单纯冷藏与低温机械灌注保存肝移植前后炎症因子和凋亡因子的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.33.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：单纯冷藏是自肝移植开展40年来临床采用的主要保存方法，虽然采用机械灌注行肝移植在国外有成功案例，在国内并没有规模性开展。

目的：考察单纯冷藏与低温机械灌注保存对肝移植前后的炎症因子和凋亡因子的影响。

方法：将犬随机分为供体组、单纯冷冻保存组和低温机械灌注保存组，每组30只。供体犬取出的肝经单纯冷冻保存移植给单纯冷冻保存组犬；单纯冷冻保存组犬取出的肝经低温机械灌注保存移植给低温机械灌注组犬；供体犬行安乐死弃去；低温机械灌注保存组犬取出的肝用于其他实验。随机选择单纯冷冻保存组和低温机械灌注保存组肝移植成功犬各20只进入结果分析。

结果与结论：取肝时，单纯冷冻保存组和低温机械灌注保存组犬的炎症因子和凋亡因子差异无显著性意义(P > 0.05)；两组P53在取肝、移植前和移植后差异均无显著意义(P > 0.05)；移植前，两组白细胞介素1和白细胞介素8无显著差异(P > 0.05)，与单纯冷冻保存组比，低温机械灌注保存组的肿瘤坏死因子α、巨噬细胞炎性蛋白1α、巨噬细胞炎性蛋白1β、CC趋化因子配体20和FASR显著降低(P < 0.01)；移植60 min，与单纯冷冻保存组比，低温机械灌注保存组的白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素8、巨噬细胞炎性蛋白1α、巨噬细胞炎性蛋白1β、CC趋化因子配体20、FASR和核转录因子κB显著降低(P < 0.01)。结果说明低温机械灌注保存比单纯冷冻保存明显降低炎症因子和凋亡因子，有利于肝移植。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 肝移植, 单纯冷藏, 低温机械灌注, 炎症因子, 凋亡因子

Abstract:

BACKGROUND: Static cold storage is the main storage method of liver transplantation in the past 40 years. There are success cases in foreign countries about the use of mechanical reperfusion in liver transplantation, but there is no large-scale development in China.

OBJECTIVE: To investigate and compare the inflammatory cytokines and apoptotic factors in isolated liver between static cold storage and hypothermic machine perfusion before and after liver transplantation.

METHODS: There were donor group, static cold storage group and hypothermic machine perfusion group in the study, and 30 dogs were in each group. Liver specimens from donor dogs were subjected to static cold storage and then transplanted into dogs in the static cold storage group. Liver specimens from dogs in the static cold storage group were subjected to hypothermic machine perfusion and then transplanted into dogs in the hypothermic machine perfusion group. Liver specimens from dogs in the hypothermic machine perfusion were used in other experiments. Dogs in the donor group were euthanatized. After liver transplantation, 20 dogs from static cold storage group and hypothermic machine perfusion group were selected respectively for further study.

RESULTS AND CONCLUSION: When the liver was separated from the dogs, inflammatory cytokines and apoptosis factors had no significant difference in the static cold storage group and hypothermic machine perfusion group (P > 0.05). P53 expression in these two groups had no significant difference before and after transplantation (P > 0.05). Interleukin-1βand interleukin-8 in these two groups had no significant difference before transplantation (P > 0.05). Compared with the static cold storage group, expressions of tumor necrosis factor-α, macrophage inflammatory protein-1α, macrophage inflammatory protein-1β, CC chemokine ligand 20 and FASR were significantly lower in the hypothermic machine perfusion group before transplantation (P < 0.01). Compared with the static cold storage, interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, interleukin-8, macrophage inflammatory protein-1α, macrophage inflammatory protein-1β, CC chemokine ligand 20, FASR and nuclear factor-κB were reduced significantly in the hypothermic machine perfusion group at 60 minutes after transplantation (P < 0.01). Taken together, hypothermic machine perfusion can significantly reduce inflammatory cytokines and apoptosis factor, which is conducive for liver transplantation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Liver Transplantation, Freezing, Cryopreservation, Apoptosis

