损伤角膜修复重建中的ROCK抑制剂：促进角膜细胞增殖、迁移和黏附

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.33.025

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (33): 5383-5388.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.33.025

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损伤角膜修复重建中的ROCK抑制剂：促进角膜细胞增殖、迁移和黏附

张仕祺^1，2，朱芸菲²，郭永龙¹，郑佳富^1，2，陈建苏^1，3

暨南大学，1再生医学教育部重点实验室，2生命科学技术学院生物技术系，3医学院眼科研究所，广东省广州市 510620

出版日期:2015-08-13 发布日期:2015-08-13
通讯作者: 陈建苏，博士,教授，暨南大学，再生医学教育部重点实验室，医学院眼科研究所，广东省广州市 510620
作者简介:张仕祺，男，1993年生，广东省南海市人，汉族，暨南大学在读本科生，主要从事角膜细胞的三维培养研究。
基金资助:
国家自然科学基金赞助 (81371689)

Role of ROCK inhibitor in corneal reconstruction: promoting the proliferation, migration and adhesion of keratocytes

Zhang Shi-qi^{1, 2}, Zhu Yun-fei², Guo Yong-long¹, Zheng Jia-fu^{1, 2}, Chen Jian-su^{1, 3}

1Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministry of Education, Jinan University, Guangzhou 510620, Guangdong Province, China; 2Department of Biotechnology, School of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510620, Guangdong Province, China; 3Institute of Ophthalmology, Medical School of Jinan University, Guangzhou 510620, Guangdong Province, China

Online:2015-08-13 Published:2015-08-13
Contact: Chen Jian-su, M.D., Professor, Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministry of Education, Jinan University, Guangzhou 510620, Guangdong Province, China; Institute of Ophthalmology, Medical School of Jinan University, Guangzhou 510620, Guangdong Province, China
About author:Zhang Shi-qi, Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministry of Education, Jinan University, Guangzhou 510620, Guangdong Province, China; Department of Biotechnology, School of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510620, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81371689

摘要/Abstract

摘要：

背景：随着人们对Rho/ROCK通路的生物学功能的了解的不断加深，新的ROCK抑制剂不断被发现，且ROCK抑制剂在角膜细胞存活、增殖和迁移中表现出良好的促进效果，ROCK抑制剂的研究能为再生医学和临床细胞移植提供更多的良好供体材料或种子细胞。

目的：总结并探讨ROCK抑制剂Y-39983和Y-27632在角膜病的治疗和应用的研究进展。

方法：应用计算机检索PubMed 数据库和中国知网数据库内相关文章，检索时间为2008至2015年，检索词为“corneal endothelial cell，corneal epithelial cell，ROCK inhibitor，Y-39983，Y-27632，ROCK抑制剂，角膜”，从中筛选出与主题相关的部分文献。

结果与结论：初检得到264篇文章，按主题相关性对文献进一步筛选，最终纳入45 篇文章进行讨论。应用到眼科的ROCK抑制剂主要有两种：Y-27632和 Y-39983，两者的应用主要还是基础研究与临床试验阶段。Y-27632可促进角膜缘上皮干细胞增殖及提高冻存复苏后的活性；Y-39983作为一种新型的ROCK抑制剂，其比Y-27632更有效地抑制ROCK激酶的活性，从而能更有效地促进角膜内皮的愈合。目前ROCK抑制剂在角膜治疗的研究较多，但是没有建立一种稳定的获得种子细胞的方法，每一种治疗方法都各有优缺点，而克服这些缺点以及找到快速稳定获得种子细胞的方法是今后的发展方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 角膜治疗, 眼表重建, ROCK抑制剂, Y-27632, Y-39983, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: With the deepen understanding on the biological function of Rho/ROCK pathway, new ROCK inhibitors continue to be discovered, and ROCK inhibitors show good promoting effects on the survival, proliferation and migration of keratocytes. Research on ROCK inhibitors will provide more donor materials or seed cells for regenerative medicine and clinical cell transplantation.

