血红素氧合酶系统对一氧化碳中毒后体外培养少突胶质细胞Nogo-A的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.014

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (2): 230-235.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.014

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血红素氧合酶系统对一氧化碳中毒后体外培养少突胶质细胞Nogo-A的影响

王晓虹¹，王苏平¹，车菊华²，王虹³，王翠¹，汪涛⁴，朱艳玲⁵

大连市中心医院，¹神经内科，³综合病房，⁴康复科，辽宁省大连市 116033；²大连医科大学，辽宁省大连市 116044；⁵大连市第三人民医院神经内科，辽宁省大连市 116033

收稿日期:2015-11-07 出版日期:2016-01-08 发布日期:2016-01-08
通讯作者: 王苏平，硕士，主任医师，大连市中心医院神经内科，辽宁省大连市 116033
作者简介:王晓虹，女，1975年生，黑龙江省佳木斯市人，汉族，2003年大连医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事一氧化碳中毒后迟发性脑病和运动障碍疾病等方面的研究。
基金资助:
大连市卫生局2008年度科研计划项目

Effect of hemeoxygenase system on Nogo-A expression in rat oligodendrocytes in vitro after carbon monoxide poisoning

Wang Xiao-hong¹, Wang Su-ping¹, Che Ju-hua², Wang Hong³, Wang Cui¹, Wang Tao⁴, Zhu Yan-ling⁵

¹Department of Neurology, ³Comprehensive Ward, ⁴Department of Rehabilitation, Dalian Municipal Central Hospital, Dalian 116033, Liaoning Province, China;²Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China; ⁵Department of Neurology, the Third People’s Hospital of Dalian, Dalian 116033, Liaoning Province, China

Received:2015-11-07 Online:2016-01-08 Published:2016-01-08
Contact: Wang Su-ping, Master, Chief physician, Department of Neurology, Dalian Municipal Central Hospital, Dalian 116033, Liaoning Province, China
About author:Wang Xiao-hong, Master, Associate chief physician, Department of Neurology, Dalian Municipal Central Hospital, Dalian 116033, Liaoning Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Health and Family Planning Commission of Dalian Municipality in 2008

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

血红素氧合酶：是血红素降解的限速酶，有3种同工酶，血红素氧合酶1，2，3。血红素氧合酶2和3呈组成型大量表达，可能作为正常细胞内的血红素结合分别而发挥其功能。而血红素氧合酶1属诱导型，广泛分布于哺乳动物多种组织细胞中，可由多种刺激因子诱导表达，如氧化应激、热休克、紫外线照射、缺血再灌注、重金属、细菌脂多糖、细胞因子和NO以及其底物血红素。

少突胶质细胞：是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，包绕神经纤维的轴突而形成髓鞘，对轴突正常快速电传导等功能有重要作用。少突胶质细胞的前体细胞主要来源于前脑的脑室下区。依据抗原表达、形态和功能，少突胶质细胞系可分为先祖细胞、早期少突胶质祖细胞、晚期少突胶质祖细胞、未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞，共2个发育阶段。

背景：鉴于Nogo-A蛋白及其受体NgR分别表达于中枢神经系统的少突胶质细胞与神经元，而一氧化碳中毒迟发性脑病患者颅脑影像学上白质脱髓鞘突出，推测Nogo-A蛋白及NgR系统参与急性一氧化碳中毒脑损害，可能与一氧化碳中毒迟发性脑病关系密切。内源性一氧化碳(CO)是机体重要的气体信使分子之一，主要是由血红素氧合酶代谢产生的，其对Nogo-A体系的影响目前亦未见报道。

目的：采用外源性CO处理体外培养少突胶质细胞，并用锌原卟啉9抑制血红素氧合酶系统活性，观察少突胶质细胞Nogo-A在mRNA及蛋白质水平的表达情况。

方法：将体外培养的少突胶质细胞分为对照组、CO组和锌原卟啉9组。CO组和锌原卟啉9组细胞置于含体积分数1%CO的密封室内培养。锌原卟啉9组细胞在CO处理前，预先在培养液中加入10 μmol/L锌原卟啉9。首先比较培养6，24和48 h时细胞中Nogo-A mRNA和蛋白的表达水平，检测表达水平最高时CO组和锌原卟啉9组细胞中Nogo-A mRNA和蛋白表达水平的差异。

