白细胞介素10基因对未发病非肥胖型糖尿病小鼠肝脏胰-十二指肠同源盒1表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现肝脏细胞在给予转入胰-十二指肠同源盒1基因后可合成胰岛素，抗CD20单克隆抗体可抑制产胰岛素的肝脏细胞发生自身免疫反应，但机制尚不明确。
目的：了解腺病毒介导的小鼠白细胞介素10(Adenovirus vector-mediated murine interleukin，Ad-mIL-10)及抗CD20单克隆抗体联合干预未发病非肥胖糖尿病模型小鼠，对其肝脏细胞以及肝脏胰-十二指肠同源盒1表达的影响。
方法：3-5周龄雌性未发病非肥胖糖尿病模型小鼠40只，随机分为抗CD20单克隆抗体组、抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组、白细胞介素10组和对照组，分别于第1，8，15，21天尾静脉注射抗CD20单克隆抗体、抗CD20单克隆抗体+ Ad-mIL-10、Ad-mIL-10和生理盐水。
结果与结论：12周后，与对照组相比，经抗CD20单克隆抗体和/或白细胞介素10治疗的未发病非肥胖糖尿病模型小鼠血糖水平明显降低，而血清和肝脏中胰岛素、白细胞介素10和CD20表达明显增加，同时肝脏中胰-十二指肠同源盒1表达水平增加；且经抗CD20单克隆抗体和白细胞介素10联合对上述指标的影响高于单独应用；但无论是联合干预还是单独干预均对小鼠肝脏炎症病变无明显影响。证实CD20单抗及白细胞介素10基因联合干预为促使非肥胖糖尿病模型小鼠肝脏胰-十二指肠同源盒1表达机制之一。

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关键词: 实验动物, 组织工程, 单克隆抗体, 白细胞介素10, 胰-十二指肠同源盒1, 非肥胖型糖尿病, 小鼠1型糖尿病, 胰岛素, 肝脏国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that liver cells can synthesize insulin after giving pancreatic and duodenal homeobox 1 (PDX1) gene. Anti-CD20 monoclonal antibody can inhibit the immune reaction of insulin-producing liver cells, but the mechanism is unclear.
OBJECTIVE: To observe the influence of interleukin-10 gene on liver cells and liver PDX1 expression in nonobese diabetic mice after interfered by adenovirus vector-mediated murine interleukin-10 and anti-CD20 monoclonal antibody.
METHOD: Forty nonobese diabetic female mice aged 3-5 weeks were randomly divided into anti-CD20, anti-CD20 + interleukin-10, interleukin, and control groups. Mice in each group were respectively injected with anti-CD20 monoclonal antibody, anti-CD20 monoclonal antibody + adenovirus vector-mediated murine interleukin-10, adenovirus vector-mediated murine interleukin-10 and normal saline on days 1, 8, 15 and 21 via tail vein.
RESULTS AND CONCLUSION: At 12 weeks, the blood glucose level of mice treated with anti-CD20 monoclonal antibody and/or interleukin-10 was significantly reduced compared with the control group, while the insulin, interleukin-10 and CD20 expression levels in the serum and liver were significantly increased, the liver PDX1 expression was also upregulated. Anti-CD20 monoclonal antibody with interleukin-10 had more obvious effects than the single use. No matter the combined intervention or single use, anti-CD20 monoclonal antibody and interleukin-10 show no impact on the inflammation of liver cells. Anti-CD20 monoclonal antibody and/or interleukin-10 increases PDX1 expression in nonobese diabetic mice.

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Key words: Diabetes Mellitus, Type 1, Antigens, CD20, Interleukin-10, Liver

中图分类号:

R318

于淑凤，任安霞，张丽娟，李堂. 白细胞介素10基因对未发病非肥胖型糖尿病小鼠肝脏胰-十二指肠同源盒1表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(27): 4371-4378.