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

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引言

近40年国内肝移植水平已进入相对成熟的阶段，标志国内器官移植事业发展进入一个较高的水平，国内可实施肝移植单位超过50家，2000年已成功实施了231例肝移植手术，在肝移植方面积累了较多的实践经验。肝移植成功与否与诸多因素有关，如肝供体保存条件、保存时间、手术方法和移植后排斥移植等，其中肝供体保存是肝移植前期首要考虑的问题，因为国内移植供肝主要为尸体供肝，受者与供体的物理距离较大，进一步强化了供肝保存要求^[1-2]。单纯冷藏是自肝移植开展40年来临床采用的主要保存方法：将肝脏均匀迅速地降温到10 ℃以下，再将供肝充分浸泡在冷保存液中保持温度为1-4 ℃直至移植^[3]，保存时间可延长至6 h，同时保留了线粒体和移植后能量代谢功能。近年持续增加的肝移植需求推动了供肝利用标准，20世纪90年代，低温机械灌注(hypothermic machine perfusion，HMP)应用于肾移植，多中心肾移植临床试验显示离体肾的机械灌注优于单纯冷藏^[4-5]。当机械灌注在肾移植处于较为成熟阶段，人们开始考虑该技术能否应用于肝移植。Morino等^[6]采用UW液对犬肝脏行机械灌注，用灌注液持续灌洗的犬肝能保存3 d以上^[7]。Tolboom等^[8]研究心跳骤停的大鼠肝脏经45 min热缺血和2 h的低温保存后，在体外UW液行4 h机械灌注与单纯冷藏保存于UW液对照肝脏比，移植4周存活率均为100%。Guarrera等^[9]采用机械灌注的肝供体行移植手术，结果显示早期肝功能不全发生率低、胆道并发症减少和住院时间缩短。虽然采用机械灌注行肝移植在国外有成功案例，但在国内并没有规模性开展。另外，肝移植后常见的并发症如感染、排斥、血管并发症与胆道并发症等，这些并发症与肝脏的缺血再灌注损伤紧密联系，宏观看，缺血再灌注不仅阻碍组织和器官功能恢复，而且会加重组织器官的功能障碍；微观看，组织器官功能障碍与炎症与凋亡两个病理模块密切相关^[10]，也常常作为缺血再灌注损伤严重程度的两个重要的评估指标。本课题以雄性犬行肝移植术为研究基础，考察2种保存肝供体组在取肝、移植前和移植后60 min 3个时间点活检取的肝脏的炎症因子和凋亡因子，评估不同离体肝保存方式的区别，力求寻找低温机械灌注优越于单纯冷藏的可能机制，为临床研究、治疗肝移植和预后提供依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年10月至2013年12月在内蒙古医科大学附属医院科研平台试验室进行并完成。

实验动物：雄性犬90只，体质量9-12 kg，由内蒙古大学实验动物研究中心提供，定时投料，单独圈养，清洁环境饲养，自由饮水，12 h昼夜生活环境。

低温保存对肝移植前后炎症因子和凋亡因子的影响实验用主要仪器：
仪器	来源
隔水式电热恒温培养箱	上海跃进医疗器械厂
HDI 3500 B超检查仪	美国ATL公司
BM-25 血液透析泵	美国Baxter公司
-80 ℃低温冰箱	美国Forma Scientific公司
AK-10单泵	瑞典Gambro公司
水浴锅	上海跃进医疗器械厂
一次性静脉营养输液袋	上海曹杨医药用品厂

实验方法：

分组：将犬随机分为供体组、单纯冷冻保存组和低温机械灌注保存组，每组30只。肝移植流程如下操作：取A、B和C 3只体质量、年龄相当的犬，取A犬肝，经单纯冷冻保存移植至B犬，B犬的肝取出经低温机械灌注保存移植至C犬，A犬行安乐死弃去，C犬的肝取出用于其他实验。即供体组取出的肝经单纯冷冻保存移植给单纯冷冻保存组；单纯冷冻保存组取出的肝经低温机械灌注保存移植给低温机械灌注组；供体犬行安乐死弃去；低温机械灌注保存组取出的肝用于其他实验。