结果与结论：CO组细胞中Nogo-A mRNA和蛋白的表达水平均高于对照组，且都在培养24 h时表达水平最高。培养24 h时锌原卟啉9组细胞中Nogo-A mRNA和蛋白表达水平均高于CO组。提示排除在体情况中一氧化碳中毒所致的缺氧的影响，单纯外源性CO可诱导体外培养少突胶质细胞Nogo-A mRNA及蛋白表达水平增加；血红素氧合酶系统可抑制Nogo-A mRNA及蛋白的表达水平。

ORCID: 0000-0002-2578-2112(王苏平)

关键词: 组织构建, 组织工程, 一氧化碳中毒, 少突胶质细胞, Nogo-A, 血红素加氧酶1, 锌原卟啉9, 聚合酶链反应, 免疫组织化学, 气体信使

Abstract:

BACKGROUND: Cerebral white matter demyelination is outstanding in the images of delayed encephalopathy after acute carbon monoxide (CO) poisoning. Since Nogo-A and Nogo-receptor are expressed in onoligodendrocytes and neurons respectively, we infer that Nogo-A system is involved in brain injury after acute CO poisoning and related to delayed encephalopathy after acute CO poisoning. Endogenous CO is a gaseous messenger, which is the metabolic product of hemeoxygenase. There is no report about the CO effect on Nogo-A system till now.

OBIECTIVE: To in vitro culture oligodendrocytes using endogenous CO, inhibit the activity of hemeoxygenase system using zinc protoporphyrin-IX (ZnPPIX) and observe the variation of Nogo-A in oligodendrocytes at mRNA and protein levels.

METHODS: Rat oligodendrocytes cultured in vitro were divided into control, CO, ZnPPIX groups. Cells in the CO and ZnPPIX groups were treated with 1% CO directly, In the ZnPPIX group, 10 μmol/L ZnPPIX was added into the culture medium before CO treatment. The expressions of Nogo-A mRNA and protein at 6, 24, 48 hours after culture were compared. Differences in the peak levels of Nogo-A mRNA and protein between CO and ZnPPIX groups were detected using RT-PCR and immunohistochemistry respectively.

RESULTS: The expression levels of Nogo-A mRNA and protein were significantly higher in the CO group than the control group and reached the peak at 24 hours of culture. Compared with the CO group, oligodendrocytes cultured with ZnPPIX showed higher expressions of Nogo-A mRNA and protein at 24 hours of culture. These findings suggest that except the influence of hypoxia occurring in CO poisoning, exogenous CO increases the expression of Nogo-A in cultured oligodendrocytes in vitro, and the heme oxygenase system can inhibit the expression of Nogo-A mRNA and protein.

王晓虹，王苏平，车菊华，王虹，王翠，汪涛，朱艳玲. 血红素氧合酶系统对一氧化碳中毒后体外培养少突胶质细胞Nogo-A的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(2): 230-235.

Wang Xiao-hong, Wang Su-ping, Che Ju-hua, Wang Hong, Wang Cui, Wang Tao, Zhu Yan-ling. Effect of hemeoxygenase system on Nogo-A expression in rat oligodendrocytes in vitro after carbon monoxide poisoning[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(2): 230-235.

图/表（结果） 3

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引言

急性一氧化碳中毒是较常见的职业性及生活性中毒，可造成中枢神经系统损伤^[1]。部分患者急性中毒症状消失以后，经过数天或数周表现正常或接近正常的假愈期，会出现以痴呆为主的精神神经症状称为一氧化碳中毒迟发性脑病，一氧化碳中毒迟发性脑病患者颅脑影像学上白质脱髓鞘显著^[2]。由于假愈期的存在，很难早期准确判断一氧化碳中毒迟发性脑病的发生，给有效防治带来困难，给社会、家庭造成很大负担^[3]。

勿动蛋白(Nogo-A蛋白)是神经元轴突生长抑制因子之一，主要表达于中枢神经系统的少突胶质细胞，已经证实Nogo-A可触发神经轴突抑制、生长锥崩溃、阻止神经纤维散布^[4-5]，其受体NgR广泛分布于多种神经元上，胶质细胞间的隙缝连接处，但少突胶质细胞本身没有NgR分布^[6]。鉴于Nogo-A蛋白及NgR的分布特点，以及一氧化碳中毒迟发性脑病患者颅脑影像学上白质脱髓鞘突出，因此作者推测Nogo-A蛋白及NgR系统参与急性一氧化碳中毒脑损害，可能与一氧化碳中毒迟发性脑病关系密切。