Yu Shu-feng, Ren An-xia, Zhang Li-juan, Li Tang. Effect of interleukin-10 gene on liver pancreatic and duodenal homeobox 1 expression in nonobese diabetic mice [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(27): 4371-4378.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析实验观察期间白细胞介素10组有1只小鼠于实验第11周意外死亡退出实验。其与小鼠均进入结果分析。实验流程图见图1。

2.2 腺病毒的扩增及滴度测定 Ad-mIL-10转染HEK293细胞24-48 h后，显微镜下观察细胞出现肿胀、圆缩、漂浮现象，荧光显微镜下观察细胞内出现绿色荧光，当70%以上HEK293细胞出现绿色荧光时收获病毒液(图2)。

2.3 抗CD20单克隆抗体和白细胞介素10干预治疗对非肥胖糖尿病模型小鼠血糖水平的影响如图3及表1所示，对照组小鼠干预前后血糖水平变化不明显(P > 0.05)，而抗CD20单克隆抗体和/或白细胞介素10治疗12周后，小鼠血糖水平较干预前和对照组明显降低(P < 0.01)，且抗CD20单克隆抗体组、白细胞介素10组和抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组小鼠血糖水平接近(P > 0.05)，但各组小鼠均未发病，且血糖水平维持在正常水平。

2.4 抗CD20单克隆抗体和白细胞介素10干预治疗对非肥胖型糖尿病小鼠血清胰岛素、白细胞介素10和CD20表达水平的影响如表2所示，与对照组相比，抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组小鼠血清胰岛素、白细胞介素10和CD20表达水平明显增加(P < 0.01)，白细胞介素10组小鼠血清白细胞介素10和CD20表达水平明显增加(P < 0.01)；而与白细胞介素10组相比，抗CD20单克隆抗体组小鼠血清胰岛素和白细胞介素10表达水平下降(P < 0.01)，胰岛素、CD20表达水平增加(P < 0.05或P < 0.01)，抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组小鼠白细胞介素10表达水平增加(P < 0.05)。

2.5 抗CD20单克隆抗体和白细胞介素10干预治疗对非肥胖糖尿病模型小鼠肝脏病变程度的影响苏木精-伊红染色显示各组小鼠肝脏细胞正常，排列整齐，周围基本无炎症细胞浸润，肝脏结构形态规整，病变程度基本为0级(图4，表3)。

2.6 抗CD20单克隆抗体和白细胞介素10干预治疗对非肥胖型糖尿病小鼠肝脏胰岛素、白细胞介素10、CD20和PDX1表达水平的影响

2.6.1 胰岛素如图5所示，抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组和抗CD20单克隆抗体组小鼠肝脏胰岛素染色较深，着色颗粒在肝脏内分布较广，而其他2组小鼠肝脏胰岛素染色较浅，着色颗粒在肝脏内分布稀疏。如表4所示，与对照组相比，抗CD20单克隆抗体组、白细胞介素10组和抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组小鼠肝脏胰岛素表达水平明显增加(P < 0.01)，且抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组小鼠肝脏胰岛素表达高于其他2组(P < 0.01)。

2.6.2 CD20 在高倍镜下，抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组小鼠肝脏可见明显CD20染色阳性细胞，抗CD20单克隆抗体组、白细胞介素10组、对照组也有上述阳性细胞出现，但明显少于抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组(P < 0.01；图6，表4)。
2.6.3 白细胞介素10 对照组小鼠肝脏中白细胞介素10着色较浅，颗粒分布稀疏，与对照组相比，其他3组小鼠肝脏中白细胞介素10的表达水平明显增加(P < 0.01)，且抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组小鼠肝脏中白细胞介素10的表达水平高于抗CD20单克隆抗体组和白细胞介素10组(P < 0.01；图7)。
2.6.4 PDX1 与对照组相比，其他3组小鼠肝脏中PDX1的表达水平明显增加(P < 0.01)，且抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组小鼠肝脏中PDX1的表达水平高于白细胞介素10组和抗CD20单克隆抗体组(P < 0.01；图8)。

参考文献

[1] Song KH, Ko SH, Ahn YB, et al. In vitro transdifferentiation of adult pancreatic acinar cells into insulin-expressing cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004;316(4):1094-1100.

[2] Melloul D. Transcription factors in islet development and physiology: role of PDX-1 in beta-cell function. Ann N Y Acad Sci. 2004;1014:28-37.

[3] Sander M, Neubüser A, Kalamaras J, et al. Genetic analysis reveals that PAX6 is required for normal transcription of pancreatic hormone genes and islet development. Genes Dev. 1997;11(13):1662-1673.

[4] Prado CL, Pugh-Bernard AE, Elghazi L, et al. Ghrelin cells replace insulin-producing beta cells in two mouse models of pancreas development. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101(9): 2924-2929.

[5] Heller RS, Jenny M, Collombat P, et al. Genetic determinants of pancreatic epsilon-cell development. Dev Biol. 2005;286(1): 217-224.

[6] Pedersen JK, Nelson SB, Jorgensen MC, et al. Endodermal expression of Nkx6 genes depends differentially on Pdx1. Dev Biol. 2005;288(2):487-501.

