骨桥蛋白及其受体在黄韧带骨化症黄韧带细胞中的表达及其意义

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.005

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (2): 179-184.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.005

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骨桥蛋白及其受体在黄韧带骨化症黄韧带细胞中的表达及其意义

许政，周盛源，李学斌，刘晓东，陈雄生，王智清

解放军第二军医大学附属上海长征医院脊柱三科，上海市 200003

收稿日期:2015-11-16 出版日期:2016-01-08 发布日期:2016-01-08
通讯作者: 陈雄生，博士，主任医师，解放军第二军医大学附属长征医院脊柱三科，上海市 200003
作者简介:许政，男，1989年生，山东省青岛市人，汉族，2015年解放军第二军医大学毕业，硕士，主要从事脊柱外科方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81171753)

Expression and role of osteopontin and its receptors in ligmentum flavum cells derived from patients with ossification of ligamentum flavum

Xu Zheng, Zhou Sheng-yuan, Li Xue-bin, Liu Xiao-dong, Chen Xiong-sheng, Wang Zhi-qing

Third Department of Spinal Surgery, Shanghai Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China

Received:2015-11-16 Online:2016-01-08 Published:2016-01-08
Contact: Chen Xiong-sheng, M.D., Chief physician, Third Department of Spinal Surgery, Shanghai Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
About author:Xu Zheng, Master, Third Department of Spinal Surgery, Shanghai Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171753

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

骨桥蛋白：1979年Senger等首次报道一种与恶性转化有关的包含精-甘-门冬氨酸整合素结合区的磷酸化糖蛋白，称之为转化相关性磷酸蛋白。后来Franzen等从骨组织中分离出一种磷酸蛋白，其特性与Senger等发现的磷酸蛋白相似，因其是细胞在骨基质中的产物，并能在细胞与基质中的矿质形成一种桥连，人们将其命名为骨桥蛋白。

黄韧带骨化症：脊椎黄韧带骨化症与脊椎黄韧带钙化症究竟是同一种疾患，还是两种不同的疾患，目前意见尚不统一。尤其是对发生于颈椎病的病例，多主张是两种疾病。专家们认为，前者多见于男性，除脊柱外，全身其他部位无骨化征，且易与硬膜及椎板粘连；而后者则多见于女性，全身其他部位可发现钙化征，且与硬膜及椎板不粘连、无延续性；主张两者是同一疾患者认为：两者的基本病理改变相似，且十分少见钙化，因而应将其视为同一病变的不同发展阶段。作者认为，从临床诊断及治疗学的观点来看，两者并非一定需要区分，尤其是在当前各持己见的情况下，治疗上，临床医师仍应以能够为患者解除痛苦为基本原则。

背景：黄韧带骨化症的机制尚不明确，骨桥蛋白可能是其骨化过程中重要的影响因素。

目的：观察骨桥蛋白及其受体CD44、整合素β3在人黄韧带细胞及人骨化黄韧带细胞中的表达及其意义。

方法：胸/腰椎后路减压术中取人骨化节段黄韧带组织和非黄韧带骨化黄韧带组织各8例，均来自成人，两组组织进行体外细胞分离、培养及鉴定，分别行骨桥蛋白、CD44、整合素β3免疫组织化学染色，用倒置相差显微镜观察结果，提取总RNA行半定量PCR检测。

结果与结论：免疫细胞化学染色结果显示，黄韧带组织组中骨化节段黄韧带细胞骨桥蛋白、CD44、整合素β3表达强度均大于非黄韧带骨化组(P < 0.01)。PCR检测结果显示，黄韧带组织组中骨化节段黄韧带细胞骨桥蛋白、CD44、整合素β3 mRNA表达强度明显强于非黄韧带骨化组(P < 0.05)。结果表明，黄韧带骨化时黄韧带细胞中骨桥蛋白及其受体CD44、整合素β3基因表达均升高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-6471-3515(陈雄生)

关键词: 组织构建, 组织工程, 肌肉肌腱韧带, 骨桥蛋白, CD44, 整合素&beta, 3, 黄韧带细胞, 黄韧带骨化症, 原代培养, 细胞鉴定, 免疫荧光染色, PCR, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The exact pathogenesis of ossification of ligamentum flavum has not been elucidated yet. And osteopontin may be an important factor involved in the ossification of ligamentum flavum.
OBJECTIVE: To clarify the expression and significance of osteopontin and its receptors, CD44 and integrin-β3, in ligamentum flavum cells between normal controls and patients with ossification of ligamentum flavum.