供体切取及保存方法：术前1 d麻醉后行B超检查，测得所有犬的肝动脉、门静脉的直径及血流速度，依据单位时间径流量计算公式：πR²хν(R=半径，ν=流速) 算出犬肝动脉及门静脉的灌注流量。术前禁食12 h，禁水4 h。本试验严格在无菌条件下进行，SPF级犬全麻后建立中心静脉输液、动脉采血通道、气管插管和呼吸机控制。取腹部正中切口，逐层解剖止血，依次游离胆总管、门静脉和肝动脉及其周围组织。缝扎右膈静脉、左膈静脉及左后膈静脉。中心静脉快速输液。立即行腹主动脉和门静脉插管灌注 4 ℃羟基柠檬酸(HCA)肾保存液1 500 mL，然后改4 ℃ UW液(University of Wisconsin Solution)灌注1 000 mL，总量约5 000 mL。经胆囊插管以4 ℃ 500 mL HCA液灌注胆道。灌注过程中肝脏表面及腹腔不断添加冰屑使肝脏快速降温^[11-12]。此时肝脏表面颜色均匀、泛淡黄色、流出液无血性液。灌注完毕后切取供肝，快速切下肝脏。置入空盆中称质量后置入4 ℃生理盐水中保存。单纯冷冻保存组的肝供体低温保存至移植手术。

低温机械灌注保存组的肝供体处理：称质量的肝供体，行肝动脉、门静脉插管及胆囊置管引流，连接循环开始灌流。灌注流量按取肝前B超测定为准。记录体外肝脏的热缺血时间、灌流时间。观察体外肝脏一般情况，灌注60 min。两个组别的供体切取保存到移植至受体移植的时间间隔约3.0 h^[13]。

肝移植：移植前，所有肝供体均采用1 L的Hextend 灌冲液(BioTime，Inc.，Berkeley，CA)由门静脉灌洗肝脏内的残留液。手术方式均为改良背驮式肝移植，移植中不采用静脉转流。胆管吻合方式为胆总管-胆总管端端吻合或胆总管-空肠吻合，不放置T管。移植后给予保温，单笼喂养。

标本处理：分别于两组的取肝、移植前和移植后60 min活检抽取部分肝组织，冷冻-70 ℃，备用。

主要观察指标：①炎症因子检测：采用反转录聚合酶链反应(RCR)检测白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素8、巨噬细胞炎性蛋白1α、巨噬细胞炎性蛋白1β、CC趋化因子配体20。②凋亡因子检测：采用反转录聚合酶链反应检测P53蛋白、FASR；免疫组织化学法检测核转录因子。

统计学分析：所有数据输入SPSS 13.0统计软件，计量资料采用x(_)±s表示，组间配对t 检验，计数资料采用卡方检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

