二膦酸盐与顺铂对体外MG-63细胞株生长影响的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.33.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明二膦酸盐可以作用于骨肉瘤细胞，但是其作用效果与传统的一线化疗药物顺铂的效果对比分析目前报道较少。

目的：分析二膦酸盐对体外人骨肉瘤细胞产生抑制增殖、诱导凋亡的作用与顺铂的差异。

方法：对MG-63细胞株培养传代后，分别以不同质量浓度二膦酸盐、顺铂干预细胞，并设未干预组为阴性对照组，通过MTT法测定二膦酸盐及顺铂作用后人骨肉瘤细胞的抑制率，并通过荧光染色观察细胞形态。

结果与结论：不同质量浓度的二膦酸盐及顺铂处理MG-63细胞不同时间后，细胞生长抑制率与空白组(无药物干预)对照明显升高(P < 0.05)。分析发现两者在24，48，72 h率的差异无显著性意义(P > 0.05)。认为二膦酸盐对体外骨肉瘤细胞的生长有明显的抑制作用，其抑制作用与顺铂相似。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 二膦酸盐, 顺铂, 骨肉瘤, MG-63

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that bisphosphonates can act on osteosarcoma cells, but the comparative analysis of bisphosphonates and cisplatin, a traditional first-line chemotherapy drug, is rarely reported.

OBJECTIVE: To investigate the differences between bisphosphonates and cisplatin to inhibit in vitro proliferation of osteosarcoma cells and induce cell apoptosis.

METHODS: Subcultured MG-63 cell lines were intervened with different concentrations of bisphosphonates and cisplatin, respectively, and cells with no treatment served as negative controls (blank group). Cell inhibition rate was detected using MTT method, and cell morphology was observed using fluorescent staining.

RESULTS AND CONCLUSION: After intervention with different concentrations of bisphosphonates and cisplatin for different time, the growth inhibition rate of MG-63 cells was significantly higher as compared with the blank group (P < 0.05). But there was no difference in the growth inhibition rate between the bisphosphonates and cisplatin groups at 24, 48 and 72 hours (P > 0.05). These findings indicate that bisphosphonates has obvious inhibitory effect on the growth of osteosarcoma cells in vitro, and its inhibitory effect is similar to that of cisplatin.

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Key words: Diphosphonates, Cisplatin, Osteosarcoma

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

2.1 不同质量浓度二膦酸盐对MG-63生长的抑制率不同质量浓度(50，100，200，400 mg/L)的二膦酸盐处理MG-63细胞不同时间(24，48，72 h)后，以空白为对照组(0 mg/L)，细胞生长抑制率见表1，分别与对照组比较，不同质量浓度组分别与对照组行配对t 检验，认为差异有显著性意义(P < 0.05)，即二膦酸盐对MG-63细胞株体外抑制有明显的作用。采用Spearman符号秩和检验，认为二膦酸盐对MG-63的抑制率其药物浓度及作用时间呈正相关(P < 0.05)。

2.2 不同质量浓度的顺铂对MG-63细胞的抑制率不同质量浓度(25，50，100，200 mg/L)的顺铂处理MG-63细胞不同时间(24，48，72 h)后，以空白为对照组(0 mg/L)，细胞生长抑制率见表2，分别与对照组比较，不同质量浓度组分别与对照组配对t 检验，认为差异有显著性意义(P < 0.05)，即顺铂对MG-63细胞株体外抑制有明显的作用。采用Spearman符号秩和检验，认为顺铂对MG-63的抑制率其药物浓度及作用时间呈正相关(P < 0.05)。

2.3 二膦酸盐与顺铂对MG-63的抑制的比较见表1及表2，二膦酸盐及顺铂对MG-63细胞株生长的抑制率比较，经t 检验发现两者在24，48，72 h率的差别无显著性意义(P > 0.05)。认为二膦酸盐与顺铂在体外对人骨肉瘤细胞的抑制作用相当72 h抑制率的差异无显著性意义(P > 0.05)。认为二膦酸盐与顺铂在体外对人骨肉瘤细胞的抑制作用相当。