[7] Jacquemin P, Yoshitomi H, Kashima Y, et al. An endothelial- mesenchymal relay pathway regulates early phases of pancreas development. Dev Biol. 2006;290(1):189-199.

[8] Ferber S, Halkin A, Cohen H, et al. Pancreatic and duodenal homeobox gene 1 induces expression of insulin genes in liver and ameliorates streptozotocin-induced hyperglycemia. Nat Med. 2000;6(5):568-572.

[9] Ferber S, Halkin A, Cohen H, et al. Pancreatic and duodenal homeobox gene 1 induces expression of insulin genes in liver and ameliorates streptozotocin-induced hyperglycemia. Nat Med. 2000;6(5):568-572.

[10] Kojima H, Nakamura T, Fujita Y, et al. Combined expression of pancreatic duodenal homeobox 1 and islet factor 1 induces immature enterocytes to produce insulin. Diabetes. 2002; 51(5): 1398-1408.

[11] Yoshida S, Kajimoto Y, Yasuda T, et al. PDX-1 induces differentiation of intestinal epithelioid IEC-6 into insulin-producing cells. Diabetes. 2002;51(8):2505-2513.

[12] Noguchi H, Kaneto H, Weir GC, et al. PDX-1 protein containing its own antennapedia-like protein transduction domain can transduce pancreatic duct and islet cells. Diabetes. 2003;52(7):1732-1737.

[13] Taniguchi H, Yamato E, Tashiro F, et al. beta-cell neogenesis induced by adenovirus-mediated gene delivery of transcription factor pdx-1 into mouse pancreas. Gene Ther. 2003;10(1):15-23.

[14] Ber I, Shternhall K, Perl S, et al. Functional, persistent, and extended liver to pancreas transdifferentiation. J Biol Chem. 2003;278(34):31950-31957.

[15] Tang DQ, Cao LZ, Burkhardt BR, et al. In vivo and in vitro characterization of insulin-producing cells obtained from murine bone marrow. Diabetes. 2004;53(7):1721-1732.

[16] Miyatsuka T, Kaneto H, Kajimoto Y, et al. Ectopically expressed PDX-1 in liver initiates endocrine and exocrine pancreas differentiation but causes dysmorphogenesis. Biochem Biophys Res Commun. 2003;310(3):1017-1025.

[17] Kaneto H, Nakatani Y, Miyatsuka T, et al. PDX-1/VP16 fusion protein, together with NeuroD or Ngn3, markedly induces insulin gene transcription and ameliorates glucose tolerance. Diabetes. 2005;54(4):1009-1022.

[18] Cao LZ, Tang DQ, Horb ME, et al. High glucose is necessary for complete maturation of Pdx1-VP16-expressing hepatic cells into functional insulin-producing cells. Diabetes. 2004; 53(12):3168-3178.

[19] Tang DQ, Shun L, Koya V, et al. Genetically reprogrammed, liver-derived insulin-producing cells are glucose-responsive, but susceptible to autoimmune destruction in settings of murine model of type 1 diabetes. Am J Transl Res. 2013; 5(2):184-199.

[20] O'Neill SK, Shlomchik MJ, Glant TT, et al. Antigen-specific B cells are required as APCs and autoantibody-producing cells for induction of severe autoimmune arthritis. J Immunol. 2005; 174(6):3781-3788.

[21] Goetz M, Atreya R, Ghalibafian M, et al. Exacerbation of ulcerative colitis after rituximab salvage therapy. Inflamm Bowel Dis. 2007;13(11):1365-1368.

[22] Zhang YC, Pileggi A, Agarwal A, et al. Adeno-associated virus-mediated IL-10 gene therapy inhibits diabetes recurrence in syngeneic islet cell transplantation of NOD mice. Diabetes. 2003;52(3):708-716.

[23] Kikutani H, Makino S. The murine autoimmune diabetes model: NOD and related strains. Adv Immunol. 1992;51: 285-322.

[24] Bach JF. Insulin-dependent diabetes mellitus as an autoimmune disease. Endocr Rev. 1994;15(4):516-542.

[25] Phillips JM, Parish NM, Raine T, et al. Type 1 diabetes development requires both CD4+ and CD8+ T cells and can be reversed by non-depleting antibodies targeting both T cell populations. Rev Diabet Stud. 2009;6(2):97-103.

