正常及挫伤脊髓血管的三维直视化：同步辐射相衬成像

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.46.019

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (46): 7478-7483.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.46.019

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正常及挫伤脊髓血管的三维直视化：同步辐射相衬成像

吴天定¹，吕红斌²，曹勇¹，倪双飞¹，李平¹，胡建中¹

1中南大学湘雅医院脊柱外科，湖南省长沙市 410008；2中南大学湘雅医院运动医学科，运动医学研究中心，湖南省长沙市 410008

收稿日期:2015-09-25 出版日期:2015-11-12 发布日期:2015-11-12
通讯作者: 胡建中，博士，教授，中南大学湘雅医院脊柱外科，湖南省长沙市 410008
作者简介:吴天定，男，1985年生，湖南省长沙市人，汉族，2012年中南大学毕业，博士，主治医师，主要从事脊髓损伤与修复的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81301542，81371956)

Three-dimensional visualization of angioarchitecture in spinal cord contusion using propagation phase contrast tomography

Wu Tian-ding¹, Lv Hong-bin², Cao Yong¹, Ni Shuang-fei¹, Li Ping¹, Hu Jian-zhong¹

1Department of Spine Surgery, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China; 2Department of Sports Medicine, Research Center of Sports Medicine, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China

Received:2015-09-25 Online:2015-11-12 Published:2015-11-12
Contact: Hu Jian-zhong, M.D., Professor, Department of Spine Surgery, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
About author:Wu Tian-ding, M.D., Attending physician, Department of Spine Surgery, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81301542, 81371956

摘要/Abstract

摘要：

背景：同步辐射相位衬度成像凭借硬X射线光源的高准直、高相干等特性，其能大幅度提高对软骨细胞及微血管的空间分辨能力。
目的：利用高空间分辨率同步辐射相衬成像技术观察大鼠正常及急性损伤脊髓的微血管的形态变化。
方法：雄性SD大鼠分为2组：实验组以改良ALLEN’s打击法制作大鼠急性脊髓挫伤模型；伪手术组大鼠只行椎板减压术，不打击脊髓作为正常对照。术后第1天取正常及伤段脊髓标本经甲醛-水杨酸甲酯序贯处理48 h，标本于上海光源BL13W1硬X射线站进行扫描和成像。采集数据以利用VG Studio Max 2.1软件包进行3D图形重建及血管量化分析。
结果与结论：相位衬度成像以特有的血管边缘增强效应直观呈现脊髓微血管形态，其结合CT技术(相衬断层成像)从三维视角对脊髓微血管进行直观成像，急性脊髓挫伤后神经组织的破坏伴随着严重的血管结构的损毁，组织损伤及血供的缺失在髓内由中央区向头、尾两侧呈梭性蔓延。三维血管量化数据显示脊髓挫伤后微血管数目及血管灌注容积急剧减少(P < 0.01)。结果表明无需血管造影的条件下，相衬断层成像可作为一种新的有潜力的超高分辨率可视化技术用于脊髓微血管3D结构成像及量化分析。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 同步辐射, 衬度成像, 脊髓损伤, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Propagation phase contrast tomography can greatly improve the spatial resolution of chondrocytes and microvessels depending on the high collimation and high coherence performance of hard X-ray.
OBJECTIVE: To detect the alteration of angioarchitecture after spinal cord injury in rats using propagation phase contrast tomography.
METHODS: Eight male Sprague-Dawley rats were divided into two groups: in experimental group, an acute spinal cord injury model was induced in rats by the modified Allen’s method; in sham control group, rats were subjected to laminectomy. At 1 day after operation, normal and injured spinal cord segments were taken and treated with formaldehyde-methyl salicylate sequentially for 48 hours. The segments were scanned by propagation phase contrast tomography in BL13W1 beamline experimental station of Shanghai Synchrotron Radiation Facility, China. Harvested data were analyzed by VGStudio Max 2.1 software for three-dimensional reconstruction and microvasculature quantitative analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: The propagation phase contrast tomography successfully simulated the morphology of angioarchitecture following spinal cord injury. After acute spinal cord contusion, the destruction of nerve tissues was accompanied by severe microvasculature damage. Intramedullary tissue damage and loss of blood supply was spread from the central zone to the ends. Three-dimensional microvascular quantitative data showed that after spinal cord contusion, the number of microvessels and vascular perfusion volume drastically reduced (P < 0.01). These findings indicate that the propagation phase contrast tomography without angiography has potential as a new ultra high-resolution visualization technique for three-dimensional microvessel imaging and quantitative analysis.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Radiation, Imaging, Three-Dimensional, Spinal Cord Injuries

吴天定，吕红斌，曹勇，倪双飞，李平，胡建中. 正常及挫伤脊髓血管的三维直视化：同步辐射相衬成像[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(46): 7478-7483.