2.4 免疫荧光染色细胞学形态观察结果对空白对照组以及不同剂量二膦酸盐及顺铂干预72 h组细胞行免疫荧光染色观察，正常细胞核清晰可见形态均一；阳性细胞核稀少、固缩荧光增强、核裂解(见图1，2)。

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引言

肿瘤骨转移的临床表现主要是疼痛、高钙血症及病理性骨折，最常见于癌症晚期，主要因为肿瘤细胞释放破骨细胞激活因子，刺激破骨细胞对骨质的吸收，导致骨溶解破坏和肿瘤细胞分泌一些致痛介质如前列腺素、乳酸等。双膦酸盐也叫唑来膦酸，是一种特异性地作用于骨的二膦酸化合物，它能抑制因破骨活性增加而导致的骨吸收，目前长期使用于骨转移瘤的治疗。较多的对乳腺癌以及前列腺癌骨转移的患者，利用双膦酸盐治疗抑制患者疼痛有良好疗效，还可以延缓骨骼病变，可明显改善骨转移患者的生活质量且不良反应轻微，患者可耐受，是治疗转移性骨疼痛安全、有效的方法。骨肉瘤是从间质细胞系发展而来，肿瘤迅速生长是由于肿瘤经软骨阶段直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织。下肢负重骨在外界因素(如病毒)的作用下，使细胞突变，可能与骨肉瘤形成有关。典型的骨肉瘤源于骨内，另一种与此完全不同类型的是与骨皮质并列的骨肉瘤，源于骨外膜和附近的结缔组织。后者较少见，预后稍好；前者在原发性骨肿瘤中发病率最高，约占35%，好发于青少年，恶性程度高，远处转移早，预后差。目前骨肉瘤治疗上悬而未决的问题是现有化疗药如顺铂，大多为细胞毒性药物^[1]，无特异性，敏感性不高，新辅助化疗的大剂量长期联合用药毒副作用大，容易出现严重的骨髓抑制、心肌、肾脏、性腺等损害，肿瘤的耐药性等问题没有解决，化疗药物的敏感性评价较困难等等，因此新一类敏感而有效、且全身毒副作用小的药物的研究显得十分重要。骨肉瘤突出症状是肿瘤部位的疼痛，由肿瘤组织浸蚀和溶解骨皮质所致。因此，是否能使用二膦酸盐针对转移瘤骨痛的显著疗效来治疗骨肉瘤，抑制骨肉瘤的骨痛，同时能否对骨肉瘤细胞的生长起到一定的抑制作用，目前尚没有明确的定论。目前，二膦酸盐针对骨肉瘤的治疗有一些学者开始尝试性临床使用，效果较好，但是其作用机制尚不十分明确。因此，本实验通过对二膦酸盐、顺铂对体外骨肉瘤细胞生长的抑制的对比分析，了解二膦酸盐对骨肉瘤的治疗作用的分子基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

设计：分组对照观察、细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年1月至2014年12月在新疆医科大学动物实验中心完成。

材料：

试剂：唑来膦酸盐zoledronic acid(ZOL)，AnnexinV- FITC用I双染试剂盒购于BD公司，MTT购于sigma公司。

细胞株：人骨肉瘤MG-63细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

实验方法：

细胞培养与传代：MG-63细胞培养于含体积分数10%FBS的DMEM高糖培养液中，置于体积分数5%CO₂孵育箱内37 ℃恒温培养，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，PBS冲洗2次，用0.25%的胰酶消化几分钟，镜下观察胞质回缩、细胞间隙增大，立即加入含血清培养液终止消化，吸管反复吹打成单细胞悬液，细胞计数，分瓶培养，取对数生长期细胞用于实验。细胞每隔3-5 d传代。

细胞活力测定：细胞加入0.4%锥虫蓝，1.0-2.0 min内在倒置显微镜下计数细胞总数和死亡细胞数，镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染，以活细胞的百分数代表细胞活力。细胞计数法：采用血细胞计数法。用乙醇清洁法计数板及盖玻片，制备单细胞悬液用枪头加入微量细胞悬液，不要溢出盖玻片。在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计数左侧和上方，不计右侧和下方。将计数结果代入公式：细胞数/毫升原液=4大格细胞总数/4)×10⁴×稀释倍数。