内源性一氧化碳(CO)是重要的气信使分子之一，具有传递细胞间信息、调节细胞功能的作用，血红素氧合酶是体内合成内源性CO的惟一酶系统，可以降解血红素生成等量的CO、胆绿素和Fe²⁺，三者在体内表现出不同的病理生理作用^[7]。体内及体外实验均证实CO可导致神经细胞血红素氧合酶1 mRNA及其蛋白表达增加^[8]，并与神经细胞凋亡有关^[8-9]，这与在缺血缺氧性脑病中所观察到的结果相类似^[10-11]，这是由于外源性CO与血红蛋白结合后所导致的机体缺氧是导致急性期脑损害的主要病理生理基础^[1]，但一氧化碳中毒性脑损害区别于缺血缺氧性脑病最主要的病理生理机制是CO的存在，这应该是一氧化碳中毒后部分患者会出现迟发性脑病，而缺血缺氧性脑病无此现象的原因，但具体机制不清。作为与内源性CO具有相同分子结构的外源性CO在体内是否与内源性CO具有相同的作用目前尚未见报道。

实验在排除缺氧影响的条件下，以锌原卟啉9抑制血红素氧合酶活性^[12]，阻止内源性CO，胆绿素与Fe²⁺生成，采用外源性CO直接处理体外培养少突胶质细胞，模拟内源性CO气体信使，观察其诱导的少突胶质细胞Nogo-A在mRNA及蛋白质水平的表达变化，以期探讨Nogo-A及血红素氧合酶/CO系统在急性一氧化碳中毒脑损害和一氧化碳中毒迟发性脑病中可能存在的病理生理机制。

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点实验于2008年9月至2009年9月在大连市中心医院中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：新生2 d，SPF级SD大鼠108只，由大连医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(辽)2008-0002。实验符合动物伦理学的要求。

1.4 方法

1.4.1 大鼠视神经少突胶质细胞培养^[13] 取新生大鼠视神经，以0.125%胰酶消化3-5 min后移入涂有多聚赖胺酸的培养皿中，加入基础培养液[含体积分数5%胎牛血清(美国Sigma公司)的DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)]约400 μL，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱(日本SANYO Electric CO.Ltd公司)中培养，第4天更换化学限定培养液[含有100 mg/L转铁蛋白(美国Sigma公司)、0.4 mg/L甲状腺素(美国Sigma公司)、40 μg/L亚硒酸钠(美国Sigma公司)、16.2 mg/L腐胺(美国Sigma公司)、0.3%谷氨酰胺(美国Sigma公司)；0.62 mg/L黄体酮、23.4 U/L胰岛素及体积分数0.5%胎牛血清的DMEM/F12培养基]A约400 μL，每周更换培养液2次。约第10天时，更换为化学限定培养液B(不含胎牛血清，其余成分与化学限定培养液A相似)约600 μL，第11天时经髓鞘碱性蛋白免疫细胞化学染色证实90%以上为髓鞘碱性蛋白阳性细胞。

1.4.2 细胞分组将培养的细胞分为对照组、CO组与锌原卟啉9组。对照组细胞正常培养；CO组和锌原卟啉9组细胞置于含体积分数1%CO的密封室内，培养过程中监测并维持室内CO浓度为10 000 pm。锌原卟啉9组细胞在CO处理前，预先在培养液中加入10 μmol/L锌原卟啉9(美国Sigma公司)^[8]。

1.4.3 反转录PCR测定Nogo-A mRNA表达各组按所需处理的时间终止培养，培养皿中加入Trizol将细胞消化，常规提取总RNA。应用紫外分光光度计(瑞典Amersham- pharmaciaBitech公司)进行测定260和280 nm处的吸光度度比值，计算总RNA含量和纯度> 1.8；琼脂糖凝胶电泳可见完整18 S和 28 S两条带，表明总RNA完整未降解。取250 ng总RNA按反转录试剂盒(大连TaKaRa生物公司)说明书将总RNA反转录为cDNA，而后加入Nogo-A、β-actin上下游引物进行PCR反应。引物由大连TaKaRa生物公司合成。Nogo-A引物序列^[14]：上游为 5’-GTC CTG CTT GAA ACT GCT-3’，下游为5’-CTT TCG GTT GCT GAG GTA-3’，长度为713 bp。β-actin引物序列：上游为5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC A-3’，下游为5’-CAT CTC TTG CTC GAA GTC-3’，长度为318 bp。反应条件为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性 30 s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸60 s，29个循环，后72 ℃延伸10 min。取PCR反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶分析系统仪(美国Labworks公司)分析Nogo-A及β-actin的吸光度值，计算Nogo-A与β-actin积分吸光度的比值，作为Nogo-A mRNA的表达水平。实验重复3次，设2个平行皿。