缺血再灌注损伤是肝移植后不可避免的病理过程，也造成移植肝原发性无功能的主要原因，虽然缺血再灌注的机制目前还未完全阐明，但大多数学者认为缺血再灌注损伤是多种因素相互作用的病理改变，其中氧自由基是近些年研究的热点。生理条件下，机体内不断产生氧自由基，同时也不断清除氧自由基，体内氧自由基水平处于动态平衡状态。离体肝即使在低温条件下，葡萄糖、氨基酸与维生素等营养物质同样被消耗，处于缺血缺氧状态肝细胞的基础能量代谢明显增加，当移植到供体再灌注时，这种代谢更显著，抗氧化剂如超氧化物歧化酶被消耗而降低，有害物质如黄缥吟氧化酶因缺血缺氧的刺激显著增强，氧自由基平衡被打破^[14-15]。缺血再灌注早期的氧自由基则可激活核转录因子，核转录因子体内作用在于信号转导和生物调控，处于炎症反应上游，激活的核转录因子可促进多种炎症递质产生如白细胞介素、肿瘤坏死因子和黏附分子，这些递质使白细胞向内皮细胞移动并黏附，导致大量的白细胞浸润在肝组织中引起损伤，在肝脏的白细胞又可产生自由基和细胞因子加重炎症反应，进而加重肝损害^[16]。研究显示脂多糖可刺激肝细胞合成分泌核转录因子，修复促炎/抗炎系统的平衡被打破，噻唑烷二酮类类药物可通过 PPAR-γ抑制小鼠巨噬细胞中由脂多糖诱导的核转录因子活化，抑制炎症因子肿瘤坏死因子产生^[17]，另外也有观点认为肝缺血再灌注时引起肝组织肝窦内枯否氏(Kupffe)细胞激活，枯否氏细胞激活后会释放肿瘤坏死因子、白细胞介素1β^[18-19]。本课题中与单纯冷冻保存组比，低温机械灌注保存组核转录因子表达较弱，可见低温机械灌注保存方式从炎症反应上游即可降低离体肝的炎症程度，减轻肝脏的炎症细胞浸润，与低温机械灌注保存的供肝炎症因子可随着灌注液流动带走，同时灌注液也提供了肝代谢需要的能量有关，有研究显示给予心跳停止的供肝大鼠灌注液具有显著提高保持器官功能的作用^[20]，本课题使用的UW保存液已证实可有效保存肝、肾和胰腺等多种器官，其中肾脏可保存时间长达72 h^[21]。另一方面，给予可明显抑制肿瘤坏死因子、白细胞介素1β等细胞因子抑制剂，如丙泊酚等，可明显抑制肝缺血再灌注损伤^[22]，研究显示白细胞介素1β和肿瘤坏死因子在肝移植诱导的急性肺损伤过程起了关键作用^[23]。与肿瘤坏死因子比，白细胞介素1β在缺血再灌注损伤中始终保持较高水平，对中性粒细胞聚集贡献较大。但导致损伤的启动因子是肿瘤坏死因子，白细胞介素1β为辅，因为肝脏富含肿瘤坏死因子受体，肝脏是肿瘤坏死因子的主要靶向器官。肿瘤坏死因子不仅可直接损伤肝，还可以通过以下几种方式参与肝缺血再灌注损伤^[24-27]：①激活T与B淋巴细胞发挥细胞毒作用，诱导上调细胞间细胞黏附分子与血管细胞黏附分子，促进血管内皮黏附白细胞，诱导上调内皮细胞上调两种黏附分子。②促进血管内皮细胞分泌血小板激活因子、集落刺激因子等炎性激活白细胞。③促进中性粒细胞表达C-反应蛋白，增强中性粒细胞黏附内皮细胞，刺激中性粒细胞是释放过氧化氢等。④激活巨噬细胞释放白介素1、6和8等。⑤激活黏附在肝窦中性白细胞释放氧自由基，激发枯否细胞产生过氧化物。CC趋化因子配体20又称为巨噬细胞炎性蛋白3α，在被激活的单核细胞、T细胞和内皮细胞中表达，其受体主要在肝和肺中表达，肿瘤坏死因子、白细胞介素1β等细胞因子可诱导CC趋化因子配体20的表达，CC趋化因子配体20可趋化大量细胞到达免疫局部发挥免疫增强作用^[28-29]，可见肝移植术后动态检测上述炎症因子可反映机体的应激状态与手术损伤的程度，进一步可评估术后并发症发生与预后。肝脏是移植免疫较为特殊的器官，与其他器官移植比，肝移植排斥的发生率最低，原因在于肝脏的免疫耐受，而该耐受性与肝脏的解剖结构和细胞凋亡密切相关。FASR是跨膜糖蛋白，可与特异性抗体或配体结合触发FAS信号途径，导致多种细胞凋亡，在维持机体内环境具有重要意义，FAS与FASL相互作用引起淋巴细胞凋亡，降低免疫排斥反应发生^[30]。除了FAS家族，细胞凋亡还受p53凋亡相关基因调控。本课题中两个组别的FASR存在表达差异，但p53无显著差异，提示单纯冷藏组的肝细胞未出现广泛凋亡趋势，这种程度的细胞凋亡促进了肝移植的耐受，但大量的细胞凋亡可导致细胞坏死，最终导致移植排斥^[31]。综上所述，与低温机械灌注相比，单纯冷藏保存供肝具有简单经济的优点，而且不需要专业的灌注计数，而且临床证明大多数的移植肝的保存时间基本满足临床移植肝。但与单纯冷冻保存比，对保存的供肝进行低温机械灌注对移植术后肝脏有具有很好的保护作用，低温机械灌注明显减轻肝脏缺血再灌注损伤，通过降低炎症因子和部分凋亡因子水平，进而降低肝炎症和凋亡程度有关。低温机械灌注保存的供肝炎症因子和凋亡因子可随着持续出入的灌注液流动带走，同时流动的关灌注液也提供了肝代谢需要的能量，进一步减轻了缺血再灌注对肝造成损伤，有利于肝移植手术。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程