MTT法检测细胞抑制率：取对数生长期细胞，接种于96孔培养板，细胞接种浓度为1×10⁷L^-1。设计二膦酸盐实验组的终质量浓度分别50，100，200，400 mg/L，并设未干预组为阴性对照组，每组设8个复孔。将96孔分别在培养箱中培养24，48，72，96 h后，各孔分别加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，继续于培养箱中培养4 h后弃去上清，每孔加150 μL的二甲基亚砜，震荡溶解。用全自动酶标仪(Bio-Rad)在波长490 nm测吸光度(A)值，计算生长抑制率。

生长抑制率(%)=(1-实验组A值/阴性对照组A值)× 100%。同样方法测定顺铂对MG-63的抑制率，顺铂质量浓度25，50，100，200 mg/L。

免疫荧光染色：在6孔板内放置盖玻片，将细胞接种于盖玻片上，细胞过夜贴壁，加含二膦酸盐浓度50 mg/L为参考浓度，并以未加干预为对照组，作用72 h后，加入新鲜配置1∶3混合的冰醋酸/甲醇固定液，干燥；用新鲜Hoechst33258染料溶液染色30 min，滴加pH 5.5柠檬酸缓冲液封固；使用荧光显微镜观察并拍照。

主要观察指标：①不同质量浓度二膦酸盐对MG-63生长的抑制率。②不同量浓度的顺铂对MG-63细胞的抑制率。③二膦酸盐与顺铂对MG-63的抑制的比较。④免疫荧光染色细胞学形态观察结果。