METHODS: Ligamentum flavum tissues were obtained from normal adult controls and adult patients with ossification of ligamentum flavum (n=8 per group) who underwent thoracic/lumbar posterior decompression surgery. Ligmentum flavum cells were separated, cultured and identified in vitro, and osteopontin, CD44, integrin-β3 were stained using immunocytochemistry method and observed under inverted phase contrast microscope. And the mRNA expressions of osteopontin, CD44, integrin-β3 were measured by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Immunocytochemistry results showed that the stronger positive staining for osteopontin, CD44, integrin-β3 was observed in the ossification of ligamentum flavum group than the control group (P < 0.01). The mRNA expressions of osteopontin, CD44 and integrin-β3 were also higher in the ossification of ligamentum flavum group than the control group (P < 0.05). These findings indicate that osteopontin and its receptors, CD44 and integrin-β3, in ligamentum flavum cells may play an important role in ossification of ligamentum flavum.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

许政，周盛源，李学斌，刘晓东，陈雄生，王智清. 骨桥蛋白及其受体在黄韧带骨化症黄韧带细胞中的表达及其意义[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(2): 179-184.

Xu Zheng, Zhou Sheng-yuan, Li Xue-bin, Liu Xiao-dong, Chen Xiong-sheng, Wang Zhi-qing. Expression and role of osteopontin and its receptors in ligmentum flavum cells derived from patients with ossification of ligamentum flavum[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(2): 179-184.

图/表（结果） 3

2.1 黄韧带细胞的鉴定结果实验共分离16株黄韧带细胞，黄韧带骨化组和非黄韧带骨化组各8株。采用组织块贴壁培养法分离细胞。黄韧带组织在12-21 d时开始有细胞迁移出，黄韧带骨化组平均迁移出时间为(14.5±3.0) d，而非黄韧带骨化组平均迁移出时间为(12.4±1.8) d，两组差异无显著性意义。黄韧带细胞大小不一，胞质透亮，形态以纤维细胞梭形、纺锤形为主，也有部分呈多角形和椭圆形，原代细胞自组织块迁移出早期呈散在分布，随后逐渐生长密集，并以组织块为中心，呈辐射状向外生长，待与其他组织块中迁移出的细胞交会时，则呈涡旋状生长。黄韧带骨化组细胞中呈多角形和椭圆形的细胞比非黄韧带骨化组多，并可见散在小结节分布(图1)。

为了确定分离出的细胞是否为黄韧带细胞，文章尝试通过细胞分化来源对细胞进行鉴定，在此次实验中，两组细胞的Ⅰ型胶原蛋白和波动蛋白均呈阳性(图2)。

2.2 各组黄韧带细胞骨桥蛋白、CD44及整合素β3表达变化通过前述实验，文章已经发现在骨化组织中骨桥蛋白及其受体表达增高[11]，为了检测这种表达增高是否来源于黄韧带细胞，文章对黄韧带细胞进行了细胞化学染色和PCR检测。
实验通过在镜下观察两组细胞的免疫细胞化学染色结果。黄韧带骨化组中骨桥蛋白、CD44、整合素β3染色均以深棕色为主，而非黄韧带骨化组的黄韧带细胞中骨桥蛋白染色呈蓝色，CD44、整合素β3则可见部分散在黄染细胞(图3)。根据半定量分析确定每一样本各指标的表达强度，ridit等级分析显示，黄韧带骨化组中骨桥蛋白、CD44、整合素β3表达强度均大于非黄韧带骨化组(P < 0.01)，呈明显阳性(表1)。经PCR检测发现，黄韧带骨化组的骨桥蛋白、CD44、整合素β3 mRNA表达较非黄韧带骨化组均显著增高(P < 0.05；图4)。

参考文献

[1] Ahn DK, Lee S, Moon SH, et al. Ossification of the ligamentum flavum. Asian Spine J. 2014;8(1):89-96.

