在Hela细胞中验证miRNA-21对TLR4的调控

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.02.011

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (2): 220-224.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.02.011

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在Hela细胞中验证miRNA-21对TLR4的调控

赵婧¹，岳鹏²，黄家芳¹，汪玉涛¹，马婷¹，陈宝荣¹

1北京航天总医院检验科，北京市 100076；2防化学院门诊部，北京市 102205

收稿日期:2014-10-23 出版日期:2015-01-08 发布日期:2015-01-08
通讯作者: 陈宝荣，主任技师，北京航天总医院检验科，北京市 100076
作者简介:赵婧，女，1985年生，宁夏回族自治区银川市人，汉族，2012年宁夏医科大学毕业，硕士，医师，主要从事临床检验工作。并列第一作者：岳鹏，男，1983年生，河北省秦皇岛市人，汉族，2006年解放军第四军医大学毕业，医师。

MicroRNA-21 for regulation of TLR4 in Hela cells

Zhao Jing¹, Yue Peng², Huang Jia-fang¹, Wang Yu-tao¹, Ma Ting¹, Chen Bao-rong¹

1Department of Clinical Laboratory, Beijing Aerospace General Hospital, Beijing 100076, China; 2The Clinic of the Institute of Chemical Defence, Beijing 102205, China

Received:2014-10-23 Online:2015-01-08 Published:2015-01-08
Contact: Chen Bao-rong, Chief technician, Department of Clinical Laboratory, Beijing Aerospace General Hospital, Beijing 100076, China
About author:zhao Jing, Master, Physician, Department of Clinical Laboratory, Beijing Aerospace General Hospital, Beijing 100076, China Yue Peng, Physician, the Clinic of the Institute of Chemical Defence, Beijing 102205, China Zhao Jing and Yue Peng contributed equally to this work.

摘要/Abstract

摘要：

背景：miRNA通过调节特异靶基因的表达，在疾病的发展及预后中起着重要作用。
目的：探索miRNA-21在宫颈癌Hela细胞中对TLR4基因的调控关系。
方法：通过miRNA靶基因预测网站寻找可能与miRNA-21相互作用的靶基因，利用已构建的携带pri-miRNA-21基因重组腺病毒载体，包装并大量扩增病毒感染Hela细胞，检测荧光蛋白的表达水平，提取感染48 h蛋白，通过Western印迹检测TLR4蛋白表达。从蛋白水平验证在Hela细胞中miRNA-21与靶基因TLR4的靶向调控关系。
结果与结论：100 MOI的重组腺病毒pAd/pri-miRNA-21、pAd/neg可以成功感染Hela细胞。生物信息学方法显示miRNA-21和TLR4存在可能的结合位点。发现感染pAd/pri-miRNA-21组与对照组pAd/neg及空白组相比，TLR4蛋白的表达量明显降低。证实了miRNA-21可以负调节靶基因TLR4的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 重组腺病毒载体, pri-miRNA-21, TLR4基因, Hela细胞, 靶基因

Abstract:

BACKGROUND: MicroRNAs (miRNA) through regulating specific target gene mRNA expression play important roles in different processes of diseases.
OBJECTIVE: To study the interaction of miRNA-21 with its target gene TLR4 in Hela cells.
METHODS: The candidate target gene of miRNA-21 was determined according to miRNA analysis databases. The constructed recombinant adenovirus vector carrying pri-miRNA-21 gene was used, which could package and amplify viruses to transfect Hela cells. Then, the expression of fluorescent proteins was detected. Forty-eight hours after transfection of miRNA-21 or control, extracted proteins were used for detection of TLR4 protein using western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Recombinant adenoviruses pAd/pri-miRNA-21 and pAd/neg at 100 MOI could successfully infect Hela cells. Bioinformatic analysis suggested several possible binding sites between miRNA-21 and TLR4. The experimental results showed that miRNA-21 down-regulated TLR4 at protein levels, indicating that miRNA-21 can interfere with the expression of TLR4 target gene.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Genes, Toll-Like Receptor 4, Hela Cells, MicroRNAs

中图分类号:

R318

赵婧，岳鹏，黄家芳，汪玉涛，马婷，陈宝荣 . 在Hela细胞中验证miRNA-21对TLR4的调控[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(2): 220-224.

Zhao Jing, Yue Peng, Huang Jia-fang, Wang Yu-tao, Ma Ting, Chen Bao-rong. MicroRNA-21 for regulation of TLR4 in Hela cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(2): 220-224.

