新生大鼠脊髓运动神经元的纯化培养与鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.42.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：神经元是有丝分裂后的细胞，体外培养很难存活。脊髓运动神经元的分离、纯化和培养同时也是细胞培养的技术难点。
目的：建立新生大鼠脊髓运动神经元培养体系，并予以分类鉴定和测定其纯度。
方法：取新生大鼠脊髓腹侧组织分离成细胞悬液，经密度梯度离心及差速贴壁后纯化培养，采用免疫细胞化学双标染色法对培养盖片上的细胞予以鉴定、分类，结合Hoechst荧光染核，计数各细胞成分的含量。
结果与结论：细胞贴壁生长良好，神经元占85.8%，其中运动神经元达71.6%，星形胶质细胞占7.8%，NF200和胶质纤维酸性蛋白染色皆为阴性的细胞占6.4%。结果说明，取新生大鼠腹侧脊髓组织结合密度梯度离心及差速贴壁接种法可以培养出高纯度的脊髓运动神经元。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 运动神经元, 免疫化学, 纯化培养, 新生大鼠, 辽宁省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: neurons are post-mitotic cells that are difficult to survive. Isolation, purification and culture of spinal motor neurons are technical difficulties of cell culture technology.
OBJECTIVE: To establish the culture system of spinal motor neurons from neonatal rats and to identify and determine the purity of spinal cord neurons.
METHODS: Ventral spinal cord tissues from neonatal rats were made into cell suspension that was subjected to density gradient centrifugation and differential adherence followed by purification culture. Then, the cells on cover plates were identified and classified using immunocytochemical double staining method, and the content of cell components was calculated in combination with fluorescent Hoechst nuclear staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The cells adhered well, and the neurons accounted for 85.8%, among which, motor neurons reached 71.6%, astrocytes accounted for 7.8%, cells negative for neurofilament 200 and glial fibrillary acidic protein were 6.4%. These findings indicate that the ventral spinal cord tissues from neonatal rats combined with density gradient centrifugation and differential adherence can develop high-purity spinal motor neurons.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Neurons, Cells, Cultured, Microglia

杨林，刘阳，吕德成. 新生大鼠脊髓运动神经元的纯化培养与鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(42): 6782-6786.

Yang Lin, Liu Yang, Lv De-cheng. Spinal motor neurons from neonatal rats: purification, culture and identification[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(42): 6782-6786.

图/表（结果） 3

2.1 脊髓运动神经元形态学变化原代细胞培养板上在刚接种时呈现圆形或者类椭圆形，周边具有有环形光晕，并呈均匀分散分布。接种12-24 h后，绝大多数细胞开始贴壁生长，并有一部分细胞逐渐开始长出较短的突起，细胞由圆形或类椭圆形变为不规则形态(图1)。

培养4 d的脊髓腹侧组织细胞进行细胞免疫化学染色，神经元特异性荧光染色为NF200抗体染色(一抗)，实验中所采用的荧光二抗是由异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)标记的，阳性细胞发出红色荧光；在免疫荧光显微镜下可以发现神经元细胞胞浆着色，形态大多为不规则形，大小长短不一，但是细胞突起显示清晰。脊髓运动神经元的特异性荧光染色是ChAT抗体染色(一抗)，本实验中所采用的荧光二抗是由异硫氰酸荧光素(FITC)标记的，阳性细胞发出绿色荧光；在免疫荧光显微镜下可以发现阳性神经元的细胞胞体相对较大一些，形态也以不规则形为主，具有单个较长轴索样的细胞突起，可以发现典型的运动神经元呈锥形，从胞体中生长出多个未分化的短小突起，其中有一个突起较其他突起稍长(图2)。

星形胶质细胞的标记物是胶质纤维酸性蛋白，阳性细胞同样发出绿色荧光，数量相对较少，直径也稍小 (10-20 μm)，呈多突起的不规则形状。结合Hoechst染核知其细胞核较大，呈圆形或类卵圆形，核常偏位(图3)。实验中以Hoechst标记的细胞核发出蓝色荧光，细胞核发光均匀，提示细胞生长状态良好。

2.2 脊髓运动神经元的计数结果计数荧光显微镜随机10个视野中细胞核、ChAT阳性细胞、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞、NF200阳性细胞数量，分别代表培养细胞总数、运动神经元、星形胶质细胞、神经元的数量，统计出各自所占的平均比例。