[26] Silveira PA, Johnson E, Chapman HD, et al. The preferential ability of B lymphocytes to act as diabetogenic APC in NOD mice depends on expression of self-antigen-specific immunoglobulin receptors. Eur J Immunol. 2002;32(12):3657-3666.

[27] Hulbert C, Riseili B, Rojas M, et al. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 2001;167(10):5535-5538.

[28] Hussain S, Delovitch TL. Intravenous transfusion of BCR-activated B cells protects NOD mice from type 1 diabetes in an IL-10-dependent manner. J Immunol. 2007; 179(11):7225-7232.

[29] Tedder TF, Boyd AW, Freedman AS, et al. The B cell surface molecule B1 is functionally linked with B cell activation and differentiation. J Immunol. 1985;135(2):973-979.

[30] 何凌,王燕,余绮玲,等.雷公藤单体T4对胰岛细胞免疫保护作用的机制探讨[J].热带医学杂志,2010,10(7):773-776. [31] Mathieu C, Waer M, Laureys J, et al. Prevention of autoimmune diabetes in NOD mice by 1,25 dihydroxyvitamin D3. Diabetologia. 1994;37(6):552-558.

[32] Xiu Y, Wong CP, Bouaziz JD, et al. B lymphocyte depletion by CD20 monoclonal antibody prevents diabetes in nonobese diabetic mice despite isotype-specific differences in Fc gamma R effector functions. J Immunol. 2008;180(5):2863-2875.

[33] Pescovitz MD, Greenbaum CJ, Krause-Steinrauf H, et al. Rituximab, B-lymphocyte depletion, and preservation of beta-cell function. N Engl J Med. 2009;361(22):2143-2152.

[34] Minard-Colin V, Xiu Y, Poe JC, et al. Lymphoma depletion during CD20 immunotherapy in mice is mediated by macrophage FcgammaRI, FcgammaRIII, and FcgammaRIV. Blood. 2008;112(4):1205-1213.

[35] Kojima H, Fujimiya M, Matsumura K, et al. NeuroD- betacellulin gene therapy induces islet neogenesis in the liver and reverses diabetes in mice. Nat Med. 2003;9(5):596-603.

[36] Yechoor V, Liu V, Espiritu C, et al. Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes. Dev Cell. 2009;16(3):358-373.

[37] Kaneto H, Nakatani Y, Miyatsuka T, et al. PDX-1/VP16 fusion protein, together with NeuroD or Ngn3, markedly induces insulin gene transcription and ameliorates glucose tolerance. Diabetes. 2005;54(4):1009-1022.

[38] Wang AY, Ehrhardt A, Xu H, et al. Adenovirus transduction is required for the correction of diabetes using Pdx-1 or Neurogenin-3 in the liver. Mol Ther. 2007;15(2):255-263.

[39] Jacquemin P, Lemaigre FP, Rousseau GG. The Onecut transcription factor HNF-6 (OC-1) is required for timely specification of the pancreas and acts upstream of Pdx-1 in the specification cascade. Dev Biol. 2003;258(1):105-116.

[40] Fujitani Y, Fujitani S, Boyer DF, et al. Targeted deletion of a cis-regulatory region reveals differential gene dosage requirements for Pdx1 in foregut organ differentiation and pancreas formation. Genes Dev. 2006;20(2):253-266.

[41] Jensen JN, Cameron E, Garay MV, et al. Recapitulation of elements of embryonic development in adult mouse pancreatic regeneration. Gastroenterology. 2005;128(3):728-741.

[42] Miyatsuka T, Kaneto H, Shiraiwa T, et al. Persistent expression of PDX-1 in the pancreas causes acinar-to-ductal metaplasia through Stat3 activation. Genes Dev. 2006;20(11):1435-1440.

[43] Kaneto H, Matsuoka TA, Nakatani Y, et al. A crucial role of MafA as a novel therapeutic target for diabetes. J Biol Chem. 2005;280(15):15047-15052.

[44] Imai J, Katagiri H, Yamada T, et al. Constitutively active PDX1 induced efficient insulin production in adult murine liver. Biochem Biophys Res Commun. 2005;326(2):402-409.

[45] Kulkarni RN, Jhala US, Winnay JN, et al. PDX-1 haploinsufficiency limits the compensatory islet hyperplasia that occurs in response to insulin resistance. J Clin Invest. 2004;114(6):828-836.

[46] Holland AM, Góñez LJ, Naselli G, et al. Conditional expression demonstrates the role of the homeodomain transcription factor Pdx1 in maintenance and regeneration of beta-cells in the adult pancreas. Diabetes. 2005;54(9):2586- 2595.

