反复力竭运动大鼠心脏窦房结细胞T-型钙离子通道的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.24.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前，运动医学领域关于运动对窦房结细胞T-型钙离子通道(T-Ca²⁺通道)的影响鲜见报道。
目的：分析2周力竭跑台运动对大鼠心脏窦房结T-Ca²⁺通道亚基Cav3.1 mRNA表达及通道电流密度的影响。
方法：健康雄性SD大鼠50只共分5组。对照组10只大鼠不进行任何运动训练，一次力竭组20只大鼠在正常饲养2周后，进行一次速度25 m/min，坡度为0°跑台训练至力竭；反复力竭组20只大鼠运动方式及强度同一次力竭组，跑台训练1次/d，每周运动6 d，休息1 d，共训练2周。运动组大鼠分别于运动后0 h及 24 h (各10只)取材，应用实时荧光定量PCR技术测定T-Ca²⁺通道亚基Cav3.1 mRNA表达变化，应用细胞急性分离及全细胞膜片钳技术测定通道电流密度变化，以观察跑台训练运动对大鼠心脏窦房结细胞膜上T-Ca²⁺通道的影响。
结果与结论：与对照组相比，反复力竭运动0 h和反复力竭运动24 h组Cav3.1 mRNA表达明显下降(P < 0.01)。反复力竭运动0 h和反复力竭运动24 h组T-Ca²⁺通道ICa,T电流密度明显低于对照组及一次力竭组(P < 0.01)。结果表明，2周反复力竭跑台训练可引起窦房结细胞膜T-Ca²⁺通道亚基Cav3.1 mRNA表达及ICa,T电流密度减少，这可能引起窦房结细胞舒张期自动除极及自律活动减慢，提示反复力竭运动对于T-Ca²⁺通道的影响可能成为运动引发窦房结功能障碍及运动性心律失常的离子通道机制之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 运动医学, 跑台训练, 窦房结, T-型钙离子通道, 亚基Cav3.1

Abstract:

BACKGROUND: At present, there is little evidence about the effect of exercise on T-type calcium channel (T-Ca²⁺ channel) in sinoatrial node cells.
OBJECTIVE: To analyze the subunit Cav3.1 mRNA and current density of T-Ca²⁺ channel of sinoatrial node cells after 2 weeks of repeated exhaustive treadmill exercise in rats.
METHODS: Fifty healthy male Sprague-Dawley rats were equally assigned into five groups，including one control groups (n=10; no exercise), two exhaustive exercise groups (n=20; single treadmill running at 25 m/min, 0° slope), and two repeated exhaustive exercise groups (n=20; repeated treadmill running at 25 m/min, 0° slope, once per day, 6 days per week, for 2 weeks. The samples were drawn from 10 rats in the exercise groups at 0 and 24 hours after exhaustive treadmill running respectively. The mRNA expression of T-Ca²⁺ channel subunit Cav3.1 in sinoatrial node was analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR. The current density of T-Ca²⁺ channel was analyzed with acute isolation and whole-cell patch clamp techniques, to observe the effect of repeated treadmill exercise on T-Ca²⁺ channel.
RESULTS AND CONCLUSION: The Cav3.1 mRNA expression of the repeated exhaustive exercise groups at 0 and 24 hours were significantly lower than that of control group (P < 0.01). The current density of T-Ca²⁺ channel of the repeated exhaustive exercise groups at 0 and 24 hours were significantly lower than that of control group and single exhaustive exercise group (P < 0.01, P < 0.01). Two-week repeated exhaustive treadmill exercise can decrease the subunit Cav3.1 mRNA expression and the current density of T-Ca²⁺ channel in the sinoatrial node cells. The exhaustive exercise induced diastolic automatic depolarization and slowed down spontaneous activity of sinoatrial node cells, which may be one of the most important mechanism of exercise-induced sinoatrial node dysfunction and arrhythmia.

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Key words: sinoatrial node, calcium channel, sports medicine

中图分类号:

R318

薄冰. 反复力竭运动大鼠心脏窦房结细胞T-型钙离子通道的变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(24): 3829-3834.

