碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人牙周膜细胞的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：碱性成纤维细胞生长因子是具有多功能的细胞生长因子，对来源于中胚层及神经外胚层的细胞有明显的促进增殖作用。
目的：观察碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人牙周膜细胞的作用。
方法：将第5代人牙周膜细胞，以1×108 L-1的浓度分别接种到96孔板，随机分成4组，分别加入含0，1，10，100 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基进行培养。在第1，3，5，7天测定细胞的增殖情况，在第1，7天检测碱性磷酸酶活性。
结果与结论：4组之间人牙周膜细胞增殖情况的差异有显著性意义(F=6.586，P=0.024)，随着碱性成纤维细胞生长因子质量浓度的增大，吸光度值均增大，其中100 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组的吸光度值均大于其他组(P < 0.05)；碱性成纤维细胞生长因子各组的碱性磷酸酶活性均低于对照组(P=0.000)，浓度越大，活性越低(P < 0.05)。结果显示碱性成纤维细胞生长因子在1-100 μg/L范围内质量浓度越高，促进人牙周膜细胞增殖和抑制碱性磷酸酶活性的作用越强。

关键词: 组织构建, 组织工程, 口腔组织构建, 体外培养, 人牙周膜细胞, 碱性成纤维细胞生长因子

Abstract:

BACKGROUND: Basic fibroblast growth factor is a pluripotent cytokine that can promote the proliferation of mesodermal and neuroectodermal cells.
OBJECTIVE: To observe the effect of basic fibroblast growth factor in human periodontal ligament cells cultured in vitro.
METHODS: Human periodontal ligament cells at passage 5 were inoculated into the 96-well plates at the density of 1×108/L, and were randomly divided into four groups. The cells were cultured in α-MEM containing 15% fetal bovine serum and 0, 1, 10, 100 μg/L basic fibroblast growth factor, respectively. At 1, 3, 5, 7 days of the culture, the cell proliferation was determined, and the activity of alkaline phosphates was detected at 1 and 7 days.
RESULTS AND CONCLUSION: There were significant differences in the proliferation of human periodontal ligament cells among the four groups (F=6.586, P=0.024). As the increase of the basic fibroblast growth factor concentrations, the absorbance value was gradually increased and reached the peak in 100 μg/L basic fibroblast growth factor group (P < 0.05). The alkaline phosphatase activity in basic fibroblast growth factor groups was lower than that of the control group (P=0.000), the higher the concentration was, the lower activity was (P < 0.05). Results show that basic fibroblast growth factor can promote the proliferation of human periodontal ligament cells and inhibit the activity of alkaline phosphatase, and the effect is concentration-dependent.

Key words: periodontal ligament, cells, fibroblast growth factor 2, cell proliferation

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

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引言

牙周炎的患病率和严重性随年龄增高而增加，35岁以后的患病率明显升高，50-60岁达高峰，此后患病率有所下降，这可能是因为一部分牙周破坏的牙已被拔除。失牙是未经治疗牙周炎的最终结果^[1-5]。现在通常认为牙周炎占拔牙原因的30%-44%，是中国成年人丧失牙齿的首要原因。牙周炎主要表现为牙周骨、牙周膜的渐进性萎缩，并最终可导致牙齿的松动和脱落，最好的治疗就是使退缩的牙周组织能够再生^[6-11]。牙周膜细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)是牙周膜中最常见的细胞，主要来源于因正畸或阻生拔除的健康牙培养而成，能在牙周不断形成新的主纤维、牙骨质，并改建牙槽骨，对牙周组织的修复十分重要，是牙周治疗后形成牙龈与牙根面新附着的主要细胞来源^[12-17]。牙周膜细胞在牙周新附着的形成以及再生方面起着主要的作用。故如何进一步提高细胞的增殖，为牙周组织工程提供大量的种子细胞成为迫切需要解决的问题。生长因子作为活性蛋白质或者多肽类物质，对生物体的生长、发育等具有调节作用，并且控制着组织的修复过程等多种细胞活动^[18-25]。

碱性成纤维细胞生长因子作为肝素黏合多肽，具有促进细胞增殖和分化的作用。碱性成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子蛋白家族中的一员，碱性成纤维细胞生长因子广泛存在于人体各种组织中具有多种生物学作用^[26-31]，包括促进细胞的有丝分裂、细胞的增殖及分化等，碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层及神经外胚层的细胞有明显的促进增殖作用。故将其应用于人牙周膜细胞的培养，以提高细胞的增殖速率，本研究拟在体外培养的人牙周膜中加入不同质量浓度的碱性成纤维细胞生长因子，以观察其对人牙周膜细胞的作用。