OBJECTIVE: To summarize and explore the progress in the treatment and application of corneal disease using the ROCK inhibitors Y-27632 and Y-39983.

METHODS: The PubMed database and CNKI database were retrieved by computer to search the relevant literature published between 2008 to 2015 using the key words of “corneal endothelial cell, corneal epithelial cell,
ROCK inhibitor, Y-39983, Y-27632” in English and Chinese, respectively. Relevant articles in line with the theme were screened and analyzed.

RESULTS AND CONCLUSION: Totally 264 papers were initially searched. At last, 45 papers were selected. Currently there are two main ROCK inhibitors: Y-27632 and Y-39983, but both of which are still in basic research stage and clinical testing stage. Y-27632 promotes the proliferation and activity of corneal epithelial stem cell after resuscitation; Y-39983 as a novel ROCK inhibitor can be better to inhibit Rho kinases activity than Y-27632, thereby more effectively promoting the healing of the corneal endothelium. There are many studies on the application of ROCK inhibitors in corneal treatment, but not a stable method established to obtain seed cells. Each method has its own advantages and disadvantages, and how to overcome these disadvantages and to find fast and stable access to seed cells is the future direction of development.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Cornea, Endothelial Cells, Eye

中图分类号:

R318

张仕祺，朱芸菲，郭永龙，郑佳富，陈建苏. 损伤角膜修复重建中的ROCK抑制剂：促进角膜细胞增殖、迁移和黏附[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(33): 5383-5388.

Zhang Shi-qi, Zhu Yun-fei, Guo Yong-long, Zheng Jia-fu, Chen Jian-su. Role of ROCK inhibitor in corneal reconstruction: promoting the proliferation, migration and adhesion of keratocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(33): 5383-5388.

图/表（结果） 1

2.1 ROCK和ROCK抑制剂 2.1.1 ROCK ROCK属于丝/苏氨酸蛋白激酶，分为 ROCKⅠ和 ROCKⅡ两种亚型，两者有非常高的同源性，但相对组织分布不同，表明其功能有一定差异。ROCKⅡ主要在大脑表达，而ROCKⅠ主要在非神经元组织表达，包括心脏、肺、骨骼肌等^[7-8]。ROCK主要分布于细胞的胞浆，具有调整细胞骨架成分运动的作用；此外在细胞核也有分布，可参与基因的表达调控^[9]。ROCK信号通路的主要生理功能为：调节细胞骨架蛋白的合成、降解、移动和收缩，并参与细胞基本生命过程，如细胞迁移、细胞增殖及细胞存活等^[10-11]。ROCK的高表达或ROCK的过度激活均可导致细胞的生长不良^[12] 2.1.2 ROCK抑制剂 ROCK抑制剂是一类人工合成的吡啶类复合物，通常其以载体介导的方式被细胞摄取，在细胞内结合到Rho蛋白下游效应器Rho激酶的催化位点抑制激酶活性，从而有效地调节ROCK的活性并使ROCK的活性保持在能促进细胞增殖、迁移和黏附的范围内^[2]。Okumura等^[13]通过实验确定了ROCK抑制剂的作用机制是抑制ROCK信号通路，从而上调PI-3激酶，而PI-3激酶又分别上调细胞周期蛋白D1/D3和Cdc25A，Cdc25A的上调也抑制了p27的表达，共同作用下调节G₁/S周期，最后促进细胞的增殖。目前，临床应用的一类新型ROCK选择性抑制剂为法舒地尔(Fasudil)^[14]，它的主要作用是改善和预防蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛及其引起的脑缺血症状；而应用到眼科的ROCK抑制剂主要有两种：Y-27632和Y-39983，两者的应用主要还是基础研究与临床试验阶段。 2.2 Y-27632 Y-27632是一种选择性蛋白激酶抑制剂，它能抑制ROCKⅠ和 ROCKⅡ两种亚型蛋白激酶的活性，从而调节肌球蛋白轻链的磷酸化，发挥调节细胞骨架结构、应力纤维形成和细胞收缩的功能^[15-17]。目前已在上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和神经细胞等模型上证实了Y-27632具有抑制ROCK激酶的作用。