1.4.4 细胞免疫化学检测Nogo-A表达各组按所需处理的时间终止培养，按照SABC试剂说明进行原位细胞免疫化学染色。一抗为1∶100 Nogo-A抗体，苏木精复染，乙醇脱水，体积分数50%无水乙醇、50%甘油封闭培养皿。200倍显微镜(德国LEICA公司)下每个培养皿取4个视野拍照，用Imagepro-Plus4.5软件(美国Media Cybernetics公司)测定阳性细胞染色的累积吸光度，计算平均值。实验重复3次，设2个平行皿。

1.5 主要观察指标细胞中Nogo-A mRNA和蛋白表达水平。

1.6 统计学分析数据以x(_)±s表示。应用SPSS 13.0统计软件包，组间比较采用单因素方差分析方差分析和t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

中枢神经系统髓鞘由成熟少突胶质细胞形成，未成熟的少突胶质细胞无形成髓鞘的能力[18-19]。未成熟的少突胶质细胞可与神经元及神经轴突接触，但成熟的少突胶质细胞才是神经元轴突生长的抑制性底物。当生长锥与成熟少突胶质细胞相遇时，少突胶质细胞通过丝状伪足与其接触，迅速持久地诱导生长锥活动停滞和生长锥结构坍塌[20]。中枢神经系统损伤时，少突胶质细胞前驱细胞(O-2A)迅速聚集在受损伤部位，这些细胞产生多种轴突生长抑制蛋白以及抑制分子，阻碍中枢神经系统再生[17]。目前已知轴突再生抑制蛋白包括Nogo-A、髓鞘相关性糖蛋白、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白等[18]，其中Nogo-A目前被认为是关键因素之一[20-21]，在中枢神经系统髓鞘的少突胶质细胞中高表达，外周神经系统许旺细胞不表达[17]。有研究发现Nogo-A在神经元上也有一定的表达，可能与损伤后修复有关[22-23]。
绝大多数的研究表明Nogo-A对中枢神经系统以负向调节作用为主，导致不可逆性的损伤。Nogo-A具有2个抑制性功能结构域，一个是位于细胞表面的跨膜环状结构域称为Nogo-66，可与神经元细胞膜表面NgR结合，抑制神经元轴突生长；另一个是较长的氨基端区域(amino-Nogo)，定位于细胞内，仅在髓鞘破坏后才能发挥作用，目前尚不清楚amino-Nogo结构域的受体[24]，但amino-Nogo片段作用更为广泛，除可阻断神经元轴突生长外，还抑制非神经细胞的伸展和迁移[25]。新近的研究表明Nogo-A还可以作用于其它的受体，如S1PR2，PirB，通过激活不同的信号传导通路来稳定神经网络，可能与记忆痕迹的维持有关[26]。
Nogo-A在少突胶质细胞上的表达是随时间变化的，在O-2A细胞上有强表达，待少突胶质细胞逐渐成熟，Nogo-A的表达逐渐减少，少突胶质细胞成熟后Nogo-A的表达将维持一个较稳定的水平，当少突胶质细胞衰老时，Nogo-A的活性减弱[27]。体外培养少突胶质细胞10 d左右细胞成熟，其状态持续7 d左右，随后细胞经历10 d左右衰老死亡[28]。实验在11-13 d进行检测，此时细胞成熟、状态稳定[13]。
动物实验研究表明，在CO中毒大鼠中枢神经系统髓鞘碱性蛋白表达减少[29-30]，提示CO中毒存在脱髓鞘改变。孙瑞佼等[31]研究证实，大鼠少突胶质细胞的数量随着CO中毒损伤时间的延长而逐渐减少，且细胞形态发生改变，细胞突起增生、肥大，与星形胶质细胞的激活相似。提示在CO中毒损伤过程中，神经元轴突髓鞘损伤，导致少突胶质细胞减少，但剩余少突胶质细胞则被激活。在本实验中，体外CO处理少突胶质细胞，6 h左右Nogo-A无论mRNA还是蛋白质表达均明显升高，24 h达高峰，48 h虽有所下降，但仍持续高水平，也证实了CO可使少突胶质细胞进入活跃的功能状态，提高Nogo-A的转录水平，进而增加Nogo-A蛋白质的表达[32]。由此推测CO中毒后，中枢神经系统髓鞘的少突胶质细胞有一部分受到损伤，另一部分可被激活。受到损伤的少突胶质细胞，释放细胞内的amino-Nogo抑制神经修复，被激活的少突胶质细胞则通过增加Nogo-A蛋白质的表达而发挥抑制作用，进而参与了急性一氧化碳中毒脑损害及一氧化碳中毒迟发性脑病的发生。