[2] Gao R, Yuan W, Yang L, et al. Clinical features and surgical outcomes of patients with thoracic myelopathy caused by multilevel ossification of the ligamentum flavum. Spine J. 2013;13(9):1032-1038.

[3] Fong SY, Wong HK. Thoracic myelopathy secondary to ligamentum flavum ossification. Ann Acad Med Singapore. 2004;33(3):340-346.

[4] Jia LS, Chen XS, Zhou SY, et al. En bloc resection of lamina and ossified ligamentum flavum in the treatment of thoracic ossification of the ligamentum flavum. Neurosurgery. 2010; 66(6):1181-1186.

[5] Zaki SM. Study of the human ligamentum flavum in old age: a histological and morphometric study. Folia Morphol (Warsz). 2014;73(4):492-499.

[6] Klosinski M, Skrzat J, Walocha J, et al. Contemporary views on the ossification of the ligamenta flava. Ortop Traumatol Rehabil. 2012;14(6):495-503.

[7] Kim YH, Khuyagbaatar B, Kim K. Biomechanical effects of spinal cord compression due to ossification of posterior longitudinal ligament and ligamentum flavum: a finite element analysis. Med Eng Phys. 2013;35(9):1266-1271.

[8] Ren L, Hu H, Sun X, et al. The roles of inflammatory cytokines in the pathogenesis of ossification of ligamentum flavum. Am J Transl Res. 2013;5(6):582-585.

[9] Fan D, Chen Z, Chen Y, et al. Mechanistic roles of leptin in osteogenic stimulation in thoracic ligament flavum cells. J Biol Chem. 2007;282(41):29958-29966.

[10] Ono K, Yonenobu K, Miyamoto S, et al. Pathology of ossification of the posterior longitudinal ligament and ligamentum flavum. Clin Orthop Relat Res. 1999;(359):18-26.

[11] Wiseman DB, Stokes JK, Toselli RM. Paraparesis in a black man brought on by ossification of the ligamentum flavum: case report and review of the literature. J Spinal Disord Tech. 2002;15(6):542-545.

[12] Pascal-Moussellard H, Cabre P, Smadja D, et al. Symptomatic ossification of the ligamentum flavum: a clinical series from the French Antilles. Spine (Phila Pa 1976). 2005; 30(14):E400-E405.

[13] Tokala DP, Lam KS, Prince HG. Ossification of the proximal thoracic ligamenta flava causing acute myelopathy in a Caucasian: case report and literature review. Spinal Cord. 2007;45(4):310-313.

[14] Kim HN, Min WK, Jeong JH, et al. Combination of Runx2 and BMP2 increases conversion of human ligamentum flavum cells into osteoblastic cells. BMB Rep 2011;44(7):446-451.

[15] Liu Y, Zhao Y, Chen Y, et al. RUNX2 polymorphisms associated with OPLL and OLF in the Han population. Clin Orthop Relat Res 2010;468(12):3333-3341.

[16] 陈雄生,贾连顺,倪斌,等.重组人骨形态发生蛋白-2诱发黄韧带骨化的实验模型[J].中国脊柱脊髓杂志,2002,12(1):31-34.

[17] Kong Q, Ma X, Li F, et al. COL6A1 polymorphisms associated with ossification of the ligamentum flavum and ossification of the posterior longitudinal ligament. Spine (Phila Pa 1976) 2007;32(25):2834-2838.

[18] Cai HX, Yayama T, Uchida K, et al. Cyclic tensile strain facilitates the ossification of ligamentum flavum through beta-catenin signaling pathway: in vitro analysis. Spine (Phila Pa 1976). 2012;37(11):E639-E646.

[19] Braddock R, Siman CM, Hamilton K, et al. Gamma-linoleic acid and ascorbate improves skeletal ossification in offspring of diabetic rats. Pediatr Res. 2002;51(5):647-652.

[20] Wang Z, Li XD, Li MQ, et al. Changes in basic metabolic elements associated with the degeneration and ossification of ligamenta flava. J Spinal Cord Med. 2008;31(3):279-284.

[21] Hunter GK. Role of osteopontin in modulation of hydroxyapatite formation. Calcif Tissue Int. 2013;93(4): 348-354.