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2011年6月至2012年8月在天津医科大学第一中心临床学院实验室完成。

材料：

牙周膜细胞培养及生物学特性检测所需试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
胎牛血清	杭州四季青生物工程材料有限公司
α-MEM培养基	美国Gibco公司
磷酸盐缓冲液、碱性磷酸酶检测试剂盒	美国Sigma公司
碱性成纤维细胞生长因子	英国Cytolab公司
紫外线分光光度计	德国
胰蛋白酶	美国Sigma公司

实验方法：

体外牙周膜细胞的培养：获得实验对象的知情同意后，收集因正畸拔出的无病理情况的前磨牙或者是第三颗磨牙，立刻放入含有青霉素和链霉素预冷的Hank’s液中，在无菌的情况下刮取牙根中的1/3牙周膜组织，将组织切成块后制成1 mm×1 mm×1 mm的小块，然后平铺在25 mL的培养瓶中，随后加入含有6 mL的α-MEM培养基，培养基中含有体积分数为20%的胎牛血清、100 U/mL青霉素。培养在37 ℃、含体积分数为5%CO₂的培养箱中，直到细胞在组织块边缘地方出现。在细胞生长融合至80%时，用0.25%的胰蛋白酶室温下消化30 min并进行传代培养。用ABC法染色鉴定，细胞表现为抗波形丝蛋白阳性，抗角蛋白阴性，证明所培养的细胞是来源于中胚层的成纤维细胞。最后确定已生长为成纤维细胞时取第5代细胞做实验。

分组：将第5代细胞用0.25%的胰酶消化，以1×10⁸ L^-¹的浓度分别接种到96孔板，每孔均接种100 μL。培养1 d后，弃用原有的培养液，并将96个孔随机分成4组，分别加入1，10，100 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子，对照组仅加入含体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基进行培养。第1，3，5，7天测定细胞的增殖情况，第1，7天检测碱性磷酸酶活性。

细胞增殖的测定：运用MTT比色法测定细胞的增殖情况，方法为：①将细胞置于96孔板中，每孔均加MTT (5 g/L)20 μL，放于培养箱中培养6 h。②弃去培养液后加入二甲基亚砜0.6 mL，摇匀后用波长设定为490 nm的酶标仪测定吸光度值。

碱性磷酸酶活性的检测：用分光光度计法测定，方法为：①分别用0.01 mol/L的PBS洗涤各组细胞，吸干后在每孔加入50 μL 0.2%的聚乙二醇辛基苯基醚裂解液裂解。②待细胞形态完全不见后，在以p-硝基酚磷酸盐为底物的条件下，用碱性磷酸酶试剂盒检测各组细胞的碱性磷酸酶活性。

主要观察指标：①牙周膜细胞形态。②牙周膜细胞增殖活性。③牙周膜细胞中碱性磷酸酶活性。

统计学分析：将所有数据经SPSS 17.0统计软件录入并进行统计分析。计量资料的描述采用x(_)±s表示，分析采用t 检验和重复测量的方差分析。P < 0.05表示差异有显著性意义，P > 0.05表示差异无显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

牙周炎是牙齿支持组织的慢性炎症性疾病，主要表现为牙周局部软组织的破坏和骨组织的吸收，最后造成牙齿脱落，是严重危害人类健康的常见病和高发病。其中牙槽骨吸收是牙周炎的主要特征之一，是导致非龋齿性牙列缺损的第一大原因，如果治疗不及时将会引起牙齿的脱落，它是对人类牙齿和全身健康都会造成极大危害的一种常见

口腔疾病，其主要病理改变在于牙周袋的形成和牙槽骨的吸收。牙槽骨的代谢在正常情况下是通过成骨细胞、破骨细胞的平衡来保证的。目前临床上还没有研制出阻断牙槽骨吸收，以及促进牙槽骨再生的药物^[32-40]。

牙周炎是累及4种牙周支持组织(牙龈、牙周膜、牙骨质和牙槽骨)的慢性感染性疾病，通常会引发牙周支持组织炎性破坏。牙周炎的患病率和严重性随年龄增加而升高，35岁以后患病率显著增高，50-60岁时达高峰，此后患病率有所下降，这可能是由于一部分牙周破坏的牙已被拔除。失牙是未经治疗的牙周炎的最终结果。现在通常认为牙周炎占拔牙原因的30%-44%，是中国成年人丧失牙齿的首要原因。临床中发现最易受累的牙位是下颌切牙和上颌磨牙。