Bo Bing . T-type calcium channel in sinoatrial node cells of rats after repeated exhaustive exercise[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(24): 3829-3834.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠50只，分为5组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 各组大鼠窦房结T-Ca²⁺通道亚基mRNA表达 对照组，一次力竭0 h，一次力竭24 h，反复力竭0 h，反复力竭24 h大鼠窦房结T-Ca²⁺通道亚基Cav3.1 mRNA相对表达量(2^-△△Ct)分别为1.22±0.16，0.89±0.12，0.93±0.08，0.36±0.04，0.42±0.02。与对照组相比，一次力竭运动各组无明显差异；2周跑台训练反复力竭组0 h、反复力竭组24 h组Cav3.1 mRNA相对表达量下降，差异有显著性意义(P < 0.01，P < 0.01)，两组间差异无显著性意义。与一次力竭0 h组比较，2周跑台训练反复力竭组0 h、反复力竭 24 h组Cav3.1 mRNA相对表达量下降(P < 0.05，P < 0.05)，两组间无明显差异。表明一次力竭运动对于Cav3.1 mRNA相对表达量无明显影响；反复跑台训练可引起Cav3.1 mRNA相对表达量下降(图2)。2.3 各组大鼠窦房结T-Ca²⁺通道电流密度选取大鼠单个窦房结细胞为研究对象在电极外液中加入0.3 mmol/L CdCl₂以阻断I_Ca,L，1 mmol/L BaCl₂以阻断I_K1通道，当形成全细胞封接后，给予细胞保持电位-40 mV，以10 mV步阶，-40 mV-+40 mV、500 ms的阶梯刺激方波，记录I_Ca,T电流(图3)，此电流可以被4 μmol/L Nifedipine阻断。实验结果测定-90 mV-+70 mV各条件电压下I_Ca,T稳态电流值与钳制电位-40 mV时的差值作为I_Ca,L电流值，并与其膜电容比值作为其标准化电流密度。与对照组相比，一次跑台训练组一次力竭0 h、一次力竭24 h组电流密度无明显变化，2周跑台训练反复力竭0 h组电流密度为-(6.59±0.52) pA/pF，较对照组及一次力竭2组下降，且差异有显著性意义(P < 0.01)，反复力竭24 h组电流密度为-(7.01±0.36) pA/pF显著低于对照组及一次力竭0 h组(P < 0.01，P < 0.01，表2)。可见，一次力竭跑台训练并未对大鼠窦房结I_Ca,T电流产生明显影响，而反复力竭运动则可显著降低大鼠窦房结 I电流密度，这一变化可能导致窦房结细胞去极化初始阶段的Ca²⁺内流减少，从而减慢动作电位的上升速率，进而可能成为介导运动引起窦房结自律活动减慢的原因之一。_Ca,T

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引言

窦房结功能的正常是心脏规律电学活动的基础，其中窦房结细胞以舒张期缓慢自动除极为特征，这是窦房结细胞形成自发起搏活动的电学基础，同时也是建立在起搏细胞膜上多种离子通道共同活动的基础之上^[1]。

1988年，Hagiwara等^[2]在兔窦房结细胞中观察到T-型钙离子通道的存在，在参与起搏活动产生及调节的多种机制中，T-型钙离子(T-Ca²⁺通道)在多种病理生理条件下发挥着重要作用^[3]，该通道功能活动的减弱可引起窦房结细胞舒张期去极化斜率下降，起搏活动减慢，进而导致窦房结功能障碍^[4]。

研究发现，编码T-Ca²⁺通道亚基的3种基因为Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3，其中Cav3.1亚型是构成心脏窦房结T-Ca²⁺通道的主要部分^[4]。Mangoni等^[4]通过对Cav3.1亚基的选择性灭活来研究T-Ca²⁺通道在窦房结自律性中的作用，发现Cav3.1基因敲除(Cav3.1^-/-)小鼠的窦房结起搏细胞中缺少I_Ca,T，而Cav3.1通道的失活可导致心动过缓和房室结传导阻滞出现。体外实验中，Cav3.1^-/-小鼠窦房结细胞起搏活动速率下降37%，舒张期自动去极化斜率下降44%以及窦房结恢复时间延长^[4]，可见，Cav3.1基因表达的下降可引起窦房结电生理及功能活动的异常。

目前，运动医学领域关于运动对窦房结细胞T-Ca²⁺通道的影响鲜见报道，因此，文章即以T-Ca²⁺通道亚基Cav3.1 mRNA表达及通道电流密度为切入点，应用实时荧光定量PCR、细胞急性分离及全细胞膜片钳技术，观察跑台训练对大鼠窦房结细胞膜上T-Ca²⁺通道的影响，为进一步探讨运动性窦房结功能障碍及运动性心律失常提供实验依据。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实时荧光定量PCR检测部分于2013年11月在河南大学体育学院完成；大鼠电生理部分于2014年1月在郑州大学基础医学院完成。