Wu Tian-ding, Lv Hong-bin, Cao Yong, Ni Shuang-fei, Li Ping, Hu Jian-zhong. Three-dimensional visualization of angioarchitecture in spinal cord contusion using propagation phase contrast tomography[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(46): 7478-7483.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析正常SD大鼠8只，分为2组，实验过程无脱失，均进入结果分析。

2.2 相衬断层成像扫描成像结果见图2-5。

2.2.1 相衬断层成像脊髓血管成像的边界增强效应正常脊髓微血管相位衬度原始的投射图像显示：脊髓内部不同直径微血管数目丰富，血管轮廓清晰可辨，逐级走形，在2D图像上呈纵横交错的非交通性重叠状平面投影，管壁结构光滑、完整、连续(图2a)，CCD探测的最小直径微血管管径细至7.4 μm(箭头)。血管壁边缘与周围组织间的相位衬度折射率高，硬X射线在血管壁内、外两侧的光强分布落差明显(图2b)，管壁内、外两侧的光灰度值差(160 gray)约为管腔内灰度值差(40 gray)的4倍(图2c)，相位衬度差在血管腔的管壁边界具体表现出显著的边缘增强效应。

2.2.2 相衬断层成像断层成像与组织学正常与损伤的脊髓内部血供比较：实体标本体视学图像示正常脊髓内部微血管灌注连续，逐级分布(图3a)，RECA-1染色阳性的微血管呈现红色荧光，数量丰富，分布区域主要集中在灰质区呈蝴蝶状，白质区域阳性染色分散，微血管密度较小(图3c)，相衬断层成像正常断层图像示脊髓内部微血管管腔结构清晰，管壁成型(图3e)。脊髓遭受外力挫伤后，髓内神经组织肿胀、出血、淤血，脊髓内部微血管灌注连续性消失，损伤中央区处于失灌注状态(图3b)，RECA-1染色阳性的内皮细胞大面积丢失，血管数目急剧减少(图3d)，相衬断层成像断层图像示损伤区域累及灰质和白质，尤以中央

灰质区域受损严重，脊髓组织结构紊乱，微血管管腔破坏并消失，神经组织毁损，脊髓周边有白质组织尚存(图3f)。苏木精-伊红染色可以看到损伤后损伤局部区域出现大量炎性细胞浸润，神经组织结构紊乱、破坏伴随着严重的血管结构的损毁，组织损伤及血供的缺失并非只局限在打击的中央区，而是在髓内由震中区向头、尾两侧呈梭性蔓延(图4a)。由损伤的正中区域向头侧2 mm和4 mm作CT切片并划定切片内的ROI区域(Region of Interest)(图4b1-3)，发现受损脊髓组织面积逐渐减小(图4c)，残存组织面积增加(图4d)，微血管数目计数逐渐增多(图4e)。

2.2.3 相衬断层成像脊髓血管3D成像及分析正常脊髓微血管3D重建图形重现了正常T₁₀段脊髓内部微血管3D结构的形态、连接、分支和走形。中央沟动脉系统和周围动脉系统的血供结构配布清晰。中央沟动脉系统离心性的分布供应髓内大部分灰质，且微血管密集区勾勒出脊髓灰质区域的蝶形轮廓，周围动脉穿支向心性穿越白质，供应部分感觉后角及大部分白质，脊髓血供完整有序(图5a，b)。与正常脊髓组织相比，损伤后脊髓震中区域微血管结构塌陷、断裂和消失，其中脊髓灰质区域众多微小血管受损严重，表现为管腔连续性中断、错位、扭曲，损伤区周围血管受挤压扭曲变形阻碍局部血流供给(图5c，d)。经VG血管定量分析软件包进行相衬断层成像血管3D量化分析后显示脊髓挫伤后微血管数目及血管灌注容积急剧减少(P < 0.01)，见图5e，f。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1月至7月在中南大学完成。