组织工程学的研究内容主要包括以下3个方面：种子细胞、生物支架材料及构建组织工程化组织并移植替代病损的组织。在此过程中，种子细胞起着最为重要的作用，理想的种子细胞应具有来源丰富，取材方便，对机体的影响小，不会对机体造成新的组织缺损和功能障碍，增殖能力强，移植后能恢复或替代原有损伤组织的结构及功能。牙周组织工程是组织工程学一个学科分支，是利用组织工程的原理与技术来促进牙周组织细胞的增殖与分化，进一步形成新的牙周膜、牙骨质及牙槽骨等，从而达到修复和再生牙周支持组织的目的。

牙周膜细胞是一组具有多向分化潜能优势的异质性多能干细胞^[2]，是牙周膜中最常见的细胞，不断形成新的主纤维、牙骨质，并改建牙槽骨，对牙周组织的修复十分重要，是牙周治疗后形成牙龈与牙根面新附着的主要细胞来源。它主要包括成纤维细胞、成牙骨质细胞、成骨细胞以及破骨细胞等。研究显示，它可以分化为成纤维细胞以及成牙骨质细胞，从而形成牙周膜牙骨质和牙槽骨，可以通过合成和分泌蛋白，促进牙周组织的形成^[35-42]。在牙周组织的构成中，牙周膜细胞是最主要的细胞，是牙周组织再生的基础，是形成牙周新附着的主要来源^[43-44]。大量研究显示，作为活性蛋白质或者是多肽类物质的生长因子，其广泛参与生物体的生长和发育过程，并且在组织修复过程中控制关键细胞的作用，如血管再生，新生上皮的形成等，而且还可以促进牙周组织的再生、牙周新附着的形成等。有研究表明，生长因子的合理利用是促进牙周膜细胞再生的重要因素^[45]。碱性成纤维细胞生长因子作为生长因子之一，大量研究表明其作为促进细胞有丝分裂原在细胞的分裂和增殖过程中有重要作用，因此研究中常用作促进细胞分化的有效的因子。张进等^[46]结果表明不同浓度碱性成纤维细胞生长因子均可提高人牙髓细胞的黏附性和伸展性， 0.1-100 μg/L碱性成纤维细胞生长因子与人牙髓细胞共同培养一定时间后，均能显著抑制其碱性磷酸酶活性 (P < 0.05)；并且浓度越高，抑制作用出现的时间越早。张戎等^[47]研究结果表明碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子均可呈时间依赖性促进人牙周膜干细胞增殖，二者联合应用有一定协同作用；碱性成纤维细胞生长因子促人牙周膜干细胞黏附能力较血管内皮生长因子强；血管内皮生长因子可促进细胞向创伤部位迁移。李立恒等^[48]体外培养人牙周韧带细胞，经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染，分为3组：对照组、空载病毒组、碱性成纤维细胞生长因子转染组。结果可见对照组、空载病毒组未检测到碱性成纤维细胞生长因子mRNA和蛋白表达；碱性成纤维细胞生长因子转染组碱性成纤维细胞生长因子mRNA和蛋白水平均有表达，细胞的生长速度明显增快，细胞周期G₀/G₁期减少，S期细胞数增多，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。韦永珍等^[49]以常规组织块培养法体外获得人牙髓细胞，实验组分别加入终浓度为1.0，5.0，10.0和50.0 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子，对照组仅加入等量的空白培养基，采用CCK-8法分别测定450 nm下各组光吸收度值，研究碱性成纤维细胞生长因子对牙髓细胞增殖活性的影响；应用Transwell小室培养法，研究碱性成纤维细胞生长因子对牙髓细胞迁移活性的影响。结果显示，与对照组相比，碱性成纤维细胞生长因子在1.0-50.0 μg/L浓度下可促进牙髓细胞的增殖 (P < 0.05)，碱性成纤维细胞生长因子最低显效浓度为 1.0 μg/L，最佳显效浓度为10.0 μg/L，碱性成纤维细胞生长因子在1.0-50.0 μg/L浓度下诱导细胞迁移(P < 0.05)。可见碱性成纤维细胞生长因子可诱导体外培养人牙髓细胞的增殖和迁移，在牙髓牙本质复合体修复中可能发挥重要作用。陈欣戬等^[50]切取Beagle犬左上颌第2，3，4前磨牙的游离龈，无菌磷酸盐缓冲液冲洗4遍，将组织块剪碎后用 2.5 g/L的胰酶37 ℃消化2 h，离心后弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM，接种于6孔板并覆盖玻片，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱培养，取对数生长期细胞消化传代。利用脂质体介导法将pIRES2- EGFP-bFGF质粒转染Beagle犬牙龈成纤维细胞，以空质粒转染组及未转染组作为对照。MTT检测结果显示，转染后随着时间改变，与空质粒转染组及未转染组相比，实验组牙龈成纤维细胞的增殖能力明显增强(P < 0.05)，而空质粒转染组及未转染组差异无显著性意义(P > 0.05)。AO/EB双染色结果显示，实验组牙龈成纤维细胞凋亡率低于空质粒转染组及未转染组(P < 0.05)。转染碱性成纤维细胞生长因子基因后，牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶活性未见明显改变，与未转染细胞差异无显著性意义。结果可见碱性成纤维细胞生长因子基因转染可以加速牙龈成纤维细胞的增殖，抑制其凋亡，无促使牙龈成纤维细胞骨向分化的作用。余杰等^[51]取第5代人牙周膜成纤维细胞接种在壳聚糖/磷酸三钙支架材料表面，碱性成纤维细胞生长因子实验组加入含有浓度分别为1，10和100 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子培养液，对照组在普通培养基中培养。结果显示，与对照组相比，各浓度碱性成纤维细胞生长因子实验组培养24 h后均可促进人牙周膜成纤维细胞在壳聚糖/磷酸三钙支架材料上的附着，差异有显著性意义(P < 0.05)，其中10 μg/L为最有效浓度。同时培养72 h后各浓度碱性成纤维细胞生长因子组均能促进人牙周膜成纤维细胞在壳聚糖/磷酸三钙支架材料上的增殖，差异具有显著性意义(P < 0.05)。表明人牙周膜成纤维细胞在壳聚糖/磷酸三钙支架材料上的附着和增殖可被碱性成纤维细胞生长因子所增强。