图/表（结果） 1

2.1 miRNA-21靶基因的预测结果通过网站预测的方法得到了miRNA-21可能的靶基因TLR4，然后通过blast数据库比对发现miRNA-21的5’端区域与TLR4的3’UTR区存在互补的碱基(图1)。

2.2 Triton X-114液相分离法去除质粒内毒素结果因重组的腺病毒载体质粒较大约42 kb，所以采用手工法提取质粒，Triton X-114液相分离法去除质粒内毒素。经后期实验证实该方法提取的质粒浓度明显高于试剂盒，并能有效降低质粒在提取过程中断裂的可能。且经Triton X-114液相分离法去除质粒内毒素对后期质粒的转染及病毒的扩增未见明显影响(图2)。

2.3 线性化重组腺病毒pAd/pri-miRNA-21、pAd/neg质粒结果经Pac Ⅰ酶切37 ℃ 3 h后取5 µL进行琼脂糖凝胶电泳，可见到重组质粒分别被切成35 kb和4.5 kb两条片断(图3)。

2.4 重组腺病毒的包装成功检测荧光表达将线性化带有绿色荧光蛋白的重组腺病毒pAd/pri-miRNA-21、pAd/neg质粒分别转染293A细胞后观察荧光表达，随着转染天数的增加，带有绿色荧光的细胞逐渐增多，转染第7天视野下可见成片细胞变绿(图4A，B)。转染第10天细胞大部分出现病变，表现为变圆、贴壁性差，呈葡萄串样脱落(图4C，D)，此时成功收获第一代病毒颗粒，并经过两轮扩增后，TCID50法测定重组腺病毒滴度为1× 1 010 pfu/mL，获得了可以高效转导pri-miRNA-21基因的腺病毒。

2.5 重组腺病毒感染靶细胞Hela结果感染Hela细胞 24 h后开始动态观察绿色荧光蛋白的表达，发现重组腺病毒pAd/pri-miRNA-21、pAd/neg可以成功感染Hela细胞(图5)，随着病毒颗粒的增多，感染效率逐渐增加；且在MOI值为1的培养孔里未见pAd/pri-miRNA-21、pAd/neg重组病毒增殖，证实所得病毒正确，无野生型病毒扩增。

2.6 Western blotting检测结果分别提取感染48 h pAd/pri-miRNA-21和pAd/neg重组腺病毒的Hela细胞总蛋白，检测TLR4基因在蛋白水平上表达的不同，发现感染pAd/pri-miRNA-21组与对照组pAd/neg及空白组相比，TLR4蛋白的表达量明显降低(图6)。

参考文献

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引言

microRNA是一种进化上高度保守的内源性小分子，广泛存在于动植物体内，长度为18-26 nt，属非编码RNA，是一个庞大的小分子调控RNA家族^[1]，它能在转录水平或转录后水平对至少30%以上的蛋白编码基因进行调控^[2]，并参与生命过程中一系列的重要进程。

miRNA-21是最早发现的哺乳动物的microRNAs之一，位于17q23.2染色体FRA17B脆性区域上，越来越多的研究表明，miRNA-21亦是肿瘤中常见的高表达miRNAs之一。在全基因组miRNA表达谱的研究表明，miRNA-21在肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、神经胶质瘤等多种肿瘤中都存在异常高表达^[3-4]，作为一种具有癌基因作用的miRNA在所有恶性实体肿瘤中证实其高表达^[5]。成熟的miRNA是通过与靶mRNA 3’非翻译区(3’UTR)的结合来实现对靶基因的调节^[6]，作为一类新型的调节因子，miRNA影响多种病理、生理过程，既可以作为原癌基因发挥作用，也可以作为抑癌基因调节细胞的生物学特性^[7]。miRNA-21作为一个典型的原癌基因，在大多肿瘤中过表达，与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移关系密切。

现已证实可被miRNA-21靶向调控的基因包括：PTEN^[8]、PDCD4^[9]、maspin^[10]、ITGB4^[11]、TIMP3和CCL20等^[12-13]，miRNA-21除了对靶基因的表达进行调控外，其本身也受到多种蛋白或转录因子的影响。miRNA-21主要通过调节hMSH2蛋白的表达来控制肺癌细胞的周期变化与生长^[14]。过表达的miRNA-21能够降低PTEN、hSulf-1的表达，提高AKT、ERK的磷酸化水平，与此同时诱导了肝癌细胞的上皮间质转化现象^[15]。而目前主要应用生物信息学方法预测靶基因，其主要策略是通过比对miRNA和靶基因的3’UTR的匹配程度，尤其是miRNA 5’端6-8个bp的种子序列^[16]。