[47] Noguchi H, Bonner-Weir S, Wei FY, et al. BETA2/NeuroD protein can be transduced into cells due to an arginine- and lysine-rich sequence. Diabetes. 2005;54(10):2859-2866.

[48] Li SW, Koya V, Li Y, et al. Pancreatic duodenal homeobox 1 protein is a novel beta-cell-specific autoantigen for type I diabetes. Lab Invest. 2010;90(1):31-39.

[49] Mingozzi F, Liu YL, Dobrzynski E, et al. Induction of immune tolerance to coagulation factor IX antigen by in vivo hepatic gene transfer. J Clin Invest. 2003;111(9):1347-1356.

[50] Dobrzynski E, Mingozzi F, Liu YL, et al. Induction of antigen-specific CD4+ T-cell anergy and deletion by in vivo viral gene transfer. Blood. 2004;104(4):969-977.

[51] Martino AT, Nayak S, Hoffman BE, et al. Tolerance induction to cytoplasmic beta-galactosidase by hepatic AAV gene transfer: implications for antigen presentation and immunotoxicity. PLoS One. 2009;4(8):e6376.

[52] Shternhall-Ron K, Quintana FJ, Perl S, et al. Ectopic PDX-1 expression in liver ameliorates type 1 diabetes. J Autoimmun. 2007;28(2-3):134-142.

[53] Uchida J, Hamaguchi Y, Oliver JA, et al. The innate mononuclear phagocyte network depletes B lymphocytes through Fc receptor-dependent mechanisms during anti-CD20 antibody immunotherapy. J Exp Med. 2004;199(12):1659-1669.

[54] Zhang C, Moriguchi T, Kajihara M, et al. MafA is a key regulator of glucose-stimulated insulin secretion. Mol Cell Biol. 2005;25(12):4969-4976.

[55] Noguchi H, Matsushita M, Matsumoto S, et al. Mechanism of PDX-1 protein transduction. Biochem Biophys Res Commun. 2005;332(1):68-74.

[56] Heremans Y, Van De Casteele M, in't Veld P, et al. Recapitulation of embryonic neuroendocrine differentiation in adult human pancreatic duct cells expressing neurogenin 3. J Cell Biol. 2002;159(2):303-312.

[57] Domínguez-Bendala J, Klein D, Ribeiro M, et al. TAT-mediated neurogenin 3 protein transduction stimulates pancreatic endocrine differentiation in vitro. Diabetes. 2005; 54(3):720-726.

[58] Samaras SE, Cissell MA, Gerrish K, et al. Conserved sequences in a tissue-specific regulatory region of the pdx-1 gene mediate transcription in Pancreatic beta cells: role for hepatocyte nuclear factor 3 beta and Pax6. Mol Cell Biol. 2002;22(13):4702-4713.

[59] Samaras SE1, Zhao L, Means A, et al. The islet beta cell-enriched RIPE3b1/Maf transcription factor regulates pdx-1 expression. J Biol Chem. 2003;278(14):12263-12270.