2.2.1 Y-27632对角膜上皮细胞的作用角膜缘上皮干细胞位于角膜缘上皮基底层角巩膜缘处，具有丰富的再生潜能，其从角膜缘增殖、移行到中央角膜，更新衰老脱离的角膜上皮。随着1971年Davanger和Evensen^[18]首次提出角膜缘上皮细胞在角膜上皮的更新中发挥作用，1986年，Schermerf等^[19]应用免疫组化技术证实角膜上皮损伤后细胞增殖和移行来源于角膜缘。角膜缘干细胞是维持角膜上皮细胞稳定的重要组成部分，眼表的正常结构和功能的保持也依赖于角膜缘干细胞的增殖、分化、迁移完成^[20-22]。

Y-27632可促进角膜缘上皮干细胞增殖及提高冻存复苏后的活性：有实验结果表明，在兔角膜缘上皮细胞培养过程中添加10 μmol/L Y-27632，可显著促进细胞增殖^[23]，提高角膜缘上皮细胞的克隆形成能力。将体外扩增后的角膜缘上皮细胞进行冻存复苏后发现，添加了 10 μmol/L Y-27632中长期冻存(>14 d)复苏后的角膜缘上皮细胞，其细胞活性、增殖和克隆形成能力有明显提高；当在体外扩增和冻存复苏全程中添加10 μmol/L Y- 27632时，角膜缘上皮细胞经过冻存、复苏后的活性、增殖能力和克隆形成能力与其他组相比均有显著提高，且其活性和功能与冻存前的水平相当^[24]。

Y-27632对角膜上皮细胞具有保护作用：应用小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2)作为细胞模型，用含 Y-27632 的培养基孵育2 h，再用200 μmol/L H₂O₂处理2 h，结果显示Y-27632干预可以显著抑制H₂O₂诱导的小鼠TKE2细胞和小鼠角膜的氧化应激反应，并呈现典型的时间效应。它的两个作用机制分别是：Y-27632通过抑制H₂O₂诱导的NOX4的表达上调，降低了细胞在H₂O₂诱导下ROS水平的过度累积；Y-27632抑制了H₂O₂诱导的NRF2通路的活化，以及下游HO-1、NQO-1和Catalase等因子的过度表达，从而避免了NRF2信号通路过度活化引起的细胞应激反应^[12]。 Y-27632与HB-EGF共作用可促进角膜上皮创伤愈合：由于SV40永生化人角膜上皮细胞系（THCE）同样会表达并激活ROCK Ⅰ和ROCK Ⅱ型激酶，故可以THEC作为对象进行创伤愈合实验。进行划痕实验的结果显示，单纯加入10 μmol/L的Y-27632虽然能有效地抑制ROCK的表达，但未能有效地促进THCE的创伤愈合；同样，单纯加入肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)并未能促进THCE的创伤愈合。但是，同时加入10 μmol/L的Y-27632和50 ng/mL HB-EGF能促进THCE创伤的愈合，同时也能促进细胞迁移和黏附^[23]。

2.2.2 Y-27632对角膜内皮细胞的作用 Y-27632眼药水对角膜内皮细胞的作用Okumura等^[25]建立灵长类动物角膜内皮冻伤模型，每日向其滴加6次104 μmol/L的Y-27632作为实验组，4周后加入了实验组显示出六边形的肌动蛋白细胞骨架和规则的细胞形状。形态学扫描电子显微镜和ZO-1和Na+/K+ATP酶抗体进行荧光染色结果显示含104 μmol/LY-27632眼药水可以促进灵长类角膜内皮细胞的形态恢复成紧密的六角形并保持完整的屏障功能，证明其对灵长类角膜内皮创伤模型有治疗作用。同时，4例被诊断为中央角膜水肿患者和4例弥散全角膜水肿患者接受Y-27632眼药水的治疗，每日滴加6次。7 d后，他们的角膜内皮细胞密度明显比对照组患者的角膜内皮细胞密度要高，个别患者最佳矫正视力(BCVA)也得到提高。中央角膜水肿的患者在治疗6个月后角膜厚度明显下降，水肿显著减少，但弥漫全角膜水肿的患者治疗效果不明显。所有接受104 μmol/ LY-27632治疗的患者在6个月的观察中并无出现如眼压上升或全身并发症等并发症，证明Y-27632在眼科角膜内皮病变角膜水肿疾病临床治疗上有相当的发展前景^[26]。