近年来的研究在不同的肿瘤细胞中确定了很多miRNA及其靶基因^[17-18]，miRNA-21作为重要的miRNA，在多种肿瘤细胞中的表达均出现显著异常，提示miRNA-21可能作为肿瘤治疗很有前景的靶点，而用于肿瘤的诊断、治疗和预后的评估，具有重要的临床意义。TLR4是TLRs家族最主要的成员之一与多种疾病相关，也是目前研究最为全面的病原微生物的模式识别受体。在宫颈癌细胞HeLa中，已经有文献报道抑制miRNA-21能够提高细胞的生存能力，由于HeLa细胞本身具有易培养生长迅速等特点，故实验选择在Hela细胞中对miRNA-21与TLR4基因的靶向调控关系进行验证，以期为临床上预测肿瘤的发生和发展以及为更有效的治疗肿瘤提供新的基因治疗策略及思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2010年3月至2012年1月在宁夏医科大学总医院医学实验中心完成。

材料：

在Hela细胞中验证miRNA-21对TLR4的调控实验所用质粒、细胞及试剂：
质粒、细胞及试剂	来源
重组腺病毒pAd/pri-miRNA-21、pAd/neg	由课题组前期构建并保存于宁夏医科大学医学实验中心
293A细胞、Hela细胞	本实验室保存
限制性内切酶	Fermentas公司
转染试剂TransLipid Transfection Reagent、15K DNA Marker	全式金公司
Triton X-114	Amresco公司
λDNA/HindIII	天根公司
兔源TLR4多克隆抗体	武汉博士德公司

实验方法：

miRNA-21和TLR4序列的生物信息学分析：应用网站预测的方法，分别利用TargetScan(URL：http://www. targetscan.org/)，PicTar(URL：http://www.pictar.com/)，和miRBase Targets(URL：http://www.mirbase.org/)3个数据库预测miRNA-21的可能靶基因，作为miRNA-21的候选靶基因。

Triton X-114液相分离法去除质粒内毒素：从含Kana抗性培养皿中挑取纯化的重组腺病毒pAd/pri-miRNA-21、pAd/neg单菌落，37 ℃震荡培养过夜进行小量扩增，碱裂解法手工提取质粒。用Triton X-114液相分离法去除质粒溶液中的内毒素^[19]，在质粒溶液中加入0.1倍体积的3 mol/L 乙酸钠(pH 5.2)，冰浴5 min, 加入0.03倍体积的Triton X-114，反复吹打混匀约30 min，50 ℃孵育10 min， 10 000 r/min离心3 min，取上层水相。重复抽提2次。加入 2倍体积无水乙醇沉淀上层水相中质粒DNA。10 000 r/min，5 min，收集沉淀，体积分数70%乙醇洗涤，室温下干燥，灭菌注射用水溶解质粒，-20 ℃保存。

线性化重组腺病毒质粒pAd/pri-miRNA-21、pAd/neg：建立100 µL Pac Ⅰ酶切体系将重组腺病毒质粒pAd/pri-miRNA-21、pAd/neg线性化37 ℃作用3.0 h后于0.8%的琼脂糖凝胶电泳，证实酶切完全后，酚氯仿抽提乙醇沉淀回收DNA。体积分数70%的乙醇，室温作用1.0-2.0 h灭菌，10 000 r/min离心收集沉淀，灭菌双蒸水溶解。核酸蛋白测定仪测定其含量与纯度。

重组腺病毒的包装：常规培养消化293A细胞，铺于 25 cm²培养瓶中。待细胞达到60%-80%时按全式金TransLipid Transfection Reagent进行转染，转染前3 h将培养液换为无血清、无抗生素的DMEM。在Eppendorf管里分别加入500 µL DMEM和25 µL TransLipid轻柔混匀，制成TransLipid稀释液，室温静置5 min。另一管里分别加入500 µL DMEM和10 µg DNA，轻柔混匀，制成DNA稀释液。将DNA稀释液和TransLipid稀释液混合，轻柔混匀，室温静置20 min，形成DNA-TransLipid 复合物。将DNA- TransLipid复合物加入到接种好的细胞中，将培养瓶轻轻地前后摇动，使复合物分散均匀。37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养5 h后，轻轻加入2.0 mL 37 ℃预热的完全培养液(或使血清浓度降到2%-6%)培养7-10 d。

