自固化磷酸钙人工骨Ⅱ修复兔腱-骨损伤的生物力学变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.25.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：磷酸钙人工骨与重组人骨形态发生蛋白2在实验中均有成骨诱导作用，有修复腱骨界面损伤的可能。
目的：评估自固化磷酸钙人工骨Ⅱ(含重组人骨形态发生蛋白2)修复兔肩袖腱-骨界面损伤后的生物力学变化。
方法：取27只成年健康家兔，其中3只直接取双侧肩关节腱-骨界面标本作为正常组，余下的24只家兔双侧肩关节接受兔肩袖急性断裂腱-骨止点重建手术，术中实验组12只填塞自固化磷酸钙人工骨Ⅱ，对照组12只不填塞任何药物。分别于术后2，4，8周采集标本行生物力学测试。
结果与结论：实验组各时间点肩袖腱-骨界面最大抗拉强度均高于对照组(P < 0.001)，但低于正常组(P < 0.001)；实验组术后8周肩袖腱-骨界面刚度高于对照组(P < 0.001)，但低于正常组(P < 0.001)。表明自固化磷酸钙人工骨Ⅱ可以在术后早期提高兔腱-骨界面的最大抗拉强度和刚度，增强腱-骨界面结合力，促进腱骨界面愈合。

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 自固化磷酸钙人工骨Ⅱ, 肩袖腱-骨界面, 生物力学, 修复

Abstract:

BACKGROUND: Calcium phosphate cement and recombinant human bone morphogenetic protein-2 both have bone osteoinductivity. Maybe both of them could promote repair of tendon-to-bone interface damage.
OBJECTIVE: To evaluate the effect of calcium phosphate cement-II containing recombinant human bone morphogenetic protein-2 on tendon-to-bone interface healing after rotator cuff injury .
METHODS: Twenty-seven adult healthy rabbits were enrolled in the study. The tendon-to-bone interface of the bilateral shoulder joints was taken from three rabbits as normal group, and the bilateral shoulder joints of the other 24 rabbits were subjected to acute rupture of the rotator cuff and tendon-to-bone reconstructive surgery as experimental group (n=12) and control group (n=12). Rabbits in the experimental group were treated with calcium phosphate cement-II, while those in the control group treated with nothing. Specimens were collected at 2, 4, 8 postoperative weeks for biomechanical test.
RESULTS AND CONCLUSION: The maximum tensile strength of the rotator cuff in the experimental group was higher than that in the control group (P < 0.001), but lower than that in the normal group (P < 0.001). At postoperative 8 weeks, the rigidity of rotator cuff of the experiment group was higher than the control group (P < 0.001) but lower than the normal group (P < 0.001). These findings indicate that calcium phosphate cement-II can improve the maximum tensile strength and rigidity of rabbit tendon-to-bone interface in the early postoperative period, enhance tendon-to-bone interface binding force, and promote tendon-to-bone interface healing.

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Key words: calcium phosphates, biomechanics, bone morphogenetic proteins

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

2.1 大体观察结果术后1周拆除石膏托外固定，术后2周拆除皮肤缝合线。对照组3只、实验组2只家兔死亡，死亡原因为肩袖感染，均给予补足。术后两组兔饮食、尿便正常，创口无发热，切口愈合良好，未见伤口红肿渗液、皮肤破损裂开，术后2周未见明显跛行等。大体观察未见自固化磷酸钙人工骨Ⅱ植入导致明显异位骨化，未见瘢痕组织过度增生(图3)。

2.2 生物力学测试正常组腱-骨界面最大抗拉强度为(227.55±18.48) N，刚度为(65.73±5.09) N/mm。

术后2，4，8周实验组与对照组腱-骨界面最大抗拉强度，见表1。实验组和对照组组间总体上腱-骨界面最大抗拉强度比较差异有显著性意义(F=81.21，P < 0.001)。实验组与对照组术后3个时间点间总体比较差异有显著性意义(F=117.39，P < 0.001)。术后2周时，实验组与对照组间的腱-骨界面最大抗拉强度比较差异无显著性意义 (F=3.55，P=0.009)。实验组术后4，8的腱-骨界面最大抗拉强度均高于对照组(F=22.21，P=0.001；F=85.58，P < 0.001)。术后8周时，实验组、对照组、正常组之间的腱-骨界面最大抗拉强度比较差异有显著性意义(F=249.82， P。实验组术后2，4，8周的腱-骨界面最大抗拉强度分别是对照组的116.19%，122.05%，148.67% (表2)，实验组腱-骨界面的最大抗拉强度较对照组明显提高，提示自固化磷酸钙人工骨Ⅱ明显提高了腱-骨界面最大抗拉强度，增强了腱-骨界面的结合力，促进腱-骨界面修复。术后8周时，腱-骨界面最大抗拉强度百分比有明显恢复，实验组达到50.49%，对照组仅为33.97%，与正常组相比较，实验组较正常值仍有显著差距。 < 0.001)