通过计算得知，NF200标记阳性细胞占细胞总数的85.8%。其中，与ChAT免疫双标阳性的细胞占71.6%，与ChAT免疫双标阴性的细胞(可能为感觉神经元、中间神经元、其他类型神经元)占14.2%。

被胶质纤维酸性蛋白标记的阳性细胞占7.8%，既没标记NF200又没标记胶质纤维酸性蛋白的细胞占总数的6.4%，即为其他类型的细胞。

2.3 脊髓运动神经元存活率测定结果 0，6，24，48 h脊髓运动神经元细胞存活率分别为(98.7±1.23)%，(95.5± 1.51)%，(92.8±1.87)%，(90.6±2.25)%，组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

参考文献

[1] Kuhn TB.Growing and working with spinal motorneurons. Methods cell Biol.2013;71(1):67-87.
[2] 孙毅,赵冬梅,张烨,等.胎鼠前角运动神经元的取材与培养研究[J].滨州医学院学报,2009,32(6):17-19.
[3] Elliott P,Wallis DI,Foster GA.Ionic mechanisms underlying excitatory effects of serotonin on embryonic rat motoneurons in long-term culture.Neuroscience.2013;90(4):1311-1323．
[4] 赵合庆,杨晓玲,严志强.胚胎大鼠脊髓运动神经元的体外培养与鉴定[J].中华神经科杂志,2004,37(5): 435-437.
[5] 宋学琴,李春岩,吴淑玉,等.胚胎大鼠脊髓运动神经元的体外培养及鉴定[J].基础医学与临床,2004,24(1):83-87.
[6] Son EY, Ichida JK, Wainger BJ, et al.Conversion of Mouse and Human Fibroblasts into Functional Spinal Motor Neurons. Cell Stem Cell. 2011;9(3):205-218.
[7] Haastert K, Grosskreutz J, Jaeckel M, et al.Ratembryonic motoneurons in long -term co-culture with Schwann cells-a system to investigate motoneuron diseases on a cellular level invitro.J Neurosci Method.2012;142(2):275-284.
[8] Das M, Rumsey JW, Gregory CA, et al.Embryonc motoneuron-skeletal muscle co-culture in a defined system. Neuroscience.2014;146(2): 481-488.
[9] Larsen KE, Benn SC, Ay I, et al. Aglial cell line-derived neurotroph factor (GDNF):tetanus tox in fragment C protein conjugate improves delivery of GDNF to spinal cord motor neurons in mice.Brain Res.2006;1120(1):1-12.
[10] Andersona KN, Potterb AC, Piccenna LG, et al. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord.Brain Res Protoc.2014;12: 132-136.
[11] Taguchi T, Huchet M,Roa M,et al. A sub population of embryonic telecephalic neurons survive and develop in vitro in response to factors derived from the periphery. Dev Brain Res.2012;37:125-132.
[12] Rochefort NL,Narushima M,Grienberger C.Development of direction selectivity in mouse cortical neurons.Neuron.2001; (3):425-432.
[13] 杨浩,梁喆,鞠躬,等.体外培养脊髓神经元过程中关于提高细胞产率以及活性的技术探讨[J].解剖学杂志,1997,20(3):239-242.
[14] 杨浩,王春婷,鞠躬.不同方法纯化体外培养脊髓神经元的比较[J].中国组织化学与细胞化学杂志2000,9(3).
[15] Rakowicz WP,Staples CS,Milbrandt J. Glial cell line-derived neuro-trophic factor promotes the survival of early postnatal spinal motor neurons in the lateral and medial motor columns in slice culture.J Neurosci.2012;22:3953-3962.
[16] Carriedo SG,Yin HZ,Weiss JH.Motor neurons are selectively vulnerable to AMPA/Kainate receptor-mediated injury in vitro. J Neurosci.2006;16:4069-4079.
[17] 赵林普.某些神经营养因子对培养大鼠脊髓腹侧神经元生长分化作用[J].细胞生物学杂志, 2010(增刊),117(3).
[18] Bataille S,Potalier P,Coulon P.Influence of acety-l2 cholinesterase on embryonic spinal rat motoneurous grousth in culture:a quantitative morphometric study.Eur J Neurosci. 2008;10:560-572.
[19] 宋学琴,王丽琴,吴淑玉.生长底物对培养胚胎大鼠脊髓运动神经元的作用[J].中国免疫学杂志,2004,20(6): 405-409.
[20] 杨晓玲,赵合庆,严志强.体外培养大鼠脊髓运动神经元的存活率及形态观察[J].基础医学与临床,2007,27(3):344-345.
[21] Martin FC,Wiley CA.A serum-free,pyruvate-free medium that supports neonatal/ glial cultures.J Neurosci Res.2005; 41(2): 246.
[22] Banker GA,Cowan WM.Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.Brain Res.2012;126(2):397.
[23] Taylor AR, Robinson MB, Milligan CE.In vitro methods to prepare astrocyte and motoneuron cultures for the investigation of potential in vivo interactions. Nat Protoc.2007; 2(6):1499-1507.
[24] 余磊, 潘树义, 秦建强.脊髓神经细胞培养的方法.中国临床解剖学杂志,2002,20(4),267.
[25] Lin LF,Doherty DH,Lile JD.GDNF:a glia cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 2013;260(5111):1130.
[26] Zum AD,Baetge EE,Hammang JP.Glia cell line-derived neurotrophic factor(GDNF),a new neurotrophic factor for motoneurons.Neuro Report.2014;6(1):113.
[27] 陈波,袁琼兰.胶质细胞源性神经营养因子与突触可塑性[J].四川解剖学杂志,2006(4):38-39,44.
[28] 宋学琴,吴淑玉,王丽琴.胚胎大鼠脊髓运动神经元体外培养方法的优化.河北医科大学学报,2004,25(3),133-135.
[29] Lucius R, Mentlein R.Development of a culture system for pure rat neurons: advantages of a sandwich technique.Anat Anz.2013;177(5):447-454.
[30] 司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].西安:世界图书出版公司,2004: 150-152.