血红素氧合酶可以降解血红素生成等量的CO、胆绿素和Fe2+。内源性CO是气体信使分子，通过激活可溶性鸟苷酸环化酶发挥作用。在生理状态下，通过扩散以自分泌、旁分泌作用于自身或邻近细胞，在神经元信息传递中起着重要作用[12]；胆绿素作为强效的抗氧化剂在被还原酶还原成胆红素过程中对细胞起保护作用[33]；Fe2+再进入新的血红素形成循环。血红素氧合酶系统在维持和调节正常及应激状态下机体内环境稳定和代谢平衡中起重要作用，多认为这一反应是对抗氧化应激的代偿机制，对细胞起保护作用。在各种类型的损伤中如缺血、缺氧、炎症等情况下，都观察到血红素加氧酶的诱导表达[34]。Panahian等[35]比较过度表达诱导型血红素氧合酶1的转基因鼠与非转基因小鼠的大脑中动脉栓塞模型发现，转基因鼠的脑梗死体积较小，脑水肿较轻。Bidmon等[36]发现结构型血红素氧合酶2基因敲除的神经元更易受神经毒性损伤。但细胞中血红素氧合酶的保护作用是有阈值的，血红素氧合酶在活性增加5倍以上时，产生大量的Fe2+却可成为氧化剂的前身[37]。
一氧化碳中毒脑损害与缺血缺氧性脑病有相类似的病理生理基础，但由于CO的存在又使其有所区别于缺血缺氧性脑病。作者在一氧化碳中毒迟发性脑病小鼠海马区发现血红素氧合酶1 mRNA及其蛋白表达增加，并与神经细胞凋亡相关[9]，作者在体外研究中也发现外源性给予的CO可诱导大鼠星型胶质细胞血红素氧合酶1蛋白表达，血红素氧合酶活性增强；可诱导星型胶质细胞出现早期凋亡，但以血红素氧合酶抑制剂锌原卟啉9作为研究工具发现血红素氧合酶对CO引起的细胞早期凋亡有保护作用[8]。实验继而观察了单纯缺氧对PC12细胞的影响，发现内源性CO(在一定程度上也反映了血红素氧合酶的活性)与PC12细胞凋亡相关[38]，以上实验也表明血红素氧合酶作为一种应激性的蛋白，在机体或细胞受损时表达及活性增加，其本身并不导致凋亡的增加，而是起到保护作用，减少凋亡的发生，但在实验系统中，保护能力有限，不能完全阻止凋亡的发生。本实验以Nogo-A为目标分子，观察到了同样的规律：外源性CO诱导Nogo-A mRNA及蛋白表达上调，进而抑制神经元轴突生长，导致神经功能缺损，而血红素氧合酶可降低Nogo-A mRNA及蛋白表达的上调作用。由于Nogo-A mRNA与其蛋白质水平变化具有一致性，存在有线性关系，提示CO是在mRNA水平调节Nogo-A蛋白质的表达[32]。
本实验拟采用外源性的CO模拟内源性CO对少突胶质细胞的影响，但由于外源性CO本身即对产生内源性CO的血红素氧合酶系统存在影响[8]，同时，血红素氧合酶的产物多样，作用不一，使得观察体系复杂化，难以获得确切的结论；此外，CO在水中的溶解度非常小，0 ℃，1个大气压下为1∶0.035 37(体积比)，培养液中的CO浓度远远小于细胞局部瞬时所产生的内源性CO[38-39]，因此，尽管外源性CO与内源性CO在化学上属于同一种物质，但不同浓度是否可能会表现出不同的病理生理作用仍值得进一步探讨。由于少突胶质细胞培养相对困难，本实验未使用少突胶质细胞来探索锌原卟啉9使用的最佳浓度，即对细胞生长影响程度最小的最大锌原卟啉9浓度，而是采用了既往在PC12细胞上所测得的锌原卟啉9的最佳浓度[8]，可能会对实验有所影响，为本文的不足之处。

血红素氧合酶系统对一氧化碳中毒后体外培养少突胶质细胞Nogo-A的影响

Effect of hemeoxygenase system on Nogo-A expression in rat oligodendrocytes in vitro after carbon monoxide poisoning

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