妥(潍坊海之源生物制品有限公司)；超净工作台(江苏舜星科技有限公司)；青霉素钠(潍坊威森格化工有限公司)；链霉素(北京索莱宝科技有限公司)；两性霉素(临沂市泰尔化工科技有限公司)；DMEM 培养液(金骏升科技国际有限公司)；流式管(上海弘顺生物科技有限公司)；聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架(上海甄准生物科技有限公司)；转化生长因子β1 (TGF-β1)(上海高创化学科技有限公司)；骨形态发生蛋白1(上海希美化学有限公司)；离心机(张家港市恒大离心机有限公司)；切片机(温州顶历医疗器械有限公司)；倒置显微镜(北京中仪光科科技发展有限公司)；青霉素(上海研域生物科技有限公司)；酶联免疫测试仪(复纳科学仪器(上海)有限公司。

实验动物：纳入31只健康新西兰大白兔，体质量2.5-3.0 kg，6-10个月龄，雌雄各半，购自上海交大海科生物部，许可证号SCKK(沪)2015-0023，均喂饲精制颗粒饲料，自由饮水。研究相关内容和方法均经郑州大学第一附属医院伦理部门审核并批准。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨髓间充质干细胞的分离与培养抽取1名健康志愿者髂骨骨髓15 mL(35岁，排除血液系统疾病，经医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书)，添加15 mL PBS，置于室温条件下进行离心，再次添加PBS制备细胞悬液。分次加入Percoll分离液中，离心后取中间细胞层，添加PBS，常规离心之后弃去上清液，接种在培养瓶中，接种细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，添加完全培养基进行常规原代培养，连续培养7 d之后用胰酶进行消化，并进行传代培养。

1.4.2 人骨髓间充质干细胞的鉴定取第3-6代细胞进行鉴定，于室温条件下用胰酶消化，离心，收集细胞沉淀，PBS洗涤3次，制备细胞悬液。加入荧光标记的不同表型抗体，常规孵育、洗涤之后上流式细胞仪检测，利用Cell-Quest软件对所得数据进行处理。

1.4.3 兔骨髓间充质干细胞的分离与培养取1只新西兰大白兔，用戊巴比妥进行腹腔麻醉，自胫骨近端内侧处进行骨髓穿刺，获得3 mL骨髓液，注入离心管内进行密度梯度离心。离心后吸取中间单个核细胞层，PBS洗涤后接种于培养皿中，接种密度为1.6×10⁴/cm²并添加含青霉素钠、链霉素、两性霉素的培养液进行原代培养，待细胞爬满培养瓶底时进行传代培养。

1.4.4 兔骨髓间充质干细胞的表面抗原鉴定取传代培养的第3代细胞，用胰蛋白酶消化，添加DMEM培养液中止消化，PBS洗涤，离心后弃去上清，添加新鲜培养液制备细胞悬液，调整细胞浓度后置于流式管中，添加不同表面抗原抗体，避光放置后利用流式细胞仪进行检测。

1.4.5 骨髓间充质干细胞定向诱导及与支架复合分别取第3代人和兔骨髓间充质干细胞制备细胞悬液，加入软骨定向诱导液(含转化生长因子β1、骨形态发生蛋白1)，并滴加到聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架上，每3 d或4 d换液1次，连续诱导21 d。干细胞与支架复合后大体情况见图1。

1.4.6 动物模型建立及实验分组取剩余30只新西兰大白兔，利用戊巴比妥进行腹腔麻醉，于颈前正中作切口，分离皮下组织及肌层，暴露甲状软骨，并于左侧做全层软骨缺损，大小为0.5 cm×0.5 cm，注意避免穿透喉黏膜。将动物随机分为3组，每组10只，分别为人骨髓间充质干细胞修复组和兔骨髓间充质干细胞修复组以及空白对照组。

1.4.7 分组干预空白对照组植入生理盐水浸湿的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架，人骨髓间充质干细胞修复组植入人骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架，兔骨髓间充质干细胞修复组植入兔骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架，术后进行常规青霉素注射治疗以抗感染。

1.4.8 标本获取与免疫组化检测术后4周和8周，分别处死各组5只动物，即刻获得喉部及其周围组织标本并进行切片，利用免疫组化法检测Ⅱ型胶原表达。

1.5 主要观察指标 ①人、兔骨髓间充质干细胞的形态及鉴定。②免疫组化法检测喉部及其周围组织Ⅱ型胶原的表达。

1.6 统计学分析利用统计学软件SPSS 19.0进行分析，实验指标参数值用x(_)±s表示，进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

临床各种常规方法治疗喉软骨缺损大多无法获得理想的效果。随着组织工程学及相关技术的发展和应用，为关节软骨修复提供了新思路^[6]。在体外一定条件下，骨髓间充质干细胞可以诱导分化为成各种细胞，包括神经元细胞、软骨细胞、骨细胞以及心肌细胞和脂肪细胞等^[7]。Schagemann等^[8]通过研究指出，成人软骨缺乏自我修复能力，用组织工程软骨治疗可以获得良好的效果。Iwai等^[9]也通过构建巨细胞病毒即刻早期增强细胞启动子组合，获得人骨髓间充质干细胞的高表达载体。结果发现，转染载体的骨髓间充质干细胞显示出较高的细胞因子转基因生产能力，具有较高的向软骨细胞分化能力。与其他类型种子细胞比较，骨髓间充质干细胞具有十分明显的应用优势。首先，取材十分方便，且经过一定的体外扩增即可获得大量的骨髓间充质干细胞^[10-11]；其次，骨髓间充质干细胞具有良好的黏附性，可以与多种支架材料发生良好的相互黏附；另外，骨髓间充质干细胞还具有免疫学特征，不表达一定的共刺激分子，可以避免免疫排斥反应的出现^[12-15]。

目前对骨髓间充质干细胞进行鉴定的时候，大多需要结合其形态学观察以及各种细胞表型表达等^[16-24]。本实验分离培养人骨髓间充质干细胞和免骨髓间充质干细胞，细胞均一性较好，符合骨髓间充质干细胞表型特性。将不同来源骨髓间充质干细胞分别与聚乳酸-羟基乙酸支架进行复合，构建组织工程软骨用于修复喉软骨缺损。聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物支架具有良好的生物降解性和生物相容性，有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纤性、吸湿性^[25-27]。软骨组织工程的研究已有很大进展，但既往大多集中在组织工程化软骨组织的构建上，实验在成功构建出同种异体组织工程化软骨的基础上，尝试用工程化软骨修复甲状软骨缺损。经大体观察发现，人骨髓间充质干细胞修复组与兔骨髓间充质干细胞修复组术区无感染、瘢痕及坏死迹象，植入的工程化软骨无移位及排斥，与周围正常软骨对合良好，空白对照组未形成软骨组织。术后4周和8周，人骨髓间充质干细胞修复组和兔骨髓间充质干细胞修复组Ⅱ型胶原阳性率均显著高于空白对照组。人骨髓间充质干细胞修复组和兔骨髓间充质干细胞修复组间比较，差异无显著性意义。上述结果表明，利用同种异体和异种来源的骨髓间充质干细胞诱导成软骨后进行兔喉软骨缺损修复，均可以获得良好的效果，且二者在修复效果方面基本相当。

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