[22] Morinobu M, Ishijima M, Rittling SR, et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. J Bone Miner Res. 2003;18(9):1706-1715.

[23] 张宇,吴少鹏,夏雄智,等.人黄韧带细胞体外原代培养方法的比较[J].广东医学,2011,(13):1668-1671.

[24] 王哲,许汉鹏,罗卓荆,等.胸椎黄韧带骨化患者黄韧带细胞的体外培养及初步鉴定[J].中华骨科杂志,2007;27(9):705-710.

[25] Hirota S, Asada H, Kohri K, et al. Possible role of osteopontin in deposition of calcium phosphate in human pilomatricomas. J Invest Dermatol. 1995;105(1):138-142.

[26] Rangaswami H, Bulbule A, Kundu GC. Osteopontin: role in cell signaling and cancer progression. Trends Cell Biol. 2006; 16(2):79-87.

[27] Franzen A, Heinegard D. Isolation and characterization of two sialoproteins present only in bone calcified matrix. Biochem J. 1985;232(3):715-724.

[28] Sodek KL, Tupy JH, Sodek J, et al. Relationships between bone protein and mineral in developing porcine long bone and calvaria. Bone. 2000;26(2):189-198.

[29] Chen Q, Shou P, Zhang L, et al. An osteopontin-integrin interaction plays a critical role in directing adipogenesis and osteogenesis by mesenchymal stem cells. Stem Cells. 2014; 32(2):327-337.

[30] Hynes RO. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell.1992;69(1):11-25.

[31] Wu X, Mogford JE, Platts SH, et al. Modulation of calcium current in arteriolar smooth muscle by alphav beta3 and alpha5 beta1 integrin ligands. J Cell Biol. 1998;143(1): 241-252.

[32] Lakemeier S, Schmid R, Foltz L, et al. Increased expression of CD44 in hypertrophied ligamentum flavum and relevance of splice variants CD44v5 and CD44v6. Acta Neurochir (Wien). 2012;154(2):359-365.

引言

黄韧带骨化症是发生在脊柱黄韧带的异位骨化病变^[1]，多发于下胸椎^[2]。黄韧带骨化物常常压迫硬膜囊，造成脊髓不同程度损伤^[3]，严重者可致使下肢永久性瘫痪。黄韧带骨化症发病机制尚不清楚，目前尚无有效的药物治疗方法，手术治疗是惟一有效的手段^[4]，但手术风险大，效果并不令人十分满意。目前越来越多的学者开始研究黄韧带骨化的机制，而相关因子也不鲜报道。

目前黄韧带骨化发生机制有很多不同的假说，年龄、人种、遗传因素、局部应力、细胞因子、内分泌与代谢等都可能与其有关^[1^，^5-9]。黄韧带骨化多发于老年人，且脊柱韧带是老年人迁移性钙化最常发生的组织^[10]。在发病人群中，东亚人被报道最多见，而高加索人、加勒比人和黑人也有少量病例被报道^[11-13]。骨形态发生蛋白基因、胶原基因、核心结合因子基因等多种基因都被认为与黄韧带骨化症的发生有关^[14-17]。Cai等^[18]通过体外实验证实牵张力作用于黄韧带细胞可以促进其骨化进程。转换生长因子β2、骨形态发生蛋白2、Runt相关转录因子2等多种因子均被认为与黄韧带骨化症有着密切的关系^[14-17]。胰岛素样生长因子、瘦素以及某些微量元素的代谢变化都可能会引起黄韧带骨化症的发生^[9^，^19-20]。由此看出，黄韧带骨化可能的诱发因素有很多，但是钙盐沉积这个过程是共同的。骨桥蛋白作为一个介导细胞附着到骨基质的一个重要因子，被多项研究证明在异位骨化形成中表达升高^[21-22]。因而实验提出骨桥蛋白可能在黄韧带骨化中起重要的作用。然而骨桥蛋白在黄韧带骨化症发生过程中的表达和作用目前尚无研究。

实验旨在观察骨桥蛋白及其受体CD44、整合素β3在人正常黄韧带细胞及人骨化黄韧带细胞中的表达，为进一步研究骨桥蛋白在人黄韧带骨化过程中的作用提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验。