1.3 材料同步辐射扫描装置，上海光源BL13W1硬X射线站提供。

实验动物：健康雄性SD大鼠8只，体质量250-300 g，由中南大学实验动物学部提供。

1.4 方法

1.4.1 大鼠急性脊髓损伤模型制备以及动物分组正常SD大鼠8只，分为损伤组(n=4)和伪手术组(n=4)。损伤组经体积分数10%水合氯醛溶液(3 mL/kg，腹腔注射)过剂量麻醉后，定位后正中切口，常规消毒铺单后行T₁₀椎板切除术。用Allens重物撞击法制作大鼠T₁₀段急性脊髓损伤模型^[8]。次日施行开胸手术，快速暴露心脏后立即经左心室-主动脉插管，剪开右心耳，用预热40 ℃的肝素钠0.1 mol/L PBS(500 IU/mL)500 mL持续灌注(压力11.27 kPa，速率6-7滴/s)，至肝脏色泽由棕褐色变为浅白色，并右心耳流出液清亮，充分排出循环系统内血液。随后用体积分数4%甲醛缓冲液200 mL灌注固定10 min(压力、速率同上)。操作完毕后两组大鼠均置于4 ℃冰箱保存过夜，次日取出大鼠T₁₀脊髓标本，再次经体积分数4%甲醛缓冲液固定后，分别用体积分数50%，75%，85%，95%，100%的乙醇对标本进行梯度脱水。梯度乙醇脱水后经冬绿油浸润12-24 h后行相衬断层成像扫描成像。伪手术组大鼠只行椎板减压术，不打击脊髓作为正常对照。成像完后用双刃薄刀片制备厚度约为350 μm的厚组织切片，并行体视显微镜(×200，SZX7 Olympus)拍照。

1.4.2 相位衬度成像成像原理傅里叶光学原理中，X射线在样品中的折射率可简单表述为：n=1-δ+iβ，其中δ为相位衬度相关，β为吸收衬度相关。在相位衬度成像的实验中，硬X射线能量为10-100 keV，其纯净光源具备准直、准相干特性，当物-像距离(sample-to-detector distance， SDD)达到某一要求时，在成像平面处的电偶联元件CCD探头探测到的光强信息为生物样品的X射线吸收像和X射线穿透样品时的相位偏移衬度像。硬X射线照射样品时，其相位系数(10^-6-10^-8)大于吸收系数(10^-9-10^-11)约3个数量级，相位衬度成为主导。因此，CCD以高出一千倍的敏感度捕捉到吸收相难以探测到的相位信息。

1.4.3 相衬断层成像扫描条件相衬断层成像成像在上海光源X射线成像与生物医学应用光束线站(BL13W1)完成(图1)。

BL13W1线站提供8-72.5 keV的非聚焦高相干单色平行光束，20 keV能量时达到最大光斑尺寸48 mm (H) 5 mm (V)，发散度仅为0.015 mGy (H) × 0.002 mGy (V)，提供的入射光具有高空间相干性和准平行性。本实验的扫描参数设定：光子能量15.0 keV，SDD至30 cm，水冷式高分辨CCD探测器放大倍数为2倍，以捕捉实时投射图像，空间分辨率为3.7 μm，曝光时间0.8 s。校正旋转平台转轴，使其与CCD探测平面平行，转台旋转角0°-180°，总投影数720张。每间隔90张投影图像采集一次样品不在光路中的白场像(Flat)，同时采集光路中无光时的暗场像(Dark)。

1.4.4 图像处理与3D重建采集的投射图像在Image-Pro Plus 6.0图像处理软件平台上消除白场像和暗场像，以去除拍摄背景图像。并通过调整对比度、低通滤波和锐化增强后得到视觉的最佳图像。每个样品的原始投影图像利用GPU-CT-Program滤波反投影算法图像重构软件(BL13W1组编写)进行样品的快速CT断层图像重构，重构步骤分为Tomo图像导入、Sino正弦图像生成、Axis轴心调整、Slice断层图像生成以及Toolkit图像位数(32bit-16bit)转换。重构过程需要进行背景噪声校正、环形伪影校正、旋转平台轴心位置校正以及图像感兴趣区域(Region of Interest，ROI)的选择等。最后重构的大量连续CT断层图像利用VG Studio Max 2.1软件包进行3D图形重建及血管量化分析^[9-11]。

1.4.5 血管免疫荧光染色常规制作厚6 μm冰冻切片，按照免疫荧光染色步骤先后孵育一抗小鼠抗大鼠RECA-1(1∶10，Abcom)标记内皮细胞，二抗羊抗小鼠cy-3红色(1∶1 000，Sigma)显色，反复漂洗、盖片后荧光显微镜(×200，DM-LB2 Leica)观察。