碱性成纤维细胞生长因子在体内广泛分布，如在垂体、胸腺、下丘脑、视网膜、黄体、肾上腺、心、肝、肾、胎盘及多种肿瘤组织中均有分布，在多种细胞(如：成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞等)的增殖、迁移、分化及生存中起到重要的支持作用，不仅是调控增殖及定向分化的首选生长因子之一，并且是一种重要的营养因子，能刺激新生血管的形成及多种神经细胞存活并抑制凋亡，参与创伤愈合、组织再生、骨骼形成、促进胚胎组织发育、分化以及神经营养等。本研究是在体外培养人牙周膜细胞时加入碱性成纤维细胞生长因子，以观察其在体外培养牙周膜细胞中的作用。结果显示，不同浓度碱性成纤维细胞生长因子与时间之间无交互作用(F=1.382，P=0.271)，4组细胞增殖情况之间的比较，差异有显著性意义(F=6.586，P=0.024)，两两比较后得出，随着碱性成纤维细胞生长因子浓度的不断增大，吸光度值均增大，且在第5天时达到最大，到第7天的时候各组均稍有下降，其中100 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组各个时间点的吸光度值均大于其他组各时间点的吸光度值(P < 0.05)。这些结果提示，碱性成纤维细胞生长因子可以维持牙周膜细胞成纤维表型的稳定，抑制其向成骨细胞的分化，并且可以促进人牙周膜细胞的增殖分化。这与有关研究结果相同^[8]。另外本研究还得到，体外培养人牙周膜细胞7 d后，碱性成纤维细胞生长因子各组的碱性磷酸酶活性与对照组比较，差异均有显著性意义，实验组碱性磷酸酶活性均低于对照组(P=0.000)，碱性成纤维细胞生长因子各组碱性磷酸酶活性比较，100 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组均低于1，10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组，10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组低于1 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组(P < 0.05)。提示碱性成纤维细胞生长因子可能减弱碱性磷酸酶活性，且浓度越高，碱性磷酸酶活性越低。这与有些研究结果也一致^[9]。

综上所述，碱性成纤维细胞生长因子能够促进体外培养的牙周膜细胞的增殖分化，并且能够降低碱性磷酸酶的活性，在临床上有重要参考价值。