1.2 时间及地点于2014年1至12月在上海长征医院骨科研究所及长征医院转化医学中心完成。

1.3 材料实验黄韧带标本共计16个，均取自上海长征医院骨科医院脊柱外科，标本来源均系成人，分为黄韧带骨化组和非黄韧带骨化组，每组各8例。黄韧带骨化组患者年龄42-52岁，平均(50.13±7.57)岁；非黄韧带骨化组中患者年龄32-61岁，平均(48.88±9.67)岁。

黄韧带骨化组纳入标准：患者诊断为黄韧带骨化症，CT上黄韧带区域可见高密度影，并有脊髓压迫症状需手术治疗。

黄韧带骨化组排除标准：黄韧带区域或周围有感染、结核、肿瘤等其他病变。

非黄韧带骨化组纳入标准：患者诊断为胸腰椎间盘突出症或胸腰椎椎骨折患者，CT上黄韧带区域未见黄韧带区域高密度影，术中见黄韧带完好无损伤。

非黄韧带骨化组排除标准：黄韧带区域或周围有骨化、感染、结核、肿瘤等病变；黄韧带撕裂受损。

标本的获取及实验目的均已向患者及家属告知并获得同意，研究相关内容经解放军第二军医大学伦理部门审核并批准。

1.4 实验方法

1.4.1 黄韧带标本的获取术中取得标本后无菌条件下以生理盐水冲洗，并以眼科剪去除非韧带组织，将标本移入盛满生理盐水的25 mL无菌培养瓶中，用冰盒转移到实验室。

1.4.2 细胞分离与培养采用组织块贴壁法分离黄韧带细胞。将黄韧带组织切成约1 mm³的碎块，均匀铺于10 cm的培养皿中，以体积分数10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，0.1 g/L链霉素配制的DMEM培养液作为培养基(Gibco公司)，在条件为体积分数5%CO₂，95%空气，恒温37 ℃的培养箱中培养^[9^，^18]。待细胞达到80%融合时传代。

1.4.3 免疫细胞化学染色将黄韧带细胞以5×10⁴个/孔的浓度种于铺有盖玻片的6孔板中，至细胞浓度约60%融合时，PBS冲洗3次，再以40 g/L中性多聚甲醛固定15 min，体积分数0.3% Triton X-100作用30 min，体积分数3% BSA封闭30 min、加入骨桥蛋白抗体(1∶100)、CD44抗体 (1∶100)和整合素β3抗体(1∶50)，4 ℃过夜。吸取一抗，加入HRP标记二抗，室温孵育50 min；PBS漂洗，DAB显色，Harris苏木精复染，中性树胶封固。阳性细胞计数采用半定量分析法：阴性(-)：细胞无黄色染色；阳性(+)：少量散在黄染细胞；强阳性(++)：大量棕黄色细胞。

1.4.4 免疫荧光染色将黄韧带细胞以5×10⁴个/孔的浓度种于铺有盖玻片的六孔板中，培养至细胞约60%融合时，以PBS冲洗3次，再以40 g/L中性多聚甲醛固定15 min，体积分数0.3% Triton X-100作用30 min，体积分数3%BSA封闭30 min、加入Ⅰ型胶原抗体(1∶200)和波形蛋白抗体(1∶100)，4 ℃过夜。加入HRP标记的相应荧光二抗，常温下孵育40 min，甘油封固，荧光显微镜观察结果。阴性为无荧光或仅有微量荧光，阳性为可见明亮荧光。

1.4.5 RT-PCR测定收集分组细胞后以Trizol裂解细胞并提取总RNA，进行cDNA反转录及RT-PCR检测。RT-PCR体系如下：DNA样品溶液1 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTP 1.0 μL (10 mmol/L)，共计25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共30个循环，最后72 ℃延伸7 min。结果用目的基因与β-actin基因的灰度比值表示。

1.5 主要观察指标 ①黄韧带骨化组及非黄韧带骨化组细胞迁出及生长情况。②Ⅰ型胶原蛋白和波动蛋白的免疫荧光染色结果。③两组细胞骨桥蛋白、CD44、整合素β3的免疫组织化学染色和mRNA表达的结果及差异。