引言

1型糖尿病主要是以胰岛β细胞进行性损伤和胰岛素分泌绝对不足为基础的自身免疫性疾病，目前对1型糖尿病的治疗依旧停留在胰岛素替代疗法阶段，但胰岛素替代治疗的缺点使1型糖尿病的免疫治疗及细胞替代治疗越来越受到重视。在胚胎发育期，胰腺和肝脏均来源于相邻区域的内胚层，研究发现肝脏细胞可以被诱导分化为成熟并具有功能的胰岛素分泌细胞，因此肝脏被认为是产胰岛素细胞的潜在来源^[1-4]。胰-十二指肠同源盒1(pancreatic and duodenal homeobox 1，PDX1)转录因子是一种促进胰腺β细胞生长的基因，是决定胰岛β细胞功能的关键因子，在胰腺发育、胰岛β细胞分化以及胰岛素的分泌利用方面发挥重要的作用^[5-8]。目前，大量研究已证明通过载体媒介导入肝脏中并表达的PDX1可促使肝源性胰岛素生成细胞的生成，并且新生成的胰岛素生成细胞能根据血糖浓度调节胰岛素分泌并维持血糖稳定^[9-13]。也有实验证明，将肝脏间充质干细胞以一定数量注入已发病非肥胖型糖尿病鼠静脉中，其合成的肝细胞因子可通过诱导间充质干细胞分化为表达PDX1的胰岛β细胞来修复已经受损的胰岛^[14-18]。然而肝源性胰岛素生成细胞与胰岛β细胞拥有相似的表面抗体，这使得细胞替代疗法需要相应的免疫抑制支持来对抗淋巴细胞对肝源性胰岛素生成细胞的破坏清除^[19]。近期有研究证明B细胞因能作为抗原提呈细胞而在糖尿病发生过程中起到重要作用[20]。CD20作为一种B淋巴细胞的特异性膜抗原，在B淋巴细胞活化中起重要作用。抗CD20单克隆抗体能通过与细胞表面CD20分子高亲和力结合，从而使被结合的B淋巴细胞清除，导致体内B淋巴细胞数量大幅减少^[21]。白细胞介素10作为一种多效性的细胞因子，除可以抑制T细胞、NK细胞等产生干扰素γ、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等细胞因子，调节自身反应性T细胞功能，还可以在肝细胞受损时诱导肝细胞合成肝细胞因子，促进肝脏修复^[22]。因此实验将CD20单克隆抗体及白细胞介素10基因联合应用于非肥胖糖尿病模型小鼠，观察二者联合干预能否促进肝脏细胞表达PDX1，同时探讨二者作用于非肥胖糖尿病模型小鼠促进肝脏细胞表达PDX1的机制。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2013年9月至2014年4月在青岛大学医学院附属医院儿科研究所、动物实验中心及中心实验室完成。
材料：
动物：3-5周龄SPF级健康雌性非肥胖型糖尿病小鼠40只，购自中国医学科学院实验动物中心(上海斯莱克动物实验动物有限公司)，动物许可证号SCXK(沪)2012-0002。所应用的非肥胖型糖尿病小鼠，30周龄雌鼠1 型糖尿病自然发病率为80%^[23-24]。
细胞及病毒：人胚肾293(HEK293)细胞购自美国ATCC细胞库。
携带小鼠白细胞介素10基因的重组腺病毒载体(Adenovirus vector-mediated murine interleukin，Ad-mIL-10)，由青岛大学附属医院儿科陈志红教授惠赠，病毒滴度为1.0×10¹² pfu/L，已通过细胞学鉴定。

CD20单克隆抗体及白细胞介素10基因联合干预非肥胖型糖尿病小鼠使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
胎牛血清、DMEM高糖液、青链霉素双抗(100×10³ U/L)	美国GIBCO公司
0.25%胰蛋白酶	美国Sigma公司
抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗注射液)	F. Hoffmann-La Roche Inc(罗氏公司)
北京本元正阳公司	北京本元正阳公司
血糖仪及试纸	美国Johnson & Johnson(中国)投资有限公司
光学显微镜(BX55BXFLA3型)	日本OLYMPUS(中国)投资有限公司

方法：
动物分组：选取3-5周未发病非肥胖型糖尿病小鼠40只，按随机编号法分为抗CD20单克隆抗体组、抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组、白细胞介素10组和对照组，各10只。
重组腺病毒扩增及滴度测定：当70%-80%HEK293细胞贴壁时，感染腺病毒，弃去原液，加培养液2 mL，滴入携有白细胞介素10基因的重组腺病毒液200 μL，二氧化碳培养箱中培养24-48 h，当经倒置荧光显微镜观察到>80%细胞出现绿色荧光时收获病毒液，离心、弃上清，加PBS，96孔培养板中接种HEK293细胞，根据腺病毒感染性滴度试剂盒说明操作，测定重组腺病毒滴度。
抗CD20单克隆抗体和白细胞介素10基因治疗：各组小鼠分别于0，8，15，21 d尾静脉给药。抗CD20单克隆抗体组小鼠给予利妥昔单抗250 μg。给予白细胞介素10组小鼠尾静脉注射0.1 mL的 Ad-mIL-10；抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组小鼠同时给予利妥昔单抗和Ad-mIL-10；给予对照组小鼠生理盐水0.1 mL。
血糖监测：每周固定时间监测小鼠2次随机血糖，随机血糖连续2次>13.9 mmol/L时，即诊断为糖尿病[25]。
取材：治疗12周后，无菌眼科剪摘取双侧眼球取小鼠全血0.8-1.2 mL。分离血清，100 μL分装，用于ELISA检测。取血完成后断颈处死，无菌剪剪开胸腔和腹腔，分离肝脏，取一半置于体积分数4%中性甲醛固定24-48 h，常规制作石蜡切片，厚4 μm备用。剩余肝脏置于冻存管中 -80 ℃保存，备做免疫组化。
ELISA检测：无菌采血收集小鼠全血，离心10 min，取上清液。采用双抗体夹心ELISA法测定，用抗小鼠单抗包被于酶标板上，加入生物素化的抗小鼠因子，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液，在450 nm处测吸光度值，通过标准曲线计算样本蛋白含量。
苏木精-伊红染色检测：将肝组织进行固定、脱蜡、水化、洗涤、苏木精染色、分化、反蓝、伊红染色、梯度脱水、封固。由病理专业人员采用双盲法对每只小鼠肝脏炎性浸润程度进行判断。
免疫组化检测：将肝脏石蜡切片依次进行抗原修复、灭活酶、封闭、抗原-抗体反应、加增强剂、一抗二抗反应、显色、终止显色、复染、脱水封固。光学显微镜下观察组织细胞中蛋白的表达情况，取3个高表达区域拍照保存。光学显微镜400倍镜视野下观察肝脏。阳性细胞：胞浆内有棕黄色颗粒沉积。进行灰度分析。
主要观察指标：小鼠血清CD20、白细胞介素10及胰岛素表达情况及肝脏病理变化与肝脏中白细胞介素10、CD20、胰岛素、PDX1蛋白表达情况。
统计学分析：数据用SPSS 17.0软件进行统计学分析。所有数据进行正态性检验，以x(_)±s表示，多组间比较采用方差分析，多个样本均数间的两两比较采用q 检验。样本率进行卡方检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