术后2，4，8周实验组与对照组腱-骨界面刚度，见表3。实验组与对照组腱-骨界面刚度组间总体比较差异有显著性意义(F=31.97，P < 0.001)，实验组与对照组腱-骨界面刚度在3个时间点间总体上比较差异有显著性意义(F=37.45，P < 0.001)。术后2，4周时，实验组与对照组腱-骨界面刚度比较差异无显著性意义(F=1.84，P=0.205；F=4.65，P=0.057)。术后8周时，实验组与对照组腱-骨界面刚度比较差异有显著性意义(F=30.54，P < 0.001)。术后8周时，实验组、对照组、正常组腱-骨界面刚度比较差异有显著性意义(F=141.15，P < 0.001)。实验组术后2，4，8周时的腱-骨界面刚度分别是对照组的111.73%，115.65%，150.59%(表2)。术后8周时，实验组腱-骨界面刚度较对照组提高16.52%，提示自固化磷酸钙人工骨Ⅱ能提高了腱-骨界面刚度，增强了腱-骨界面的结合力，促进腱-骨界面修复。但术后8周时，腱-骨界面刚度实验组达50.49%，对照组仅33.97%，与正常组的刚度仍有较大差距。

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引言

肩袖损伤是临床最常见的肌肉骨骼系统疾患之一，占肩关节疾患的17%-41%，多数因为暴力损伤、过度使用退变及肩峰下撞击引起，常常导致肩关节疼痛和功能障碍^[1]。肩部的肌肉分为内外两层，在内层由冈上肌、冈下肌、小圆肌、肩胛下肌的肌腱，从前、后、外3个方向融合包绕肱骨外科颈，形成袖口样腱性复合体，称为肩袖。其中冈上肌主要功能是启动外展及外展肩关节，在上臂外展中稳定肱骨头，维持杠杆支点的作用，在肩关节外展中发挥重要作用，是肩袖中维持稳定最重要的结构。肩盂关节的关节面浅平，能向多个方向大范围活动，其稳定性主要依靠肩袖组织来维持。冈上肌腱从冈上窝转向肱骨大结节的角度最大，所承受的张力最大。肩关节外展时常受到肱骨头与喙肩弓的挤压，易于损伤^[2]。肩袖血供来源于肌腹处、腱鞘、骨血管的分支进入肌腱^[3]，其血液供应随年龄增大不断减少。冈上肌腱确实存在着血供不良区，离止点1 cm的临界区则供血最差^[4]。肩袖的腱-骨界面结构属于典型的直接止点结构，由纤维结缔组织、纤维软骨、钙化纤维软骨和骨组织构成^[5]；间接止点是腱骨结构之间形成穿透性的胶原纤维连接，即Sharpey纤维^[6]。肩袖腱-骨界面特殊排列的四层结构组织学特性不同，刚度逐渐梯度改变，使牵张应力呈梯度分布，调节腱骨结构牵张负荷，避免肌腱韧带止点应力集中导致止点撕脱。直接止点纤维软骨带是腱-骨结合部位特征性的结构，在腱-骨界面重建术后出现纤维软骨带意味着间接止点向直接止点转变。

由于肩袖骨组织结构特点，导致肩袖冈上肌更容易损伤，损伤部位多在接近肱骨大结节止点约1 cm处^[7]，并且修复困难，恢复至正常直接止点结构约6个月以上^[8]。Tien等^[9]研究髌腱修复前交叉韧带的病理学改变，约38周时才能形成直接止点的4层组织结构。在实验中前交叉韧带止点重建术后，腱骨结构修复是由间接止点结构向直接止点结构转变，生物力学性能逐步改善的过程。

现代外科技术的进步改善了腱-骨界面重建术后的愈合，但由于术后骨与肌腱力学特性的不同，出现应力集中，难以在短时间内恢复成正常的直接止点结构，影响术后功能锻炼及功能恢复。大量实验证明骨形态发生蛋白具有诱导骨及软骨生长的能力，具有潜在修复腱-骨界面形成正常止点的作用。重组人骨形态发生蛋白2 (recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)与骨形态发生蛋白2的骨诱导过程相似，但rhBMP-2的成骨作用更强^[10]。研究显示骨形态发生蛋白2及rhBMP-2均能促进腱-骨界面的愈合，达到促进功能恢复的预期目的^[11-12]。