1.6 统计学分析计量资料用x(_)±s表示，应用SPSS 19.0软件进行数据分析，两组黄韧带细胞骨桥蛋白、CD44、整合素β3染色表达强度差别用Ridit等级分析，qPCR产物电泳图灰度分析结果结果符合正态分布，用两样本t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

黄韧带骨化症的发生有许多假说，其机制目前尚未被阐明。以往研究中多着眼于黄韧带骨化症的启动因素，如遗传因素^[6]、应力^[7]、糖代谢等均会在不同程度上诱发或加快黄韧带骨化的进程^[9]。但是，启动因素多种多样，最终黄韧带骨化的发生是一个多因素综合的结果。

黄韧带骨化机制研究中，细胞的分离和培养是很重要的。而黄韧带中纤维和胶原成分高，细胞成分少^[23]，所以快速有效地从组织块中分离出细胞对于黄韧带骨化的相关研究有着重要意义。实验采用了组织块贴壁培养法来进行原代细胞的分离^[18]。张宇等^[23]曾比较组织块法、酶消化法及胶原酶消化加组织块法，并认为胶原酶消化加组织块法是人黄韧带细胞原代培养的最佳方法。但在预实验过程中，酶消化后传代细胞往往增殖速度会减慢，细胞形态发生肥大、多边形变等变化，因而实验依然采用了组织块培养法，并获得了稳定的黄韧带细胞。王哲等^[24]在原代培养中发现，骨化组黄韧带细胞比正常组黄韧带细胞的增殖速度快。而实验在观察原代细胞爬出时间中发现，虽然两组黄韧带细胞爬出时间的差别无显著性意义，但黄韧带骨化组织块中的黄韧带细胞爬出时间较长，这可能与取材有关。黄韧带骨化组织常非骨化的黄韧带部分较少，而非黄韧带骨化的黄韧带组织常可以获得较完整的组织块。

黄韧带由胚胎期的中胚层间叶组织分化而来，黄韧带细胞也保留了间叶细胞来源的许多特征。Ⅰ型胶原是成纤维细胞的主要细胞外基质。波动蛋白是间叶细胞主要的细胞骨架，因此，它常被认为是间叶来源细胞的标记物。由此，除形态学观察外，实验采用Ⅰ型胶原蛋白和波动蛋白检测来作为黄韧带细胞特异性蛋白，并行鉴定^[21]。而由于免疫荧光细胞化学的特异性、快速性以及在细胞水平定位的敏感性和准确性，它常被用于细胞表型的鉴定。在此次实验中，原代细胞的Ⅰ型胶原蛋白和波动蛋白均呈阳性，结合以梭形和纺锤形为主的成纤维细胞样形态，基本可以确认分离出的细胞为黄韧带细胞^[25]。

骨桥蛋白是人体内骨矿代谢过程中的重要因子，是一种相对分子质量44 000的分泌型磷酸化糖蛋白^[26]，最早于1985由Franzen等^[27]在骨基质中分离而得，被认为是参与骨基质矿化和重吸收的重要因子。骨桥蛋白主要通过介导细胞与骨基质的结合，来参与体内骨重塑，是骨矿形成过程中重要的因子。而在异位骨化形成的早期，骨桥蛋白即会升高，并沉积在骨化明显的区域^[25]，Morinobu等^[22]在小鼠颅骨缝成骨过程中，骨桥蛋白缺失会影响骨生成。骨桥蛋白作为带负电的非胶原性骨基质糖蛋白，广泛的分布于多种组织和细胞中，磷酸化的骨桥蛋白可与多个Ca²⁺结合。骨桥蛋白这种高度亲和钙离子的特性，是骨矿化和磷酸钙结石形成的重要原因。Sodek等^[28]通过胎猪颅骨和长骨的提取物的研究发现，X射线观察下骨标本的密度越高，提取物中骨桥蛋白蛋白的含量越多。而骨桥蛋白在黄韧带骨化过程中的表达和意义并未得到研究。在此，实验测定了骨桥蛋白及其受体在黄韧带骨化症患者的未骨化黄韧带中的表达，并与正常黄韧带中的表达进行比较。在此次实验中，黄韧带骨化组中的骨桥蛋白及其受体的mRNA表达较之非黄韧带骨化组明显升高。这说明在黄韧带骨化过程中，骨桥蛋白及其受体的表达是显著上升的。而免疫组织化学染色结果也与其相符，在黄韧带骨化组中骨桥蛋白、CD44、整合素β3的染色大多以深染为主，而非黄韧带骨化组中的染色大多为蓝染。通过半定量分析法显示，黄韧带骨化组中的骨桥蛋白及其受体的染色明显深于非黄韧带骨化组。黄韧带骨化组中骨桥蛋白的大量表达，这可能意味着骨桥蛋白在异位骨化中起着重要作用。