Y-27632促进角膜内皮细胞增殖、迁移与黏附：通过对比向同样密度的牛角膜内皮细胞加入梯度浓度的Y-27632后的酶联免疫检测仪检测结果表示，加入 10 μmol/L的Y-27632牛角膜内皮细胞的存活率最高，进入S期和G₂期的细胞增多。流式细胞仪检测结果显示加入10 μmol/L Y-27632还可降低细胞凋亡率和细胞的死亡率^[17]。研究还发现，10 μmol/L的Y-27632促进牛角膜内皮细胞的早期贴壁率、黏附与贴壁，同时，Y-27632不会改变牛角膜内皮细胞的细胞特异性表型^[27]。向兔角膜内皮障碍模型注射兔角膜内皮细胞^[28-29]，通过对比相同的模型的空白对照、单纯注射兔角膜内皮细胞和注射100 μmol/L Y-27632与兔角膜内皮细胞3个组得出注射含有100 μmol/L Y-27632的兔角膜内皮细胞可以使角膜完全恢复透明。然而，在一个用机械刮除了食蟹猴角膜内皮的灵长类模型中，无论注射猴角膜内皮细胞时是否加入100 μmol/L Y-27632，均能使角膜恢复透明，但单纯注射猴角膜内皮细胞的组别展现出了成纤维细胞的表型，而注射了Y-27632+MCECs的组别则在免疫荧光染色结果中呈现出了单层六角形，且角膜内皮细胞密度远比单纯注射猴角膜内皮细胞的要高，同时结果显示Y-27632也能增强猴角膜内皮细胞增殖、迁移以及黏附能力^[30]。

Y-27632能提高球形角膜内皮细胞的活性：人体内的大多数细胞通过细胞间的相互作用及细胞外基质构成了特定的三维结构，从而形成了对细胞生理功能的维持至关重要的复杂的生化和机械信号网络^[29-31]。研究证实，细胞的球形培养能够使细胞在体外长期保持其应有的活力、功能和特有的表型^[32-34]，而三维球形细胞培养则是学者们近年来的研究热点。以人角膜内皮细胞为例，人角膜内皮细胞球形方法有许多，见文献[33]。

向上述初级球形人角膜内皮细胞中加入30 μmol/ LROCK抑制剂Y-27632在37 ℃下培养，10 d后可观察到单个人角膜内皮细胞从球形人角膜内皮细胞中向培养板迁移。流式细胞术和免疫荧光染色结果表明用Y-27632处理的人角膜内皮细胞的Ki67阳性细胞和Na+/K+ATP酶数量显著比不加入Y-27632的要高，而在正常培养中并没有观察到这种结果，说明加入ROCK抑制剂Y-27632的球形培养能提高人角膜内皮细胞跨膜转运蛋白的活性^[35]。