1.4.6 苏木精-伊红染色冰冻切片经常规苏木精-伊红染色后显微镜下(×100)观察。

1.4.7 ROI区域损伤面积计算 IPP6.0软件分别划出组织缺失(Lesion)和存留完好(Spared)的切片实质区域，利用Count/Size模块进行测量，并计数ROI区域内血管数目。

1.5 主要观察指标血管量化分析(主要包括血管容积、血管数目计数)。

讨论

脊柱脊髓损伤是一类严重的运动系统创伤。脊髓损伤后具有致瘫性高，并发症多，神经功能恢复难度大等特点，患者往往以完全性或不完全性四肢瘫痪或截瘫伴随余生。脊髓损伤后修复是目前外科创伤领域重点关切的问题之一。有学者证实，在中枢神经(脑和脊髓)创伤后的3-7 d，损伤区及损伤周围区普遍存在着暂时性的新生血管形成，血管再生在创伤后7 d达高峰，后逐渐消退。这种短期内不完全的创伤后血管再生在一定程度上有助于缓解血流灌注的不足^[9-10]。事实上，脊髓创伤后血管再生作为一种局部代谢改变后的适应性变化，是脊髓改善创伤后缺血的重要途径，其中涉及到微血管的形态学重塑的过程。可见，了解微血管再生的形态学特点，对于探讨脊髓损伤后修复具有十分重要的意义。

近些年来，随着数字化显微影像学技术的发展，人们开始热衷于将相衬断层成像成像技术应用于对实验动物脉管结构三维形态学的研究。涉及的领域主要有肝脏血管以及肿瘤的成像^[11-12]，而在神经血管领域，如脑和脊髓血管成像中的应用相对较少，国内学者首次尝试了相衬断层成像在脑血管中可视化中的应用^[13]。本课题组长期致力于脊髓损伤修复机制的研究，在前期的工作中作者利用先进的相衬成像显微断层成像技术在血管成像中的优势，成功获取了大鼠正常下段胸髓微血管3D构象图^[5]，并首次将该技术应用于脊髓损伤病理状态下微血管3D网络结构的观察。与传统的X射线源通过往血管内注射增强对比度的造影剂的成像方式不同，相位衬度成像技术是利用高准直性、高相干性的同步辐射光在穿透组合的过程中发生相位位移，通过CCD探测器捕捉相位信息的改变，从而达到获取物体的内部结构信息的成像方式。在硬X射线的条件下，样品的折射率系数约为吸收系数的1 000倍^[14]，因而采用类同轴相位衬度成像的血管，结构更清晰，分辨率也更高。由于无需向血管内注射对比剂，因而由注射剂引起过敏反应导致诸如致畸和死亡的发生率也显著降低。

借助于相衬断层成像的显微成像优势，作者首次应用该技术成功再现了脊髓损伤病理状态下T₁₀段脊髓微血管三维形态学结构的变化，通过对比分析正常的大鼠脊髓髓内血供系统，揭示了创伤是脊髓髓内血管毁损的直接因素。此外相衬断层成像结果(图3，4)显示脊髓髓内血管结构的完整性在暴力的瞬间已经遭受了机械性的破坏，表现为血管的断裂、闭塞、扭曲和变形等。脊髓血液灌注容量显著下降，尽管髓外的大血管基本保持通畅，但损伤的正中主要集中在灰质区域众多血管结构异常中断、错位，甚至消失，这对于代谢需求高、耐氧能力差的神经元来说是致命性的打击。随着髓内血管网络结构遭致破坏以后，脊髓的血液供应系统陷入紊乱状态，最终引起血管内皮细胞功能受损，血管通透性增加髓内静水压升高，这些因素相互作用，产生“滚雪球样”效应导致脊髓缺血缺氧范围进一步加重，致使损伤区域不仅仅局限于打击的震中部位，会呈梭型向脊髓打击的周边区域扩展，这与以往的文献报道的结果是一致的^[15]。显而易见，恢复有效的脊髓血液供应，保持完整的脊髓血供系统对于维持脊髓的正常生理功能以及损伤后点的修复起着十分重要的作用。

相衬断层成像对于脊髓损伤的研究基于该技术能实现脊髓微血管网络的三维可视化，这与传统的二维的血管可视化技术如组织学切片、电镜扫描不同，它不仅保留了组织的完整性，可以真实再现复杂的三维血管网络，同时可以借助图像后处理技术，如图5e-f所示，结合血管分析软件的相应计算模块成功实现了从三维角度对血管容量信息进行分析。这种新的微血管可视化方法为研究微血管的结构和功能特点提供了丰富的数字化信息。相衬断层成像显微成像技术的出现，开创了微血管研究的三维数字化的新时代，可以作为一种有效的研究病理状态下微血管形态的工具，其在中枢神经微血管形态学的研究中有着较为广阔的前景。尽管有一定得局限性，如活体血管成像难度大、仪器装置庞大，但随着医学物理技术的不断发展，相信现代显微放射影像学技术将在医学生物学的基础研究中发挥重要作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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