统计学分析：实验结果采用SPSS 15.0统计软件进行t检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤，又称为成骨肉瘤，是一种恶性骨肿瘤，多发生在20岁以下的青少年或儿童。骨肉瘤是从间质细胞系发展而来，由于肿瘤经软骨阶段直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织使得肿瘤迅速生长。骨肉瘤在小儿骨恶性肿瘤中最为常见，约为小儿肿瘤的5%。骨肉瘤的突出症状是肿瘤部位的疼痛，因肿瘤组织浸蚀和溶解骨皮质所致。现代肿瘤学认为骨肉瘤是一种全身性的恶性肿瘤^[2]，80%患者就诊已有微小癌灶的全身血液转移，因此提高骨肉瘤患者远期生存率的关键是全身化疗，控制转移。对骨肉瘤的治疗，一般认为骨肉瘤是一种相对耐药的肿瘤，单药化疗的效果一直不很理想，目前的标准化化疗方案均以顺铂为主，包括使用异环磷酰胺和阿霉素，雷帕霉素等多药联合化疗，其有效率大多数不超过15%，新辅助化疗的大剂量长期联合用药毒副作用大，容易出现严重的骨髓抑制、心肌、肾脏、性腺等损害，肿瘤的耐药性等问题没有解决，化疗药物的敏感性评价较困难等等，2009年ESMO推荐公认有效且常用的一线化疗药物分别是(I b，A类证据)DDP、MTX、ADM和IFO^[3]，其毒副作用发生率非常高^[4]。唑来膦酸是一种特异性地作用于骨的二膦酸化合物，它能抑制因破骨活性增加而导致的骨吸收。二膦酸化合物对骨组织选择性作用依赖于其对矿化骨的高亲和性作用的分子机制还不清楚。长期动物研究表明，唑来膦酸可抑制骨吸收，但对骨的形成、骨的矿化及力学特性没有不良影响，在初始24 h内，给药量的(44±18)%排泄到尿中，其余的主要滞留在骨组织中。唑来膦酸与血细胞没有亲和性，与血浆蛋白的结合性也较低(大约为22%)，而且不依赖于唑来膦酸的浓度，将注射时间从5 min增加到15 min，在注射结束时，唑来膦酸浓度降低了30%，但对AUC没有影响。同时，其在体内与骨表面羟磷灰石有超强亲和力，较为优先沉积在骨组织。通过直接抑制破骨细胞生成和刺激成骨细胞分泌骨保护素,其在骨组织代谢和其他软组织肿瘤中作用研究报告时有出现^[5-7]。基础研究发现：二膦酸盐通过抑制肿瘤细胞甲羟戊酸途径，阻碍一些小的GTP酶(包括ras家族相关蛋白)的异戊烯化，使调控ras信号通路中Erk、Akt激活途径，其可调节肿瘤细胞生长,并在前列腺癌、胰腺癌、骨髓瘤等肿瘤细胞株中都已证实^[8-10]。唑来膦酸的作用机制一般分为两大部分^[11-15]：即对成骨细胞的影响及对破骨细胞的影响。通过大量的试验表明，唑来膦酸(双膦酸盐)能够通过下调核因子κB配体(RANKL)的同时上调骨保护素接地影响了成骨细胞对双膦酸盐的再吸收，同时表明，唑来膦酸质量浓度的不同，可能对骨保护素产生促进或者抑制作用，同时增强了骨细胞与成骨细胞的骨形成能力。其产生效果的途径包括：①与骨小梁结合，这种结合起到保护骨质的作用，起到了减少肿瘤细胞与骨结合导致骨转移瘤的发生。②能有效诱导破骨细胞活性并诱导其凋亡，其机制主要是抑制了骨机制金属蛋白酶水解活性达到抑制骨溶解过程，从而抑制溶骨性病变的发生。③通过抑制肿瘤坏死因子、前列腺素等炎症递质的释放，从而缓解骨痛。④通过诱导细胞凋亡，抑制血管生成因子的释放来达到抑制肿瘤生长的目的。骨肉瘤发生发展过程中，激活溶骨性坏死，血钙水平的升高是骨肿瘤的一大特性^[16-22]，有文献比较唑来膦酸与帕米膦酸二钠治疗恶性高钙血症的临床研究，结果显示在降低恶性高钙血症后维持正常血钙水平的时间上和治疗患者脱落时间上，唑来膦酸明显优于帕米膦酸二钠^[23]。因此，作者设计本实验，了解二膦酸盐能否对骨肉瘤体外细胞的生长抑制作用。通过本实验，以不同浓度的二膦酸盐及顺铂处理MG-63细胞不同时间后，而两组分别与对照组比较，认为二膦酸盐对MG-63细胞株体外抑制有明显的作用，采用Spearman相关分析，认为二膦酸盐对MG-63的抑制率与作用时间呈正相关，而二膦酸盐质量浓度大于50 mg/L后其浓度依耐性无显著差距。细胞生长抑制率构成比分析发现两组在24，48，72 h率的差别无显著性意义，即认为二膦酸盐与顺铂在体外对人骨肉瘤细胞的抑制作用相当。顺铂常见的不良反应有：过敏反应、心血管系统异常(心律失常、心电图改变等)、中枢神经系统症状(周围神经损伤、上下肢麻木、运动失调等，跟用药剂量有关，总剂量超过300 mg/m²易出现)、肾毒性、代谢内分泌影响(电解质紊乱、低镁血症、低钙血症等)、肝脏影响(低蛋白血症、氨基转移酶升高等)、胃肠道反应、血液系统影响(白细胞或血小板减少、骨髓抑制等)、脱发、耳鸣、听力减退等等。顺铂的不良反应发生率多数跟用药剂量有关，还有就是个体差异，它的不良反应治疗通常是对症处理。二膦酸盐不良反应一般为发热(18.1%)、肌痛(9.4%)、流感样症状(7.8%)、关节痛(6.8%)、头痛(6.5%)、绝大多数出现于用药后3 d内且再次服药不良反应发生率降低^[24-25]，因此，其安全性远远高于顺铂。随着对二膦酸盐的研究越来越多，其作用机制也越来越清楚，特别是对转移瘤的治疗机制^[26-30]。但是在机体内二膦酸盐是否可以达到顺铂的抑制骨肉瘤的同等效果，以及二膦酸盐就可以取代顺铂对骨肉瘤的化疗地位，尚需要大量的多中心的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程