引言

作为执行大脑发出指令的终末细胞，脊髓运动神经元的生长、发育和存活直接影响大脑功能的正常发挥^[1]。神经细胞的培养是神经科学研究的重要方法，神经细胞培养模型的成功建立也是再续科研工作的实验基础。因为神经细胞属于有丝分裂后期细胞，没有分化能力，所以神经细胞的体外培养比其他细胞培养更加困难，体外培养很难存活^[2-3]。

自20世纪初由Harrison创立了蛙胚神经管体外植片组织培养以来，中枢神经系统不同部位的神经组织已经被人类成功培养^[4-5]。随着神经科学的不断发展，脊髓发育生长的研究、病理生理的研究、药物作用机制的研究越来越受到相关学者的重视，所以脊髓细胞的体外培养显得尤为重要。脊髓主要由长行的神经传导束组成，神经元比较分散，数量更是少于大脑皮质神经元^[6]。而脊髓运动神经元的分离、纯化和培养同时也是细胞培养的技术难点，因而只有合理取材、保证细胞产率以及细胞活性，才是成功培养脊髓神经元的必要条件。

要得到比较科学的实验结论，就要求稳定而高效的实验模型。传统方法是混合培养神经细胞和神经胶质细胞，无法满足单一神经细胞培养的实验研究需要，而目前神经元的培养已从组织块的混合培养逐渐发展到单一类型细胞的高纯度分散培养^[7-9]。因而体外原代神经细胞培养就成为了一种研究神经元形态、功能的重要方法，近年来已越来越受到神经科学研究人员及临床工作人员的重视。

本实验通过建立新生大鼠脊髓运动神经元的纯化培养体系，观察体外培养的新生大鼠脊髓运动神经元的存活率、形态学特征及生长规律，从而对今后进一步研究与治疗脊髓损伤、运动神经元病具有一定的指导意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计动物细胞培养与鉴定。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至2015年1月在大连医科大学附属第一医院二部中英再生实验中心完成。

1.3 材料清洁级新生24 h内SD大鼠，由大连医科大学动物实验中心提供。

新生大鼠脊髓运动神经元的纯化培养与鉴定实验试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
Neurobasal 培养基，B27，谷氨酰胺，青链霉素，胎牛血清，马血清，胰蛋白酶，PLL，人重组胶质细胞源性神经营养因子	Biotech公司
Hoechst核染色剂、小鼠抗神经微丝单克隆NF200抗体	Sigma公司
羊抗胆碱乙酰转移酶ChAT抗体	Chemicon公司
兔抗胶质纤维酸性蛋白	武汉博士德公司
TRITC标记山羊抗小鼠IgG、FITC标记山羊抗兔IgG	天津华美生物公司
倒置解剖显微镜	0LYMPUS