磷酸钙是一种新型的骨组织修复和替代材料，具有骨传导性、可塑形性、生物安全性、生物组织相容性等优点。将磷酸钙作为rhBMP-2的载体，避免了rhBMP-2代谢快、诱导成骨时间短的不足，能使rhBMP-2在局部缓慢释放，持续刺激靶细胞，促进腱-骨界面修复。自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型组合简单，能综合磷酸钙及rhBMP-2各自的优势。本实验建立肩袖损伤模型，应用自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型修复兔腱-骨界面损伤，通过生物力学变化观察自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型对腱-骨界面的影响。

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材料方法

设计：对比观察动物实验。

时间及地点：于2013年10月至2014年2月在泸州医学院完成。

材料：

实验动物与分组：27只成年健康家兔，雌雄不拘，由泸州医学院实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(川)2013-17，体质量2.52-3.82 kg，平均3.18 kg。术前过量戊巴比妥钠处死3只正常家兔，取双侧肩关节腱-骨界面标本送实验室超低温冰箱保存，作为正常对照。余下的24只健康的家兔接受双侧肩关节手术，完全随机均分成实验组与对照组。

材料、试剂与仪器：抗菌微乔缝合线(美国ETHICON公司)，超低温冰箱(美国Thermo公司)，INSTRON8874生物力学测试机(美国英斯特朗公司)，自固化磷酸钙人工骨Ⅱ(每2 g 磷酸钙含2 mg rhBMP-2，上海瑞邦生物材料有限公司)。

实验方法：

实验动物模型的建立：取24只成年健康家兔，双侧肩袖行冈上肌腱离断术，并行肌腱止点重建于肱骨大结节，制作兔肩袖急性损伤腱-骨止点重建动物模型。术前肌注青霉素钠40×10⁴ U预防感染，3%戊巴比妥钠水溶液1 mL/kg兔耳缘静脉注射行全身麻醉。手术时将家兔俯卧位固定于手术台，以双侧肩关节为中心备皮消毒手术区，铺无菌单，取兔肩关节冠状位纵行切口长约3.5 cm，分离皮下软组织显露冈上肌腱在的附着点，切断冈上肌腱在肱骨大结节上的附着点，在肱骨大结节用电动钻制造一骨槽，离骨槽远端0.5-0.6 cm处用电动钻钻2个骨孔通向大结节骨。实验组在两侧骨槽中各填塞自固化磷酸钙人工骨Ⅱ 0.33 g，含rhBMP-2 0.33 mg，对照组不填塞任何药物，在腱-骨界面进行褥式缝合固定，生理盐水冲洗，逐层缝合，无菌敷料包扎。术毕双肩八字石膏托外固定。术后预防感染，常规肌肉注射青霉素钠40×10⁴U 3 d，1次/d。在石膏固定期间人工辅助饮食，术后1周双肩八字石膏托外固定拆除后，自主饮食(图1)。

取材：术后第2，4，8周，用过量戊巴比妥钠处死实验组、对照组各4只实验动物，双侧肩袖处取材后，用双层干燥塑料袋包装标记后送-80 ℃超低温冰箱保存。

主要观察指标：测试前将标本浸入生理盐水中于室温下解冻。未拆除肌腱缝合线，用义齿基托树脂固化包埋肱骨端，肌腱端以维持合适的方向。将标本固定在INSTRON8874生物力学测试机(图2)上做拉伸试验。

标本制备及测试时保持湿润，先行预处理，每个标本给予5 N的拉力，持续30 s，然后行拉断实验，拉伸速度为5 mm/min，记录最大负荷强度，生物力学测试机描绘出载荷-位移曲线计算刚度。

统计学分析：数据采用Excel进行数据录入整理，采用SPSS 16.0进行统计分析。对腱-骨界面最大抗拉强度、腱-骨界面刚度数据先行正态分布及方差齐性检验，若符合正态分布及方差齐性，资料采用x(_)±s进行统计描述，采用多因素方差分析进行统计推断，以α=0.05作为检验水准。

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讨论

在自固化磷酸钙人工骨Ⅱ对兔腱-骨损伤修复的生物力学研究中，术后8周时，实验组的最大抗拉强度达到(114.90±8.39) N，对照组仅为(77.29±5.36) N，实验组刚度恢复至(37.14±4.39) N/mm，对照组仅为(24.67± 3.36) N/mm。付国建等^[6]通过对兔肩袖腱-骨界面重建术后观察，植入以纤维蛋白胶为载体的rhBMP-2复合物，术后8周时实验组最大抗拉强度达(169.27±5.38) N，空白对照组为(88.55±6.11) N，与本实验结果基本相似。