材料：8周龄健康雄性SD大鼠60只，体质量(180±8) g，由河南省实验动物中心提供。动物常规分笼饲养，5只/笼，国家标准啮齿动物饲料喂养(饲料购自河南省实验动物中心)，自由饮食。饲养环境为室温(18±2)℃，光照时间12 h，相对湿度为40%-50%。

实验方法：

实验分组：大鼠首先进行3 d适应性跑台训练，速度 10 m/min，时间20 min，跑台坡度为0°。适应性训练结束后，筛选出无法完成跑台训练的大鼠，将剩余大鼠随机分为5组，每组10只，包括对照组1组、一次力竭组2组、2周反复力竭组2组。

对照组大鼠不进行任何运动训练，一次力竭组大鼠在正常饲养2周后，进行一次速度25 m/min，坡度为0°跑台训练至力竭；反复力竭组运动方式及强度同一次力竭组，跑台训练1次/d，运动6 d/周，休息1 d，共训练2周。运动组大鼠分别于运动后0 h及24 h两个时相取材，观察运动结束后大鼠窦房结细胞膜上T-Ca²⁺通道亚基mRNA表达及电流密度变化与时间的关系^[5]。

大鼠运动力竭的表现：在运动过程中，每次刺激(声音或电刺激)1.0-2.0 s以上，刺激频率在4次/min以上，不能维持原强度工作，当降低运动强度或短时间休息后(一般为10 min以内，多为5 min)大鼠仍不能恢复运动能力为力竭。大鼠表现为表情冷漠，反应迟钝，卧位跑，腹部与跑道面接触，将大鼠从跑台内取出时，大鼠基本无逃避反应。

实时荧光定量PCR检测：

大鼠心脏窦房结组织取材：使用体积分数10%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉，待大鼠结膜反射、翻正反射消失后，仰卧固定，体积分数75%的乙醇消毒胸腹部皮肤。打开胸腔后，游离出上腔静脉，沿离心方向约0.5 cm处剪断；沿着界沟行切口打开右心房进入腔静脉，由靠近并平行于界嵴的腔静脉区域分离出一条形组织，其中含有主要起搏细胞^[6-7]。

大鼠心脏窦房结总RNA提取：采用TRIzol法提取心脏窦房结总RNA。将收集管中的细胞或细胞团转移到含有 1 mL TRIzolReagent的EP管中，颠倒混匀，室温静置 5-10 min，加入200 μL氯仿，手动剧烈震荡混匀15 s，室温静置2.0-3.0 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，转上层水相(500-600 μL)于另一新1.5 mL EP管中，加等体积异丙醇(500-600 μL)，混匀，室温放置30 min。弃上清，加DEPC水溶液熔解，-80 ℃保存。

反转录RNA合成为cDNA：根据样品数量按下列反应体系配制反应混合液，引物Oligo(dT)，10 μmol/L(2 μL)、 10 mmol/L dNTP mix(4 μL)、H₂O(24 μL)共30 μL。将混合液分装到0.2 mL PCR管中，分别加入2 μL RNA(2 μg左右)，70 ℃变性5 min，冰上速冷2 min，离心将溶液收集至管底。按顺序根据下列反应体系配置混合反应液：5×PCR buffer (10 μL)、DTT (6 μL)、M-MLV RT(酶)(M-MLV-Promega) (2 μL)，共18 μL。将上述混合物分装到上述0.2 mL PCR管中，共计50 μL体系。42 ℃延伸50 min，95 ℃保温5 min终止反应。cDNA保存于-20 ℃备用。

引物设计及合成：通过互联网搜索Genbank查找基因序列，应用Primer5软件进行引物设计, 将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其特异性，所有引物扩增目的基因片断长度均小于150 bp。设计的引物由Invitrigin公司合成(表1)。