骨桥蛋白在骨化过程中可能通过与CD44、整合素β3等受体结合来发挥作用^[29]。整合素β3是由α、β单位组成的异质二聚体黏附糖蛋白受体，其调控如细胞移行、吞噬作用、生长发育等多种动态细胞过程。骨桥蛋白含有丰富的Arg-Gly-Asp序列(RGD序列)，通过该序列骨桥蛋白可以与整合素结合，进而通过细胞内特异性信号传导来促进细胞的黏附、迁移和增殖。其中αvβ1和αvβ3等亚型被认为与Ca²⁺介导的信号传导有关^[30]，这两种亚型可以识别骨桥蛋白中的RGD序列，Wu等^[31]研究也证实受体与RGD序列结合后，可以调控Ca²⁺通路。CD44是一种多态性的Ⅰ型跨膜糖蛋白，在韧带修复时可能起重要作用。有作者通过对肥厚退变黄韧带的研究得出结论，黄韧带肥厚与CD44的表达增加有关，这可能与局部应力负荷有关^[17]。Lakemeier等^[32]的研究发现破骨细胞的伪足上有丰富的CD44、整合素β3表达，在敲除骨桥蛋白和CD44基因的小鼠中，细胞的迁移和伪足伸出都会减少，细胞融合能力也大受影响，而在成骨细胞中也可见αvβ3的表达，故成骨细胞的移行可能也受影响。而此次实验中，CD44和整合素β3协同骨桥蛋白表达增高也与前人对骨桥蛋白在骨化过程中作用的猜想和研究相符。因此，实验认为CD44和整合素β3等受体的表达在骨桥蛋白对黄韧带骨化作用的过程中起重要作用。

实验表明，在黄韧带骨化症中，黄韧带内骨桥蛋白、CD44、整合素β3的表达均升高。实验结合文献，认为骨桥蛋白在黄韧带骨化过程中可能通过结合CD44和整合素β3受体来发挥作用，影响细胞的粘附、迁移和增殖。整合素与细胞外基质蛋白通过其较长的胞外域相连接，与细胞骨架则通过短的胞内段连接。但骨桥蛋白在其中发挥何种作用及具体作用机制仍有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨桥蛋白及其受体在黄韧带骨化症黄韧带细胞中的表达及其意义

Expression and role of osteopontin and its receptors in ligmentum flavum cells derived from patients with ossification of ligamentum flavum

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[1]	鲁德志, 梅钊, 李向磊, 王彩萍, 孙鑫, 王孝文, 王金武. 3D打印脊柱侧凸矫形器的数字化设计及效果评估[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1329-1334.
[2]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[3]	王德斌, 毕郑刚. 尺骨鹰嘴骨折-脱位解剖力学、损伤特点、固定修复及3D技术应用的相关问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1446-1451.
[4]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[5]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[6]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[7]	刘正蓬, 王雅辉, 张义龙, 明颖, 孙志杰, 孙贺. 3D打印椎间融合器置入治疗脊髓型颈椎病：颈椎曲度及椎间高度恢复的半年随访[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 849-853.
[8]	徐俊马, 喻岳超, 刘智, 刘雨, 王飞通. 3D打印共面模板结合固定针技术在肺小结节经皮精准活检中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 761-764.
[9]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[10]	李晨杰, 吕林蔚, 宋阳, 刘静娜, 张春秋. 预紧力作用下钛合金人工假体界面骨小梁形态参数测量与统计分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 516-520.
[11]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[12]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[13]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[14]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[15]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.