1型糖尿病是一种胰岛β细胞损伤引起胰岛素绝对缺乏出现血糖升高的疾病^[26-27]。研究表明，1 型糖尿病在自身免疫反应、遗传易感基因和环境诱发因素共同作用下，T细胞、B细胞和NK细胞等的浸润启动自身免疫反应，诱发一系列细胞因子分泌，导致胰岛β细胞破坏和凋亡是其发病的主要机制^[28-29]。目前1 型糖尿病的主要临床治疗手段为胰岛素替代治疗，虽然胰岛素替代治疗方法正逐渐改进，但是急性、慢性并发症仍难以避免，尤其是疾病后期胰岛β细胞功能完全衰竭时，脆性糖尿病严重危害患者的生活质量。所以，1型糖尿病的免疫治疗及细胞替代治疗越来越受到重视。
目前，已有大量研究正在证明雷公藤氯内酯醇、1,25(OH)₂D₃、抗CD20单克隆抗体等免疫抑制剂可延缓1 型糖尿病的进展，甚至能纠正糖尿病的发生[30-31]。而且，对于抗CD20单克隆抗体在纠正高血糖方面的研究尤为深入。但是抗CD20单克隆抗体对于1型糖尿病的疗效和治疗方案仍不明确。抗CD20单克隆抗体是作用于B淋巴细胞表面CD20分子的单克隆抗体，能与CD20分子高亲和力结合，清除B淋巴细胞。研究发现，抗CD20单克隆抗体通过3种不同机制介导B细胞的清除，包括：①补体依赖的细胞毒作用。②抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。③促使B细胞凋亡。由于淋巴干细胞和浆细胞细胞表面不表达CD20分子，因此抗CD20单克隆抗体不会造成B淋巴细胞永久性缺失。因此，抗CD20单克隆抗体作为特异性B淋巴细胞清除剂，能减轻胰岛β细胞自身免疫性损伤，延缓或逆转初发1 型糖尿病患者胰岛β细胞功能衰竭。最近动物实验结果显示，在非肥胖型糖尿病小鼠发生高血糖之前或同时(9-12周龄非肥胖型糖尿病鼠)，给予抗CD20单克隆抗体清除B细胞后，可逆转了30%动物高血糖的发生^[32-33]。2009年11月公布的一项Ⅱ期临床试验阐明，应用抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗(美罗华))可使B细胞耗竭，1年内患者C-肽水平较对照组明显升高、胰岛素需求量和糖化血红蛋白比对照组显著降低，但治疗后1年末，体内B细胞重新大量出现(69%)^[34]。但是，CD20单克隆抗体在纠正糖尿病方面是否有其他机制呢？
在胚胎发育期，胰腺和肝脏均来源于相邻区域的内胚层，这种同源性使得肝脏细胞具有被诱导分化为成熟并具有功能的胰岛素分泌细胞的潜力，因此肝脏被认为是产胰岛素细胞的潜在来源。PDX1转录因子是一种促进胰腺β细胞生长的基因，是决定胰岛β细胞功能的关键因子，在胰腺发育、胰岛β细胞分化以及胰岛素的分泌利用方面发挥重要的作用^[35-38]。目前，大量研究已证明通过载体媒介导入肝脏中并表达的PDX1可促使肝源性胰岛素生成细胞的生成^[39-43]，并且新生成的胰岛素生成细胞能根据血糖浓度调节胰岛素分泌，维持血糖稳定^[35，44-47]。然而，未给予任何干预的非肥胖型糖尿病小鼠，在1型糖尿病发病过程中并未检测到肝源性胰岛素生成细胞的生成。造成此种现象的原因有实验证明可能为肝源性胰岛素生成细胞表达了易受淋巴细胞清除的基因，使得肝源性胰岛素生成细胞在发挥作用前已被自身免疫破坏^[47-52]。所以，实验应用CD20单克隆抗体及白细胞介素10基因联合免疫抑制剂在抑制胰腺自身免疫炎症反应的同时，观察能否促进肝脏PDX1表达，同时抑制肝源性胰岛素生成细胞的自身免疫反应，使肝脏细胞表达出胰岛素。