SYBR GREEN荧光定量PCR：将cDNA和引物解冻，取定量PCR用的96孔板，按如下成分加入：RealqPCR Master Mix(12 μL)、引物F/R(上下游引物终浓度均为 10 μmol/L)(0.5/0.5 μL)、H₂O(11 μL)。最后加入相对应的cDNA(1 μL)，共25 μL，封膜。打开ABI7900HT定量PCR仪，进行实时荧光定量PCR实验，反应条件如下：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min(生成扩增曲线)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s(生成熔解曲线)，上述反应共40个循环^[8-9]。

mRNA 结果分析：观察熔解曲线，判断PCR特异性；以2^-^△△^Ct作为计算公式，分析各组间mRNA的表达差异，每个反应重复3次。

大鼠窦房结细胞膜T-Ca²⁺通道电流密度测定：

大鼠窦房结细胞急性分离：参考既往文献^[10-11]，将分离后的心脏行主动脉逆行插管，固定后悬挂于Langendorff灌流装置上以普通Tyrode液灌流3-5 min，灌流速度 7 mL/min，静水压6.86 kPa，温度37 ℃。待心腔内残血全部流出后，将普通Tyrode液换成无Ca²⁺-Tyrode液以消除自发节律。心脏由灌流装置取下，在无Ca²⁺-Tyrode液中沿着界沟行切口打开右心房进入腔静脉，由靠近并平行于界嵴的腔静脉区域分离出一条形组织，其中含有主要起搏细胞(图1)。分离的窦房结组织置于2 mL离心管中，管中充满2 mL含有0.85 g/L Collagenase Ⅱ、0.4 g/L Elastase type Ⅱ-A和13.5 mL/L Protease(10 g/L)的无Ca²⁺-Tyrode液，并置于37 ℃水浴20-23 min。最后，条形组织转移至含有KB液的培养皿中，KB液更新3次以去除酶液。用尖端直径 2 mm的玻璃吸管轻柔吹打KB液7-9 min，使用200目微孔不锈钢滤网过滤去除结缔组织和未消化细胞，滤液于室温下静置30 min以备用。实验环境温度在18-28 ℃之间，实验中所有灌流液均用医用纯氧饱和并在灌流过程中持续通氧^[8-9]。

全细胞膜片钳记录大鼠窦房结T-Ca²⁺通道电流密度：取出完成贴壁的窦房结细胞培养皿，置于倒置显微镜下，用氧饱和的电极外液灌流，灌流速度约1 mL/min，冲去死亡细胞碎片。选取处于静息状态下的表面光滑、横纹清晰、折光好、立体感强的单个窦房结细胞为研究对象，具体操作步骤参照既往文献^[8-9]。全细胞膜片钳实验结果以通道电流密度数值表示，电流密度为电流强度与膜电容的比值(pA/pF)，其中电流强度为实验所测量电流峰值，膜电容为实验中记录到的单个细胞电容值。

主要观察指标：①各组大鼠窦房结T-Ca²⁺通道亚基mRNA表达。②各组大鼠窦房结T-Ca²⁺通道电流密度。

统计学分析：实验结果以x(_)±s表示，数据采用SPSS 13.0软件及EXCEL软件中单因素方差分析，各实验组与对照组之间的显著性差异采用SNK法，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

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讨论

T-型钙离子通道作为仅有的低电压激活通道，与L-型钙离子通道相比，具有电导较小、开放时间短、激活电压较低及失活快等特点，在窦房结细胞自动去极化过程中引导内向Ca²⁺电流，是起搏电流形成的重要组成部分。本研究通过建立2周跑台训练模型探讨运动对大鼠窦房结T-Ca²⁺通道亚基Cav3.1 mRNA表达及通道I_Ca,T电流密度的影响，结果表明，2周力竭运动可引起窦房结细胞膜Cav3.1 mRNA表达及 I电流密度减少，可见，长期大强度运动对窦房结细胞T-Ca²⁺通道结构组成及功能表现均产生明显的影响。实验发现，一次力竭跑台训练可导致窦房结细胞Cav3.1 mRNA相对表达量下降，但与对照组相比，并无明显差异；反复力竭训练则能够明显降低大鼠窦房结细胞Cav3.1 mRNA表达，明显低于对照组(P < 0.01)，随着取材时间的延长，Cav3.1 mRNA表达下降，但在24 h内仍明显低于对照组及一次力竭各组，这一结果提示反复大强度运动对T-Ca²⁺通道的主要组成部分Cav3.1影响显著，这可能会引起T-Ca²⁺通道电流I_Ca,T的改变，而在电生理学实验中对于I_Ca,T电流密度的测量也验证了这一推测，对照组I_Ca,T电流密度为-(12.41±0.37) pA/pF，一次力竭跑台训练组I_Ca,T电流密度无明显变化，反复力竭0 h组电流密度较对照组减少约46%(P < 0.01)，24 h取材组减少43.5%(P < 0.01)，可见，Cav3.1 mRNA表达与I_Ca,T电流的变化具有相似的趋势。