2.3 Y-39983 Y-27632虽然能有效地促进角膜细胞的增殖、迁移以及黏附，但其能抑制其他激酶，且其不符合药品生产质量管理规范(GMP)^[36]，因此，限制了其进一步的应用。Y-39983作为一种新型的ROCK抑制剂，其比Y-27632更有效地抑制ROCK激酶的活性，从而能更有效地促进角膜内皮的愈合^[15-16]。 2.3.1 Y-39983比Y-27632更有效地促进角膜内皮细胞的增殖加入ROCK抑制剂Y-27532和Y-39983培养的猴角膜内皮细胞的增殖效果是不加入ROCK抑制剂的1.2至1.5倍，EdU免疫荧光染色结果显示加入Y-27632或Y-39983均可以促进猴角膜内皮细胞的增殖，且当使用0.3 μmol/LY-39983时就可以达到加入10 μmol/L Y-27632的效果。加Y-39983与人角膜内皮细胞共培养24h，对加入了不同浓度Y-39983的人角膜内皮细胞进行BrdU掺入法评估细胞增殖，结果发现加入Y-39983后得到1.6-1.8倍的提升。同时对其进行Ki67免疫荧光染色，通过倒置显微镜观察并评估其百分比，结果显示在浓度为0.03-3 μmol/L之间Ki67的表达也会随着Y-39983的浓度增加而提高^[37]。

2.3.2 少量的Y-39983眼药水就可使兔子角膜创伤模型得到较好的恢复以日本大耳白兔作为实验对象，通过液氮冷冻建立大疱性角膜疾病模型^[37]，用不同浓度的Y-39983进行局部给药，48 h后测定创伤面积并用茜素红染色发现使用了Y-39983的模型角膜倾向于比不使用Y-39983的模型要清晰切950 μmol/L的Y-39983最大地减少了创伤面积。对创口外缘未受伤的细胞进行免疫荧光染色，结果表明加入了Y-39983的组别的Ki67阳性细胞数量均比对照组提高^[37]。

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引言

Rho激酶(Rho kinases，ROCKs)是参与细胞有丝分裂黏附、细胞骨架调整、肌肉细胞收缩、肿瘤细胞浸润等一系列细胞生命现象的重要酶^[1]。同时，ROCKs是细胞内多条信号转导通路的关键分子，作为分子开关在胞内信号转导中发挥桥梁作用，故其在多种细胞均有表达；ROCK激活后的直接作用是调节细胞骨架的收缩，可见ROCK对细胞骨架活动的调节非常重要，而ROCK的高表达或ROCK的过度激活均可导致细胞的生长不良。而ROCK抑制剂则能有效地调节ROCK的活性，从而促进细胞生长^[2]。角膜为眼球前壁的一层透明膜，覆盖虹膜、瞳孔及前房，并为眼睛提供大部分屈光力。角膜作为眼屈光介质的一部分，其透明性和组织韧性对眼睛有极重要的作用。到目前为止，角膜移植为不可逆性角膜损伤的最主要的临床治疗方法。自1905年人类第一例角膜移植成功案例以来，角膜移植手术挽救了许多角膜盲患者^[3]。虽然这种方法非常有效，但是并发症、免疫排斥和供体角膜严重不足等问题仍是一个世界性的难题^[4-6]。而用患者自体的角膜相关细胞通过体外培养增殖再移植回患者体内可以克服上述角膜移植的不足。近年来，随着人们对Rho/ROCK通路的生物学功能的了解的不断加深，新的ROCK抑制剂不断被发现，且ROCK抑制剂在角膜细胞存活、增殖和迁移中表现出良好的促进效果，许多学者对 Rho/ROCK通路及ROCK抑制剂在眼科领域中的作用进行了广泛而深入的研究。因此，ROCK抑制剂对角膜细胞培养的影响值得关注。文章就近年来几种常用于眼科实验的ROCK抑制剂在角膜治疗的应用及进展进行综述如下。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

3.1 ROCK抑制剂的特点 ROCK抑制剂Y-27632和Y-39983均能有效地抑制ROCK的表达和Rho激酶的激活，对角膜上皮细胞和角膜内皮细胞的增殖、迁移和黏附均有促进作用，其效果及最佳浓度如下表所述(表1)。且Y-27632和Y-39983对各种动物角膜内皮和角膜上皮疾病模型有良好的治疗作用，如下表所述(表2)。