骨形态发生蛋白是转化生长因子β超家族中的成员，最早因1965年Urist^[11]发现脱钙骨基质中含有骨诱导作用的蛋白得名，是惟一能独立诱导骨再生的生长因子。Ma等^[12]应用骨形态发生蛋白2于兔前交叉韧带重建发现，骨形态发生蛋白2促进腱-骨修复及新骨的形成均为剂量依赖性。rhBMP-2与骨形态发生蛋白2在机体内单一应用时表达生物活性强，作用明显，所需浓度低，但是其半衰期短，体内清除快，需要总量大，生物效能不能充分发挥^[13]。由于天然的骨形态发生蛋白2在动物骨骼中含量极低，其提取量一般较少，纯度不高，而提取步骤却较繁杂，难以满足应用需要。近来美国FDA也批准了rhBMP-2的临床应用，证明rhBMP-2的疗效及安全性等方面己得到了权威认可。在应用rhBMP-2治疗骨缺损骨不连的实验中，大量数据显示复合应用rhBMP-2的骨移植效果优良，甚至优于自体骨移植^[14-16]。实验表明rhBMP-2具有诱导成骨的作用，能促进骨的生长修复，减少再次植骨的次数，缩短骨缺损、骨不连临床治疗时间。
磷酸钙是一种新型的骨组织修复和替代材料，属于非陶瓷型羟基磷灰石类，具有骨传导性、可塑生物安全性、生物组织相容性等优点，但存在成骨诱导差、脆性大、降解缓慢等不足。近年来经过不断改进，出现可注射型、快速固化型、抗水溶型等磷酸钙制剂。周宁峰等^[7]对比rhBMP-2/磷酸钙及磷酸钙修复骨缺损的效果。术后随访1年余见rhBMP-2/磷酸钙填充骨缺损骨修复效果优良，并发症少，是理想的骨替代品。应用rhBMP-2/磷酸钙行兔前交叉韧带腱-骨界面重建能够促进肌腱在骨隧道内的早期愈合^[8]。磷酸钙除了用于骨的修复替代外，还可以用于腱-骨界面重建，促进纤维软骨提早出现，增加肌腱最大拔出负荷^[9-10]。

在骨缺损修复实验中已经证实rhBMP-2通过诱导分化为成软骨细胞，进一步分化为成骨细胞^[17]。在这成骨诱导的过程中可以见到与正常前交叉韧带止点区后3层结构相类似的特殊排列结构：腱-骨界面出现纤维软骨带。对比腱-骨止点结构，可见直接止点腱-骨结构具有纤维软骨带。由此可以假设具有成骨作用的磷酸钙复合rhBMP-2有可能促进正常直接止点结构的形成，即腱-骨界面纤维软骨带出现，能加速腱-骨界面重建的修复，缩短肌腱韧带止点修复术后所需要的漫长过程。

自固化磷酸钙人工骨Ⅱ的优点在于主要含有磷酸钙及rhBMP-2，磷酸钙呈海绵网孔状，孔径在300-500 μm，孔隙率约70%，形成良好的药物负载缓释支架，避免rhBMP-2单独使用时被关节腔内的滑液稀释及过快入血代谢降解，不能持续作用于靶细胞等不足。rhBMP-2附着于孔隙内，随着磷酸钙的降解和靶细胞的长入持续缓慢发生作用，在腱-骨界面周围形成较高浓度，延长rhBMP-2与靶细胞的作用时间。磷酸钙还能够填塞肌腱与骨槽间的缝隙，防止骨槽缝隙过大引起骨与肌腱接触面积过小及骨槽边缘的切割；磷酸钙具有骨传导作用，本身具有促进腱-骨修复的作用；rhBMP-2诱导成骨的作用明确，能够诱导生成软骨、骨组织，从而促进腱-骨界面的修复。

本次实验不足在于，自固化磷酸钙人工骨Ⅱ质地较脆，腱-骨界面填塞时出现破碎，rhBMP-2过早释放，如果实验中应用注射型磷酸钙复合rhBMP-2则能术中固定成形，避免rhBMP-2过早释放，对腱-骨界面填塞更充分，达到更理想的效果。

总的来说，在兔肩袖腱-骨界面重建的实验中选择应用自固化磷酸钙人工骨，结果显示自固化磷酸钙人工骨Ⅱ在肩袖腱-骨界面修复过程中有很好的促进作用，提高腱-骨界面的最大抗拉强度及刚度，促进生物力学特性的恢复。在实验中自固化磷酸钙人工骨Ⅱ能够促进腱-骨界面的修复，因此能够达到提早功能锻炼，及早恢复患肢功能和生活工作能力的目的，为临床腱-骨界面修复试验选择提供了一定的理论依据。

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