重组腺病毒的收获与增殖：当转染细胞出现特征病变CPE或细胞状态不足以维持时，离心收集细胞。将细胞按0.5-1.0 mL/10 cm²培养皿的PBS重悬，液氮和37 ℃水浴中反复冻融至少4次离心分装保存上清。将融合度达60%-70%的293A细胞换成不含血清的培养基，选择可以达到较高感染效率(70%-80%)所需要最大稀释倍数，加入病毒颗粒37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养，每15 min轻微摇晃1次。1.5 h后更换含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养，3-5 d收获。可反复进行扩增数轮，以提高病毒滴度。用TCID50法分别测定重组腺病毒pAd/pri-miRNA-21、pAd/neg滴度。

重组腺病毒感染靶细胞Hela：常规培养Hela细胞，0.25%胰酶EDTA消化接种于6孔板中, 待融合度达80%左右加入病毒。由于腺病毒对Hela细胞株的感染效率很高，且考虑到病毒颗粒的细胞毒副作用，通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。分别用1，10，20，50，100 MOI的腺病毒感染细胞，24 h后在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数。

Western blotting检测TLR4蛋白的表达：收集感染48 h细胞，提取细胞全蛋白，BCA试剂盒进行定量确定蛋白浓度，8%SDS-PAGE上进行分离，半干转印至PVDF膜，经5%脱脂奶粉封闭后，加入兔源TLR4抗体(1∶100)37 ℃孵育1 h后4 ℃过夜，TBST洗膜后，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)孵育4 h，经洗膜后用ECL化学发光检测。β-Actin作为内源性参照。

主要观察指标：①miRNA-21靶基因的预测。②Triton X-114液相分离法去除质粒内毒素结果。③线性化重组腺病毒pAd/pri-miRNA-21、pAd/neg质粒结果。④重组腺病毒的包装成功检测荧光表达。⑤重组腺病毒感染靶细胞Hela结果。⑥Western blotting检测结果。

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讨论

20世纪50年代早期腺病毒被发现以来，它已被人们广泛地研究并应用。腺病毒载体能有效地将外源基因转导到各种靶细胞或组织中，可经不同途径进入不同组织，能感染分化后的非分裂期细胞，其基因不整合到宿主细胞中，且外源基因能游离地表达，因而具有广泛的组织亲和性，使得腺病毒成为表达和转导基因治疗的主要候选者。

已有大量研究表明miRNA-21在多种肿瘤组织中高表达^[20]，尤其是miRNA-21与其靶基因的研究已较深入。其中Asangani等^[21]在结直肠癌细胞株Colof206中证实miRNA-21通过调控程序性细胞死亡因子4(Programmed Cell Death 4，PDCD4)抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞的增殖^[22]。Zhu等^[23]的研究表明，在转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，miRNA-21通过抑制原肌球蛋1和PDCD4的表达以促进肿瘤细胞转移和侵袭。在胶质瘤中，Chen 等^[24]通过反义技术抑制T98G细胞系中的miRNA-21表达后，PDCD4蛋白表达水平显著增加，诱导T98G细胞凋亡。最近Schramedei等^[25]证实ANP32A、SMARCA4也受到miRNA-21的靶向调控；在Hela细胞中，PDCD4作为miRNA-21的靶标目前文献已有报道^[26]。

miRNA-21是一种真正具有肿瘤基因性质的miRNA，一些肿瘤的生长对miRNA-21有明显依赖性，至少可以认为某些肿瘤恶性程度的维持对miRNA-21有绝对依赖性。

以上研究提示，miRNA-21在肿瘤的发生发展中均发挥着重要的作用，miRNA-21能够阻止细胞的凋亡，促进肿瘤细胞的增殖并通过作用于肿瘤相关靶标基因参与肿瘤细胞的恶变。同时miRNA作用的复杂性及其表达的组织和时间特异性使得同一种miRNA可靶定不同的基因。表明miRNAs在肿瘤疾病的诊断和治疗中必然具有诱人的应用前景，故为了深入发掘miRNA-21其他的靶基因，在前期的研究中构建了可以高效转导miRNA-21基因的重组腺病毒载体，通过腺病毒感染Hela细胞，使miRNA-21在Hela细胞中高效表达，并在蛋白水平对miRNA-21与TLR4基因的靶向调控关系进行验证。由于miRNA是通过作用于多个靶基因来调控细胞相关的变化，这表明通过抑制miRNA-21的含量的可能会成为治疗疾病的—种新的手段。虽然miRNA介导的细胞信号转导网络十分复杂，目前本实验结果发现的机制可能不足以解释miRNA-21对HeLa细胞的影响，但可以帮助进一步了解HeLa细胞中miRNA-21的生物学功能和通过基因手段治疗人类宫颈癌提供可能性，以期成为肿瘤治疗的一个潜在治疗靶点。

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