Y-27632可以促进角膜上皮细胞以及角膜缘上皮干细胞的增殖，而值得注意的是，10 μmol/L的Y-27632和 50 ng/mL HB-EGF能促进角膜上皮的愈合。另外，Y-27632有保护角膜上皮细胞的作用。在众多的实验中，新型的ROCK抑制剂Y-39983证实能比Y-27632更有效促进角膜细胞的增殖、迁移和黏附，但Y-39983对临床角膜病的治疗和应用有待完善。 3.2 ROCK抑制剂的意义 ROCK抑制剂在对上文中的眼科疾病的治疗上均显示出了良好的治疗作用，它的发现和发展为眼科疾病的治疗带来了新的思路。在早期的眼科治疗中，ROCK抑制剂的应用大多数以眼药水的形式作为治疗青光眼的药品，如：H-7、H-1077和HA-1152，它们容易透过细胞和组织，对角膜有较好的通透性，其对Rho激酶有一定的抑制作用，它们能通过改变前房角的小梁网的收缩力和小梁细胞的行为来降低眼压(IOP)^[37-40]，动物实验证实实验眼较对照眼眼压有明显差异的下降且无明显眼部不良反应。在最新的研究中，也有用AR-13324来降低IOP，并且有增加房水流通和减少房水形成的作用^[41]。在目前的研究中，ROCK抑制剂在角膜疾病临床治疗带来的副作用是很小的，且Y-27632和Y-39983促进角膜内皮细胞增殖和迁移的机制也已经被明确，Y-27632和Y-39983均会激活Pi3激酶，随后分别调节G1/S所需的两条通路：上调细胞周期蛋白D和下调p27；此外，它们还会极大地增强CDC25A的表达，从而促进Cdk2的活化^[42-43]。早期的研究曾指出，3T3成纤维细胞在用C3使Rho蛋白失活后，细胞的G₁/S期会被打断^[44-45]，这提示ROCK抑制剂对细胞增殖的影响是因细胞种类而异的。另外，Y-39983表现出对角膜细胞增殖、黏附和迁移的增强程度要比Y-27632要高，所以Y-39983在角膜治疗的作用应该得到我们的重视。 ROCK抑制剂在角膜疾病治疗的研究，未来将会围绕着寻找最佳的给药方式，确定角膜细胞体外扩增的最佳条件，探究其对角膜愈后的影响等方面进行。同时需要观察细胞与载体、细胞与细胞之间的相互作用，这对于深入了解ROCK抑制剂对角膜细胞机制有重要的指导和参考价值。随着ROCK抑制剂研究的发展，期待ROCK抑制剂早日在临床上得到广泛的应用，降低角膜疾病治疗的风险与成本，解决角膜供体缺乏、移植后免疫排斥等问题，使角膜重建存在的各种问题和困难将得以解决，角膜盲患者重新得到光明成为可能。 3.3 ROCK抑制剂的局限性早期ROCK抑制剂H-7、H-1077和HA-1152均为异喹啉的衍生物，由于它们并没有很高的特异性和它们的50%抑制浓度(IC50)过高，不宜成为角膜治疗的药物^[37-40]。目前，ROCK抑制剂在角膜疾病治疗仍有许多难题，这些问题有待国内外学者进一步的研究和观察，Y-27632虽然能促进角膜上皮细胞创伤的愈合，但是Y-27632的使用会使角膜上皮细胞的紧密连接受到影响，因此Y-27632对角膜上皮细胞的影响具有双重性^[23]。目前也未有实验探讨Y-39983对角膜上皮细胞的影响。因此，ROCK抑制剂对角膜上皮的作用有待深入。另外，Y-27632和Y-39983对角膜基质细胞的作用也未见报道；未来如能进一步深入ROCK抑制剂对角膜相关细胞的作用及机制研究，才能使其更好的应用到临床治疗角膜病变及角膜盲患者。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

损伤角膜修复重建中的ROCK抑制剂：促进角膜细胞增殖、迁移和黏附

Role of ROCK inhibitor in corneal reconstruction: promoting the proliferation, migration and adhesion of keratocytes

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