上述由反复力竭运动诱导T-Ca²⁺通道出现的变化可能对运动过程中窦房结功能活动产生影响。既往研究认为运动员出现心动过缓是由于运动训练引起迷走神经张力增高所致，然而，Katona等^[12]的研究发现，运动员的正常心率比非运动员减慢约10次/min，而固有心率减慢约20次/min。Stein等^[13]发现，分别应用阿托品和普萘洛尔阻断自主神经系统后，与正常非运动员个体相比，现役运动员(n=6)的窦房结周期，窦房结恢复时间，最大SNRT/SCL(sinus node recovery time, SNRT；sinus cycle length, SCL)均延长，这提示耐力训练可能引起窦房结固有结构和功能的改变，包括窦房结固有起搏活动的减少及固有心率的下降^[14]。

Mangoni等^[4]阻断Cav3.1^-/-小鼠的自主神经系统后，在心电图测量中观察到RR间期及PQ间期的延长，固有心率下降约10%。这提示长期大强度运动训练对于窦房结起搏活动中离子通道的影响可能是运动性窦房结功能障碍的重要因素之一。此外，根据Lipsius等^[15]的研究，局部存在一个Ca²⁺释放控制系统包括T-Ca²⁺通道，肌质网(sarcoplasmic reticulum, SR)的RyRs以及Na⁺/Ca²⁺交换体(Na⁺/Ca²⁺ exchanger, NCX)，T-Ca²⁺通道可能与起搏细胞内Ca²⁺信号耦联^[16]。

Huser等^[17]在猫潜在起搏细胞的自律性活动中记录到细胞内Ca²⁺释放，并发现Ni²⁺只对舒张期去极化阶段Ca²⁺释放(舒张性Ca²⁺)具有影响，40 μmol/L Ni²⁺可减少SR和舒张期去极化晚期的Ca²⁺释放。潜在起搏细胞中，舒张期去极化中I_Ca,T的激活触发局部Ca²⁺释放，通过刺激I_NCX产生内向电流以引导细胞的自动去极化过程，而I_Ca,T电流密度的下降可能会影响T-Ca²⁺通道和SR间的功能性耦联，导致细胞内Ca²⁺释放的异常，进而影响窦房结细胞起搏活动。

然而，在本实验中I_Ca,T的减少所引发的细胞内SRCa²⁺释放及膜INCX的功能活动的改变还需要在运动模型中进一步研究。因此，窦房结细胞Cav3.1通道介导I_Ca,T电流密度的减少可能导致窦房结细胞去极化初始阶段的Ca²⁺内流减少，舒张期去极化斜率下降，动作电位的上升速率及起搏活动频率降低，从而成为介导运动引起窦房结自律活动减慢的原因之一。

分析反复大强度运动引起Cav3.1 mRNA表达与T-Ca²⁺电流密度下降的原因，可能与力竭运动对运动心脏在神经体液因素调节下，结构、功能及代谢诸方面的心脏重塑有关。相关组织学研究发现，一次力竭运动即可造成窦房结内的P细胞和T细胞发生损伤性改变，1周反复力竭运动则可引起起搏细胞间连接混乱、窦房结细胞凋亡等超微结构改变^[18]，上述细胞的缺血缺氧性改变有可能导致Cav3.1 mRNA表达与I_Ca,L电流密度下降，引发窦房结自律活动减少并导致窦性停搏^[19]、异位起搏点出现等恶性心律失常的发生^[20-22]，以及心输出量减少所导致的心、脑、肾等器官无法满足机体运动过程中需求这类猝死危险因素的增加^[23-24]。这提示，长时间高强度运动训练导致细胞膜T-Ca²⁺通道的活动的减弱可能成为窦房结自律活动减慢和窦性停搏的原因之一。同时，对于运动状态下窦房结T-Ca²⁺通道的探讨将有助于临床心脏起搏功能异常的研究，并为窦房结功能障碍提供细胞药理学靶点治疗的实验依据^[25]。

结论：反复力竭运动可引起窦房结细胞膜T-Ca²⁺通道亚基Cav3.1 mRNA表达及I_Ca,T电流密度下降，这可能引起窦房结细胞舒张期自动除极及自律活动减慢，提示反复力竭运动对于T-Ca²⁺通道的影响可能成为运动引发窦房结功能障碍及运动性心律失常的离子通道机制之一。

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