1.4 实验方法
1.4.1 脊髓运动神经元的体外培养多聚赖氨酸滴于24孔板，孵箱过夜，PBS洗3次，置于孵箱备用。轻轻取出新生大鼠腹侧脊髓，放于盛有解剖液的小培养皿中，剥离脊膜和血管。剪碎脊髓组织成1mm×1 mm×1 mm碎块。然后在37 ℃，体积分数5%CO₂孵箱用0.25%胰蛋白酶消化 25 min，加入4%BSA防止消化过度，并用2 mL DMEM液清洗组织2次。2 500 r/min离心15 min，弃上清。加入6.8%的碘葡酰胺，3 000 r/min密度梯度离心15 min。离心后液体分3层：上层为F1层(BSA)，中层为F2层(含有脊髓运动神经元)，下层为F3层(碘葡酰胺分离液及碎片)。将F2细胞悬液加入4%BSA缓冲液上方，2 500 r/min离心20 min，去掉细胞碎片。然后差速贴壁1 h，吸取未贴壁悬液离心收集细胞，加入全培养液(76% Neurobasal培养基，2%B27，10%FBS，10%HS，1%谷氨酰胺，1%双抗，1%胶质细胞源性神经营养因子)。制成细胞悬液后，取0.4%锥虫蓝 1 μL，9 μL细胞悬液计数，检测细胞存活率。用计数板调节细胞浓度到1×10⁹ L^-1，接种在经处理盖玻片后的24孔板中，每盖片50 μL，置37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养，3 h后添加全培养液并均匀铺满孔底，其后3 d半量换全培养液1次。
1.4.2 细胞形态学观察及免疫荧光鉴定采用细胞免疫化学技术，以Hoechst标记细胞核，便于进行细胞计数；以NF200特异性标记神经元；ChAT特异性标记脊髓运动神经元；胶质纤维酸性蛋白特异性标记星形胶质细胞。取培养4 d的细胞进行细胞免疫组织化学染色，用ChAT和胶质纤维酸性蛋白分别NF200进行免疫荧光双标。弃培养液，0.01 mol/L PBS漂洗3次后加入40 g/L室温固定20 min，再用0.01 mol/L PBS漂洗3次，5 min/次。而后加入含3%BSA和0.5%Triton-X-100细胞打孔液，37 ℃下孵育 30 min。弃废液，24孔板中每盖片加入NF200抗体 (1∶1 000)50 μL，在37 ℃湿盒孵育1 h后4度冰箱过夜。0.01 mol/LPBS漂洗3次，5 min/次，加入TRITC标记山羊抗小鼠-IgG(1∶400) 37 ℃湿盒孵育1 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次，5 min/次，加入胶质纤维酸性蛋白抗体(1∶500)/ ChAT抗体，并给予同量的抗体稀释液用作对照，37 ℃湿盒孵育4 h。0.01 mol/L PBS漂洗3次，5 min/次，加入FITC标记山羊抗兔IgG(1∶400)，37 ℃湿盒孵育1 h后利用Hoechst (终质量浓度为1 mg/L)染细胞核5 min。50%甘油封固，免疫荧光显微镜观察并照相。
1.4.3 细胞计数在免疫荧光显微镜下随机选取10个视野，分别计数细胞核数量(蓝光)，ChAT/胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数(绿光)，NF200阳性细胞数(红光)，以及NF200/ChAT免疫双标的细胞数，计算每个视野中ChAT与NF200阳性细胞所占的各自平均比例，以及胶质纤维酸性蛋白阳性细胞所占平均比例。
1.4.4 细胞存活率测定继续培养6，24，48 h，选取神经元细胞进行锥虫蓝染色，随机选取10个视野计算存活的细胞数(视野面积0.12 mm²)。
1.5 主要观察指标 ①脊髓运动神经元形态学变化。②脊髓运动神经元的计数。③脊髓运动神经元存活率测定。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行t 检验。

讨论

神经细胞的体外培养是研究神经生理、神经病理、神经药理、神经营养因子以及神经发育与再生的一种常用及重要的研究手段，而神经元作为一种高度分化的组织细胞，在形态上具有突起、胞体之分，对理化因素的作用特别敏感，神经元相对于其他组织细胞，在体外很难生长与存活，对培养条件要求也十分苛刻^[10-12]。以往利用脊髓组织进行原代培养很难培养到单一类型的神经元，因为神经元很脆弱、体积大、耐受性差，还不便使用流式细胞仪进行细胞筛选，故所培养细胞中的各类神经元的所占比例和形态特征就显得尤为重要^[13]。脊髓运动神经元作为下运动神经元，对营养条件要求极高，对环境变化极为敏感，所以如何纯化培养脊髓运动神经元也成为了研究学术热点^[14-15]。