白细胞介素10为Th2型细胞因子之一，是一种重要的免疫调节因子，参与自身免疫炎症过程中的抗原提呈、炎性细胞激活和细胞因子分泌等环节，其不仅可以抑制肿瘤坏死因子α、白细胞介素1及氧自由基产物的产生，而且还通过抑制抗原提呈细胞产生的白细胞介素12来抑制Th1细胞产生的干扰素γ的释放，具有较强的免疫抑制作用[53-55]。研究者们也发现当非肥胖型糖尿病小鼠发病时，其胰腺、肝脏、脾脏等多器官白细胞介素10表达明显下降。而且证实全身性给予非肥胖型糖尿病小鼠白细胞介素10治疗可以减轻胰腺炎，从而预防和治疗1型糖尿病。同时白细胞介素10还可以在肝细胞受损时诱导肝细胞合成肝细胞因子，促进肝脏修复。
本实验结果表明，抗CD20单克隆抗体和白细胞介素10干预治疗12周后，抗CD20单克隆抗体组、白细胞介素10组及抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组非肥胖型糖尿病小鼠血糖呈降低趋势，对照组小鼠血糖干预前后变化不明显。在干预的第9周，各组小鼠血糖水平整体上有上升趋势，尤其是对照组血糖水平上升比较明显，考虑此时期可能为非肥胖型糖尿病小鼠的发病高峰期，但抗CD20单克隆抗体+白细胞介素10组小鼠血糖水平呈平稳性降低，无血糖上升期，但单独干预没有明显效果，说明联合干预治疗对于降低血糖水平并维持血糖稳定是有效的。另外实验中小鼠未出现糖尿病情况，可能与观察时间比较短和小鼠开始治疗周龄相对较小有关。
有实验证明可能因为肝源性胰岛素生成细胞表达了易受淋巴细胞清除的基因，使得肝源性胰岛素生成细胞在发挥作用前已被自身免疫破坏。本实验中各组小鼠肝脏基本无炎症性病理改变。这说明未发病的非肥胖型糖尿病鼠肝脏基本无炎症性改变，且CD20单克隆抗体及白细胞介素10基因免疫干预对肝脏病理无明显影响。然而，应用免疫组化方法观察到，经过CD20单克隆抗体及白细胞介素10基因免疫干预非肥胖型糖尿病鼠，可能会促进肝脏PDX1表达增多，促使肝源性胰岛素生成细胞增多，同时抑制自身免疫反应对肝源性胰岛素生成细胞的破坏，使肝源性胰岛素生成细胞顺利合成胰岛素。同时， ELISA 方法证实抗CD20单克隆抗体和白细胞介素10干预治疗可使小鼠肝源性胰岛素生成细胞合成并释放胰岛素，从而更有效的增加小鼠血清中胰岛素水平，使小鼠血糖维持正常，而且联合干预治疗效果更明显。这一结果与Ferber等[2，56-59]通过载体媒介导入肝脏中并表达的PDX1促使肝源性胰岛素生成细胞的生成，新生成的胰岛素生成细胞根据血糖浓度调节胰岛素分泌并维持血糖稳定的实验结论一致。然而血清中检测到的胰岛素中肝源性胰岛素生成细胞释放的胰岛素所占比例，以及CD20单克隆抗体及白细胞介素10基因促进肝脏PDX1表达并生成肝源性胰岛素生成细胞的进一步机制仍有待研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程