成功的取得纯度较高、生长状态良好的脊髓运动神经元取决于很多影响因素：包括适龄动物、取材手法、生长基质、培养基的选择及特异的纯化分离方法等^[16]。很多文献提倡使用胚胎大鼠^[17-18]，但是胚胎大鼠订购限制较多，实验周期长，取材操作繁琐，价格也远高于新生大鼠，所以作者尝试使用新生大鼠可否也达到满意的结果。实验还是采用了原始的胰蛋白酶消化，但是严格控制了胰蛋白酶的浓度及消化时间，并采用最合理的分步吹打法，既每10次吹打过后，静止2 min。这时候游离的单细胞在上面，而团块会沉到下面，把它们挪到指定容器里，下面沉淀下去的细胞团块加1-1.5 mL新鲜培养液，再进行轻柔吹打，静止2 min，转移上层的单细胞到刚才指定容器里，一共这样分步吹打3次。

实验中从新生大鼠脊髓腹侧组织分离得到的细胞中，成纤维细胞和胶质细胞可以反复增殖，而神经元细胞是分裂后的细胞，不能进行分裂与增殖，所以目前尚无彻底去除非神经元细胞的方法，只有尽可能去除非目的神经元细胞，从而来提高培养脊髓运动神经元细胞的纯度^[19-21]。本研究采用以下措施提高神经元的纯度：首先，在取材时利用精密微创手术器械在解剖显微镜下尽量选取新生大鼠腹侧脊髓，并尽可能的去掉所有的血管和血管膜，使取材的组织在解剖学上富含脊髓运动神经元，并确保任何过程都在冰浴的培养液中进行，这样便提高了脊髓运动神经元纯度和存活率。而后，采用了密度梯度离心法纯化培养脊髓运动神经元，因为6.8%的碘葡酰胺的密度正好介于脊髓运动神经元这种大细胞和其他一些小细胞之间^[22]，进行离心后，脊髓运动神经元细胞因密度小而位于碘葡酰胺层之上，其他细胞因密度大而沉降于管底，因此便可以达到分离脊髓运动神经元细胞的目的。实验中采用3 000 r/min的强离心力还可以加快达到平衡的速度，减少扩散的混合效应^[23]，从而使脊髓运动神经元绝大部分富集于F2层，进一步提高了脊髓运动神经元纯度。此外，实验还在细胞悬液接种前进行了差速贴壁^[24]。差速贴壁法就是利用不同细胞在分离培养接种后贴壁速度存在显著差异，从而来分离细胞。先将细胞悬液接种于培养皿中，然后置于37 ℃培养箱中孵育1 h，绝大多数成纤维细胞、胶质细胞、血细胞都贴壁在培养皿上，再收集未贴壁的细胞进行接种。实验中为了加快脊髓运动神经元细胞贴壁，每张盖玻片仅接种50 μL细胞悬液，这样就使培养液的悬浮力降低，细胞只需下降很小的一段距离就可以触及生长底物，减少了神经元细胞在接种悬液内下沉及贴壁的距离，约3 h后再补足需要的全培养液。通过实验结果得知，利用本实验方法培养的神经元纯度可达85.8%，脊髓运动神经元纯度也高达71.6%，能很好满足常规实验研究的需要。此外，也保证了神经元细胞高存活率，这也为后续进行病理、生理、药理学研究制造了良好的实验模型。

本实验中加入了人重组胶质细胞源性神经营养因子GMDF，它属转化生长因子B超家族成员，对多巴胺能神经元和运动神经元具有特异性作用，可以促进其存活、发育和再生以及特征的维持等，并且还能发挥全方面多效能的神经营养作用，是目前已知克隆到的最强的促运动神经元存活与生长的神经营养因子^[25-27]。部分文献推荐在培养早期加入阿糖胞苷，这是一种影响嘧啶代谢的抗代谢药物，但它在杀死胶质细胞的同时也会影响其释放神经生长因子，不利于神经元细胞生长^[28]。还有部分文献推荐使用无血清培养基^[29-30]，但是脊髓运动神经元的生长状况同样也会受到一定程度的抑制，所以本实验并没有采取上述两法，然而也取得了比较满意的结果。

综上所述，本实验方法为以后进一步应用新生大鼠脊髓运动神经元细胞的实验研究打下了基础，并成功的建立了新生大鼠脊髓运动神经元的纯化培养体系。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程